Name: investigating mammalian axon regeneration: in vivo electroporation of adult mouse dorsal root ganglion
Uploaded: 2018-09-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion at JoVE.com

O estudo foi financiado (concedido a F-Q. Z) pelo NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), a Fundação de Neilsen H. Craig e a Fundação de BrightFocus.

Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com o protocolo animal aprovado pelo Comitê de uso e Johns Hopkins institucional Cuidado Animal.
1. materiais e reagentes
<ol><li>
Animais
	<ol>
<li>Use ratos CF1 fêmeas seis semanas de idade, pesando 30 – 35 g para os experimentos. Nota: Os ratos foram alojados em grupo (5 ratos por gaiola) em gaiolas esterilizados individualmente ventilados com 1/4" milho espiga da cama e 2" quadrado nestlets para o ...

<ol>
	<li>Saijilafu, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K-GSK3+signalling+regulates+mammalian+axon+regeneration+by+inducing+the+expression+of+Smad1.">PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1.</a> Nature Communications. 4, 2690 (2013).</li><li>Zhang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt-independent+GSK3+inactivation+downstream+of+PI3K+signaling+regulates+mammalian+axon+regeneration.">Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).</li><li>Jiang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-26a+supports+mammalian+axon+regeneration+in+vivo+by+suppressing+GSK3beta+expression.">MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1865 (2015).</li><li>Krames, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+dorsal+root+ganglion+in+the+development+of+neuropathic+pain.">The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain.</a> Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).</li><li>Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+transfection+methods+optimized+for+gene+delivery+to+a+lung+cancer+cell+line.">Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).</li><li>Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+2017:+Progress+and+Future+Directions.">Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions.</a> Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).</li><li>Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Transfer+into+Mouse+Lyoma+Cells+by+Electroporation+in+High+Electric-Fields.">Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields.</a> The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Liu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-138+and+SIRT1+form+a+mutual+negative+feedback+loop+to+regulate+mammalian+axon+regeneration.">MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration.</a> Genes &amp; Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons.">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nature Communications. 2, 543 (2011).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13, 859 (2016).</li><li>Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterolateral+intertransverse+lumbar+fusion+in+a+mouse+model:+surgical+anatomy+and+operative+technique.">Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique.</a> Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).</li><li>Dommisse, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+supply+of+the+spinal+cord.+A+critical+vascular+zone+in+spinal+surgery.">The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).</li><li>Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Systemic+Delivery+of+Synthetic+siRNAs+in+Adult+Mice.">Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).</li></ol>

Várias etapas cirúrgicas requerem especial atenção. A L4 e L5 DRGs (localização de somas), que dominam o nervo ciático, precisam ser corretamente identificado e injetado com construções de gene. Caso contrário, o GFP-rotulagem estarão ausente em axônios do nervo ciático. As cristas ilíacas podem ser vistas como útil pontos anatômicos para localizar a L4 e L5 DRGs. Na maioria dos ratos, o aspecto comum entre as vértebras L5 e L6 é próxima de cristas ilíacas12. Alternativamente, ...

Lesões no sistema nervoso causaram por trauma neural ou várias doenças neurodegenerativas geralmente resultam em defeitos nas funções motoras, sensoriais e cognitivas. Recentemente, muito esforço tem sido dedicado para restabelecimento de potência regenerativa nos neurônios adultos para restaurar o functionsof fisiológicas ferido neurônios1,2,3. Neurônios sensoriais em DRG são um aglomerado de células nervosas que transmitem diferentes estímulos sensoriais, tais como dor, temperatura, toque ou postura do corpo, para o cérebro. Cada um desses neurônios é pseudo unipolar e contém um único axônio que se bifurca com um ramo, estendendo-se em direção a periferia e o outro ramo indo em direção a medula espinhal4. Os neurônios sensoriais adultos DRGs estão entre alguns neurônios de mamíferos maduros conhecidos para regenerar seus axônios ativamente após lesão. Daí, lesões de axônios sensoriais têm sido empregadas extensivamente como um modelo fundamental para estudar os mecanismos de regeneração axonal em vivo.
Na vivo técnicas transfeccao de gene, que são geralmente menos demorado para configurar e mais flexível do que usando animais transgénicos, jogar papéis essenciais em estudar as funções dos genes e sinalização de caminhos no sistema nervoso. As principais técnicas podem ser classificadas em duas abordagens: instrumento-vírus baseados e5. Viral-baseado na vivo entrega gene nos neurônios adultos pode fornecer precisa spatiotemporal manipulação do gene expressão6. No entanto, processos de trabalho intensivos estão envolvidos em métodos baseados em viral, tais como a produção e purificação de partículas virais, contendo o gene desejado. Além disso, muitos vetores virais poderiam ativar o sistema imunológico do hospedeiro, que pode interferir com a aquisição de dados, análise de dados e possivelmente induzir em erro a interpretação dos resultados experimentais. Eletroporação, uma abordagem típica do transfection baseado no instrumento, utiliza um pulso elétrico para aumentar a permeabilidade da célula e as membranas nucleares, transitoriamente, o que favorece o afluxo de vetores de gene ou pequeno RNA oligos do espaço fora das células7 . Em vitro eletroporação é amplamente reconhecida como uma estratégia transitória, mas altamente eficiente para manipular a expressão de genes alvo em muitos tipos de células. Embora na vivo electroporation leva apenas a expressão do gene transiente com baixa eficiência transfecting comparada com vetores virais, tem várias vantagens sobre abordagens virais. Por exemplo, pode ser aplicado a quase todos os tecidos e células de7,8,9. Além disso, qualquer codificação de genes de interesse ou pequenos oligos RNA (por exemplo, siRNAs, microRNAs) contra certas transcrições de plasmídeos podem ser injetados diretamente no tecido alvo e então eletricamente pulsados, que tornar o processo menos trabalho - e tempo - consumindo. Além disso, transfecting múltiplos plasmídeos e RNA oligos simultaneamente com eletroporação único é possível.
Nós temos estabelecido uma abordagem electroporation in vivo , para manipular a expressão gênica em neurônios sensoriais do rato adulto e aplicado com sucesso e validado tal abordagem em numerosos estudos pioneiros1,2,3 ,8,10. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para facilitar o uso desta abordagem para futuros estudos de regeneração do axônio dos mamíferos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1039px;" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:335px;">ECM 830 Square wave electroporation system</td>
			<td style="width:232px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:121px;">45-0052</td>
			<td style="width:351px;">For in vivo electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:335px;">Tweezertrodes electrodes</td>
			<td style="width:232px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:121px;">45-0524</td>
			<td>For in vivo electroporation, 1 mm flat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Picospritzer III</td>
			<td style="width:232px;">Parker Instrumentation</td>
			<td style="width:121px;">1096</td>
			<td>Intracellular Microinjection Dispense Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass Capillary Puller</td>
			<td style="width:232px;">NARISHIGE</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">1902328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Stereo Dissection Microscope</td>
			<td style="width:232px;">Leica</td>
			<td style="width:121px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsurgery Rongeur</td>
			<td style="width:232px;">F.S.T</td>
			<td style="width:121px;">16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsurgery Forceps</td>
			<td style="width:232px;">FST by DUMONT, Switzerland</td>
			<td style="width:121px;">11255-20</td>
			<td>Only for sciatic nerve crush</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:232px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">TW100-4</td>
			<td>10 cm, standard wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tape</td>
			<td style="width:232px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:121px;">15-901-30</td>
			<td>For fixing the mouse on the corkboard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">T48402</td>
			<td>Avertin stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">152463</td>
			<td>Avertin stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">SIC003</td>
			<td>Non-target siRNA with fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:335px;">microRNA Mimic Transfection Control with Dy547</td>
			<td style="width:232px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:121px;">CP-004500-01-05</td>
			<td>Non-target microRNA with fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmids preparation kit</td>
			<td style="width:232px;">Invitrogen Purelink</td>
			<td style="width:121px;">K210016</td>
			<td>GFP-coding plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fast Green Dye</td>
			<td style="width:232px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F7252</td>
			<td>For better visualization of the DRG outline during injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Ketamine</td>
			<td style="width:232px;">Putney, Inc</td>
			<td style="width:121px;">NDC 26637-731-51</td>
			<td>Anesthesia induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Xylazine</td>
			<td style="width:232px;">AnaSed</td>
			<td style="width:121px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthesia induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Acetaminophen</td>
			<td style="width:232px;">McNeil Consumer Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">NDC 50580-449-36</td>
			<td>Post-surgical pain relief</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mammalian axon regeneration: in vivo electroporation of adult mouse dorsal root ganglion

Eletroporação é uma abordagem de transfecção do gene não-virais essenciais para introduzir DNA plasmídeos ou pequenas moléculas de RNA em células. Um neurônio sensorial no gânglio da raiz dorsal (DRGs) estende-se a um único axônio com dois ramos. Um ramo vai para o periférico nervo (ramo periférico) e o outro ramo entra a medula espinhal através da raiz dorsal (agência central). Após a lesão neural, o ramo periférico regenera robustamente Considerando que a agência central não se regenera. Devido a alta capacidade regenerativa, regeneração do axônio sensorial foi amplamente utilizada como um sistema modelo para estudar a regeneração do axônio mamíferos no sistema nervoso periférico (SNP) e sistema nervoso central (SNC). Aqui, descrevemos um protocolo de abordagem estabelecida anteriormente para manipular a expressão gênica em neurônios sensoriais maduros na vivo via eletroporação. Baseado na transfecção com plasmídeos ou pequeno RNA oligos (siRNAs ou microRNAs), a abordagem permite ambas as experiências de perda e ganho-de-função estudar os papéis de genes de interesse ou microRNAs no Regulamento do axônio regeneração em vivo. Além disso, a manipulação do gene expressão na vivo pode ser controlada tanto espacial e temporalmente dentro de um curso de tempo relativamente curto. Este modelo sistema fornece uma única ferramenta para investigar o mecanismo molecular pelo qual a regeneração do axônio mamíferos é regulamentado na vivo.

Para quantificar a citotoxicidade do protocolo atual e para validar que a taxa de transfecção de na vivo DRG eletroporação é alta o suficiente, nós injetamos e electroporated marcadas fluorescentemente microRNA ou siRNA em L4 e L5 DRGs. Os DRGs desanexados foram processados através de cryo-seccionamento e imuno-histoquímica (Figura 1A-B). Ao estimar a taxa de sobrevivência de células após a injeção e eletroporação, os ...

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Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Eletroporação é uma abordagem eficaz para entregar genes de interesse em células. Aplicando-se esta abordagem na vivo sobre os neurônios do gânglio de raiz dorsal do rato adulto (DRG), descrevemos um modelo para estudo de regeneração do axônio em vivo.

Investigação regeneração do axônio mamíferos: In Vivo Electroporation do gânglio de raiz Dorsal do rato adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neurociência

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modelagem de Cancerous Neural Invasion: o gânglio Modelo de raiz dorsal

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Injection gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento como um modelo para Sensorial Axon Regeneração

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Laminotomy para acesso de gânglio lombar Dorsal raiz e injeção em suínos

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Análise de células do sistema imunológico em único nervos ciático e gânglio da raiz Dorsal de um único rato usando citometria de fluxo

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...