Name: investigating mammalian axon regeneration: in vivo electroporation of adult mouse dorsal root ganglion
Uploaded: 2018-09-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion at JoVE.com

Это исследование финансировалось (вручается F-Q. З.), низ (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), Крейг H. Neilsen фонд и Фонд BrightFocus.

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с животных протоколом, утвержденным Джонса Хопкинса институциональных животное уход и использование Комитетом.
1. материалы и реагенты
<ol><li>
Животные
	<ol>
<li>Используйте шесть week-old мышей женского CF1 весо...

<ol>
	<li>Saijilafu, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K-GSK3+signalling+regulates+mammalian+axon+regeneration+by+inducing+the+expression+of+Smad1.">PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1.</a> Nature Communications. 4, 2690 (2013).</li><li>Zhang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt-independent+GSK3+inactivation+downstream+of+PI3K+signaling+regulates+mammalian+axon+regeneration.">Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).</li><li>Jiang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-26a+supports+mammalian+axon+regeneration+in+vivo+by+suppressing+GSK3beta+expression.">MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1865 (2015).</li><li>Krames, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+dorsal+root+ganglion+in+the+development+of+neuropathic+pain.">The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain.</a> Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).</li><li>Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+transfection+methods+optimized+for+gene+delivery+to+a+lung+cancer+cell+line.">Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).</li><li>Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+2017:+Progress+and+Future+Directions.">Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions.</a> Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).</li><li>Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Transfer+into+Mouse+Lyoma+Cells+by+Electroporation+in+High+Electric-Fields.">Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields.</a> The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Liu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-138+and+SIRT1+form+a+mutual+negative+feedback+loop+to+regulate+mammalian+axon+regeneration.">MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration.</a> Genes &amp; Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons.">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nature Communications. 2, 543 (2011).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13, 859 (2016).</li><li>Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterolateral+intertransverse+lumbar+fusion+in+a+mouse+model:+surgical+anatomy+and+operative+technique.">Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique.</a> Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).</li><li>Dommisse, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+supply+of+the+spinal+cord.+A+critical+vascular+zone+in+spinal+surgery.">The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).</li><li>Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Systemic+Delivery+of+Synthetic+siRNAs+in+Adult+Mice.">Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).</li></ol>

Несколько хирургических шаги требуют особого внимания. L4 и L5 ГДК (местоположение СОСМ), которые доминируют седалищного нерва, должны быть правильно определены и вводят с Джин конструкции. В противном случае, будет отсутствовать GFP-маркировки в аксонов седалищного нерва. Подвздошные гре...

Травмы в нервной системе, вызванные нейронных травмы или различных нейродегенеративные заболевания обычно приводят в дефекты в моторные, сенсорные и когнитивные функции. Недавно много усилий была посвящена регенеративных потенции воссоздания в взрослых нейронов для восстановления физиологической functionsof ранения нейронов1,2,3. Сенсорные нейроны в DRG-группа нервных клеток, которые передают разные сенсорные стимулы, такие как боль, температура, touch или позы тела, мозг. Каждый из этих нейронов псевдо-однополярного и содержит один Аксон, который может разветвлять каждой присваивать с одной ветви, расширение к периферии и другая ветвь, направляясь в спинном4. Среди нескольких зрелых млекопитающих нейронов, известный регенерировать их аксоны активно после травмы взрослых сенсорных нейронов в ГДК. Следовательно травм сенсорные аксоны широко применялись как ключевую модель для изучения механизмов аксональное регенерации в vivo.
В естественных условиях Гене transfection методов, которые обычно меньше времени настроить и более гибким, чем при использовании трансгенных животных, играют важную роль в изучении функций генов и сигнальные пути в нервной системе. Основные методы могут быть разделены на два подхода: на основе документа и вирус5. Вирусные основанный в vivo гена доставки в взрослых нейронов может предоставить точные пространственно-временных манипуляции ген выражение6. Однако трудоемкие процессы участвуют в Вирусный на основе методов, например производства и очистки вирусных частиц, содержащий нужный ген. Кроме того многие вирусных векторов может активировать иммунную систему хозяина, который может повлиять на сбор данных, анализ данных и возможно заблуждение интерпретации экспериментальных результатов. Электропорация, типичный инструмент основе трансфекции подход, использует электрического импульса увеличить проницаемость клеток и ядерной мембраны временно, что способствует приток гена векторов или малых РНК oligos из пространства вне клетки7 . В vitro электропорации широко признается как временной, но весьма эффективные стратегии для манипулирования целевых генов выражение во многих типах клеток. Хотя в vivo электропорации приводит лишь к экспрессии генов переходные с низкой transfecting эффективности по сравнению с вирусных векторов, он имеет различные преимущества над вирусные подходы. Например он может применяться для почти всех тканей и клеток,7,8,9. Кроме того, либо плазмид, кодирование генов интерес или малые РНК oligos (например, малые интерферирующие РНК, микроРНК) против некоторых стенограммы можно непосредственно впрыскивается в ткани-мишени и затем электрически пульсирующий, которые делают процедуру меньше труда - и время - потребителями. Кроме того transfecting несколько плазмидов и РНК oligos одновременно с одной электропорации Возможен экспорт.
Мы создали в vivo электропорации подход к манипулировать экспрессии генов в взрослых мыши сенсорных нейронов и успешно применяется и проверки такой подход в многочисленных пионер исследований1,2,3 ,8,10. Здесь мы представляем подробный протокол для облегчения использования данного подхода для будущих исследований млекопитающих аксона регенерации.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1039px;" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:335px;">ECM 830 Square wave electroporation system</td>
			<td style="width:232px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:121px;">45-0052</td>
			<td style="width:351px;">For in vivo electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:335px;">Tweezertrodes electrodes</td>
			<td style="width:232px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:121px;">45-0524</td>
			<td>For in vivo electroporation, 1 mm flat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Picospritzer III</td>
			<td style="width:232px;">Parker Instrumentation</td>
			<td style="width:121px;">1096</td>
			<td>Intracellular Microinjection Dispense Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass Capillary Puller</td>
			<td style="width:232px;">NARISHIGE</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">1902328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Stereo Dissection Microscope</td>
			<td style="width:232px;">Leica</td>
			<td style="width:121px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsurgery Rongeur</td>
			<td style="width:232px;">F.S.T</td>
			<td style="width:121px;">16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsurgery Forceps</td>
			<td style="width:232px;">FST by DUMONT, Switzerland</td>
			<td style="width:121px;">11255-20</td>
			<td>Only for sciatic nerve crush</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:232px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">TW100-4</td>
			<td>10 cm, standard wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tape</td>
			<td style="width:232px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:121px;">15-901-30</td>
			<td>For fixing the mouse on the corkboard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">T48402</td>
			<td>Avertin stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">152463</td>
			<td>Avertin stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">SIC003</td>
			<td>Non-target siRNA with fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:335px;">microRNA Mimic Transfection Control with Dy547</td>
			<td style="width:232px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:121px;">CP-004500-01-05</td>
			<td>Non-target microRNA with fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmids preparation kit</td>
			<td style="width:232px;">Invitrogen Purelink</td>
			<td style="width:121px;">K210016</td>
			<td>GFP-coding plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fast Green Dye</td>
			<td style="width:232px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F7252</td>
			<td>For better visualization of the DRG outline during injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Ketamine</td>
			<td style="width:232px;">Putney, Inc</td>
			<td style="width:121px;">NDC 26637-731-51</td>
			<td>Anesthesia induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Xylazine</td>
			<td style="width:232px;">AnaSed</td>
			<td style="width:121px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthesia induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Acetaminophen</td>
			<td style="width:232px;">McNeil Consumer Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">NDC 50580-449-36</td>
			<td>Post-surgical pain relief</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mammalian axon regeneration: in vivo electroporation of adult mouse dorsal root ganglion

Электропорация является основных не вирусных генов трансфекции подход к внедрению ДНК плазмиды или малых молекул РНК в клетки. Сенсорного нейрона в корень спинной ганглий (ДРГ) расширяет один Аксон с двумя ответвлениями. Одна ветвь идет к периферической нерв (периферийные отделения) и другие отрасли входит спинного мозга через спинной корень (Центральный сектор). После нейронных травмы периферийное отделение надежно восстанавливает в то время как Центральный филиал не регенерировать. Из-за высокой регенеративной способностью сенсорные аксона регенерации широко использовался как модель системы для изучения млекопитающих аксона регенерации в периферической нервной системы (ПНС) и центральной нервной системы (ЦНС). Здесь мы описываем ранее установленных подход протокол манипулировать экспрессии генов в зрелых сенсорных нейронов в естественных условиях через электропорации. Основываясь на трансфекции плазмид или малых РНК oligos (малые интерферирующие РНК или микроРНК), подход позволяет для обоих - и получить из функция потерь экспериментов для изучения роли генов интересов или микроРНК в регуляции регенерации аксона в естественных условиях. Кроме того манипуляции ген выражение в естественных условиях может управляться в пространственном и временном отношении в течение относительно короткого времени курс. Эта модель система обеспечивает уникальный инструмент для изучения молекулярных механизмов, которыми регенерации аксона млекопитающих является регулируемой в естественных условиях.

Для количественного определения цитотоксичность текущего протокола и проверить что трансфекции в vivo DRG электропорации высок процент достаточно, мы вводили и electroporated дневно тегами микроРНК или малых интерферирующих РНК в L4 и L5 ГДК. Отдельностоящий ДРГ были обраб?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion at JoVE.com

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Электропорация является эффективным подходом для доставки генов интересов в клетки. Применяя этот подход в естественных условиях на нейроны взрослых мыши корневой спинной ганглий (DRG), мы описываем модель для изучения регенерации аксона в естественных условиях.

Следственный млекопитающих Axon регенерации: В Vivo электропорации взрослых мыши Спинной корень ганглия

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Трансфекция Мышь ганглиозных клеток сетчатки при В естественных условиях Электропорация

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Генетическое изучение регенерации аксонов с искусственного взрослых нейронов ганглиев

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

Экстракорпоральное моделирование раковой Neural вторжение: Спинной ганглий корень модели

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Подход, чтобы усилить согласованность и миелинизации спинного ганглий корень Нейроны

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Спинальный ганглий Injection и дорсальных корешков размозжение как модель для регенерации Сенсорное Axon

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Ламинотомия для поясничного спинной ганглий суперпользователя и инъекций в свиней

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Анализ иммунокомпетентных клеток в одном седалищного нервов и спинной корень ганглия от одной мыши с помощью проточной цитометрии

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Быстрая изоляция дорсал Корень Ganglion Макрофаги

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

На месте Визуализация роста аксонов и динамики конуса роста в культурах эмбриональных срезов мозга Ex vivo

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

Миелинизация периферических аксонов in vitro в кокультуре ганглиозных эксплантатов дорсальных корешков крыс и шванновских клеток

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...