Name: investigating mammalian axon regeneration: in vivo electroporation of adult mouse dorsal root ganglion
Uploaded: 2018-09-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion at JoVE.com

Studien ble finansiert (tildelt F-Q. Z.) ved NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), Craig H. Neilsen grunnlaget og BrightFocus Foundation.

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med dyr protokollen godkjent av Johns Hopkins institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.
1. materialer og reagenser
<ol><li>
Dyr
	<ol>
<li>Bruk seks-uke-gamle kvinnelige CF1 mus veier 30-35 g for eksperimenter. Merk: Mus var gruppen plassert (5 mus per bur) i individuelt ventilert sterilisert bur med 1/4" korn cob senger og 2" firkant nestlets for nesting. Merdene ble opprettholdt i en kontrollert 12-h lys og mørke syklus og romt...

<ol>
	<li>Saijilafu, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K-GSK3+signalling+regulates+mammalian+axon+regeneration+by+inducing+the+expression+of+Smad1.">PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1.</a> Nature Communications. 4, 2690 (2013).</li><li>Zhang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt-independent+GSK3+inactivation+downstream+of+PI3K+signaling+regulates+mammalian+axon+regeneration.">Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).</li><li>Jiang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-26a+supports+mammalian+axon+regeneration+in+vivo+by+suppressing+GSK3beta+expression.">MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1865 (2015).</li><li>Krames, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+dorsal+root+ganglion+in+the+development+of+neuropathic+pain.">The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain.</a> Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).</li><li>Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+transfection+methods+optimized+for+gene+delivery+to+a+lung+cancer+cell+line.">Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).</li><li>Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+2017:+Progress+and+Future+Directions.">Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions.</a> Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).</li><li>Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Transfer+into+Mouse+Lyoma+Cells+by+Electroporation+in+High+Electric-Fields.">Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields.</a> The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Liu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-138+and+SIRT1+form+a+mutual+negative+feedback+loop+to+regulate+mammalian+axon+regeneration.">MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration.</a> Genes &amp; Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons.">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nature Communications. 2, 543 (2011).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13, 859 (2016).</li><li>Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterolateral+intertransverse+lumbar+fusion+in+a+mouse+model:+surgical+anatomy+and+operative+technique.">Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique.</a> Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).</li><li>Dommisse, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+supply+of+the+spinal+cord.+A+critical+vascular+zone+in+spinal+surgery.">The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).</li><li>Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Systemic+Delivery+of+Synthetic+siRNAs+in+Adult+Mice.">Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).</li></ol>

Flere kirurgisk trinnene krever spesiell oppmerksomhet. L4 og L5 DRGs (plassering av somas), som dominerer sciatic nerve, må være korrekt identifisert og injisert med gene konstruksjoner. Ellers GFP-merkingen vil være fraværende i sciatic nerve axons. Iliaca toppene kan vises som nyttig anatomiske landemerker å finne L4 og L5 DRGs. I de fleste mus er fasett felles mellom L5 og L6 vertebrae proximate til iliaca toppene12. Alternativt kan L3 DRG velges i stedet for L5, spesielt for analyser som...

Skader i nervesystemet forårsaket av nevrale traumer eller forskjellige nevrodegenerative sykdommer som regel resultere i feil i motoren, sensoriske og kognitive funksjoner. Nylig har mye innsats vært viet til regenerativ styrke re-etablering i voksen neurons å gjenopprette den fysiologiske functionsof skadet neurons1,2,3. Sensoriske neurons i DRG er en klynge av nerveceller som formidler ulike sensoriske stimuli, som smerte, temperatur, trykk eller kroppsstilling, til hjernen. Hver av disse neurons pseudo Unipolare og inneholder et enkelt axon som bifurcates med en gren mot periferien og den andre grenen vei mot ryggmargen4. Voksen sensoriske neurons i DRGs er blant noen eldre pattedyr neurons kjent å regenerere deres axons aktivt etter skader. Derfor har skader av sensoriske axons vært mye ansatt som avgjørende modell å studere mekanismer for axonal gjenfødelse i vivo.
I vivo genet transfection teknikker, som er vanligvis mindre tidkrevende å definere og mer fleksibelt enn bruke transgene dyr, har spilt viktige roller i å studere funksjonene av gener og signalnettverk trasé i nervesystemet. De viktigste teknikkene kan kategoriseres i to tilnærminger: instrument- og virus-baserte5. Viral-basert i vivo gen levering i voksen neurons kan gi nøyaktig spatiotemporal manipulasjon av gene expression6. Imidlertid er arbeidskrevende prosesser involvert i viral-baserte metoder, for eksempel produksjon og rensing av virus partikler som inneholder ønsket genet. I tillegg kunne mange viral vektorer aktivere immunsystemet til verten, som kan forstyrre datainnsamling, analyse og muligens villede tolkning av eksperimentelle resultater. Electroporation, en typisk instrument-baserte transfection tilnærming, bruker en elektrisk puls for å øke permeabilitet av cellen og kjernefysiske membraner transiently, noe som favoriserer tilstrømningen av genet vektorer eller liten RNA oligos fra plassen utenfor cellene7 . In vitro electroporation er anerkjent som en midlertidig, men svært effektive strategi for å manipulere målrettet genuttrykk i mange celletyper. Selv om i vivo electroporation fører bare til midlertidig genuttrykk med lav transfecting effektivitet sammenlignet med viral vektorer, har ulike fordeler over viral tilnærminger. Det kan for eksempel brukes til nesten alle7,8,9-med vev og celler. I tillegg enten plasmider koding gener steder eller liten RNA oligos (f.eks siRNAs, microRNAs) mot visse utskrifter kan injiseres vevet direkte og deretter elektrisk pulserende, som gjør prosedyren mindre arbeids - og tid - forbruker. Videre er det mulig å transfecting flere plasmider og RNA oligos samtidig med enkel electroporation.
Vi har etablert en i vivo electroporation tilnærming for å manipulere genuttrykk i voksen mus sensoriske neurons og brukt og validert slik tilnærming i mange pioneer studier1,2,3 ,8,10. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å lette bruken av denne tilnærmingen for fremtidige studier av pattedyr axon gjenfødelse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1039px;" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:335px;">ECM 830 Square wave electroporation system</td>
			<td style="width:232px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:121px;">45-0052</td>
			<td style="width:351px;">For in vivo electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:335px;">Tweezertrodes electrodes</td>
			<td style="width:232px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:121px;">45-0524</td>
			<td>For in vivo electroporation, 1 mm flat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Picospritzer III</td>
			<td style="width:232px;">Parker Instrumentation</td>
			<td style="width:121px;">1096</td>
			<td>Intracellular Microinjection Dispense Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass Capillary Puller</td>
			<td style="width:232px;">NARISHIGE</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">1902328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Stereo Dissection Microscope</td>
			<td style="width:232px;">Leica</td>
			<td style="width:121px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsurgery Rongeur</td>
			<td style="width:232px;">F.S.T</td>
			<td style="width:121px;">16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsurgery Forceps</td>
			<td style="width:232px;">FST by DUMONT, Switzerland</td>
			<td style="width:121px;">11255-20</td>
			<td>Only for sciatic nerve crush</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:232px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">TW100-4</td>
			<td>10 cm, standard wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tape</td>
			<td style="width:232px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:121px;">15-901-30</td>
			<td>For fixing the mouse on the corkboard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">T48402</td>
			<td>Avertin stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">152463</td>
			<td>Avertin stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">SIC003</td>
			<td>Non-target siRNA with fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:335px;">microRNA Mimic Transfection Control with Dy547</td>
			<td style="width:232px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:121px;">CP-004500-01-05</td>
			<td>Non-target microRNA with fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmids preparation kit</td>
			<td style="width:232px;">Invitrogen Purelink</td>
			<td style="width:121px;">K210016</td>
			<td>GFP-coding plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fast Green Dye</td>
			<td style="width:232px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F7252</td>
			<td>For better visualization of the DRG outline during injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Ketamine</td>
			<td style="width:232px;">Putney, Inc</td>
			<td style="width:121px;">NDC 26637-731-51</td>
			<td>Anesthesia induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Xylazine</td>
			<td style="width:232px;">AnaSed</td>
			<td style="width:121px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthesia induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Acetaminophen</td>
			<td style="width:232px;">McNeil Consumer Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">NDC 50580-449-36</td>
			<td>Post-surgical pain relief</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mammalian axon regeneration: in vivo electroporation of adult mouse dorsal root ganglion

Electroporation er en viktig ikke-viral genet transfection å innføre DNA plasmider eller små RNA molekyler i celler. En sensorisk Nevron i dorsal root ganglion (DRGs) utvider et enkelt axon med to grener. En gren går til tilleggsutstyret nerve (eksterne gren), og den andre grenen inn ryggmargen gjennom dorsal root (sentrale gren). Etter nevrale skaden regenererer perifere grenen robust mens den sentrale grenen ikke regenereres. På grunn av den høye regenerative kapasiteten, har sensoriske axon gjenfødelse vært mye brukt som en modell for å studere pattedyr axon gjenfødelse både perifere nervesystemet (PNS) og sentralnervesystemet (CNS). Her beskriver vi en tidligere etablerte tilnærming protokoll for å manipulere genuttrykk i eldre sensoriske neurons i vivo via electroporation. Basert på hva med plasmider eller liten RNA-oligos (siRNAs eller microRNAs), gir tilnærmingen både tap og gevinst-av-funksjon eksperimenter for å studere roller av gener av interesser eller microRNAs i regulering av axon gjenfødelse i vivo. I tillegg kan manipulering av genet uttrykk i vivo kontrolleres både romlig og timelig i en relativt kort tid kurs. Denne modellen systemet gir et unikt verktøy for å undersøke molekylære mekanismer som pattedyr axon regenereringen er regulert i vivo.

Å kvantifisere cytotoksisitet gjeldende protokollen og til å validere at transfection i vivo DRG electroporation er høy nok, vi injisert og electroporated fluorescently-merket microRNA eller siRNA i L4 og L5 DRGs. De frittliggende DRGs ble behandlet gjennom cryo-skjæring og immunohistochemistry (figur 1A-B). Ved beregning celle overlevelse etter injeksjon og electroporation, var de intakt DRGs fra L4 og L5 høstet og behandlet gj...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion at JoVE.com

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation er en effektiv tilnærming til å levere gener interesser i celler. Ved å bruke denne tilnærmingen i vivo på nervecellene i voksen mus dorsal root ganglion (DRG), beskriver vi en modell for å studere axon gjenfødelse i vivo.

Undersøker pattedyr Axon gjenfødelse: I Vivo Electroporation av voksen mus Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetisk studie av Axon Regeneration med dyrkede Voksen røttene ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In vitro modellering av kreft Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

En tilnærming for å forbedre Justering og myelination av Dorsal Root ganglion nevroner

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsalrotganglion Injeksjon og rygg Root knusningsskade som en modell for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Laminotomy for lumbale Dorsal Root Ganglion og injeksjon i svin

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analyse av immunceller i enkelt Sciatic nerver og Dorsal Root Ganglion fra en enkelt mus med flowcytometri

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Rask isolering av rygg rot Ganglion makrofager

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In situ Visualisering av Axon vekst og vekst kjegledynamikk i akutte Ex Vivo embryonale hjerneskivekulturer

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

in vitro myelinisering av perifere aksoner i en kokultur av rotte dorsalrot ganglion eksplanter og Schwann-celler

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...