Name: detection of phospholipase c activity in the brain homogenate from the honeybee
Uploaded: 2018-09-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee at JoVE.com

Figuur 4B - 4 D werd van Suenami et al. gewijzigd 24 met toestemming van Open biologie. De auteurs zijn dankbaar aan de uitgever voor de machtiging. Dit werk werd gesteund door het Human Frontier Science Program (RGY0077/2016) Shota Suenami en Ryo Miyazaki.

1. capture van foerageren honingbijen
<ol><li>Aankoop van bijenvolken van een lokale distributeur.</li>
	<li>Met behulp van een insect net, vangen forager bijen die naar de korf met stuifmeel tassen op hun achterpoten terugkeren. De bijen overbrengen in een standaard 50 mL plastic conische buis en cap van de buis (Figuur 1). Zet de buis op ijs te anesthetize van de bijen. Opmerking: Draag de aangewezen jassen voor de bijenteelt te vermijden bijensteken. Verpleegkunde bijen kunnen ook wo...

<ol>
	<li>Winston, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of the Honey Bee. , (1991).</li><li>Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+and+non-associative+plasticity+in+Kenyon+cells+of+the+honeybee+mushroom+body.">Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).</li><li>M&#252;&#223;ig, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+disruption+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR1+in+the+honeybee+brain+selectively+impairs+memory+formation.">Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).</li><li>Devaud, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrate+for+higher-order+learning+in+an+insect:+mushroom+bodies+are+necessary+for+configural+discriminations.">Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).</li><li>Gr&#252;nbaum, L., M&#252;ller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+specific+olfactory+memory+leads+to+a+long-lasting+activation+of+protein+kinase+C+in+the+antennal+lobe+of+the+honeybee.">Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).</li><li>Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrated+expression+of+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+and+protein+kinase+C+in+the+mushroom+bodies+of+the+brain+of+the+honeybee+Apis+mellifera+L.">Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L.</a> The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).</li><li>Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+profiling+of+central+nervous+system+regions+in+three+species+of+honey+bee+during+dance+communication+behavior.">Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior.</a> PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).</li><li>Kaneko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+analysis+of+the+expression+of+futsch,+tau,+and+MESK2+homologues+in+the+brain+of+the+European+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.).</a> PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).</li><li>Kaneko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+middle-type+Kenyon+cells+in+the+honeybee+brain+revealed+by+area-preferential+gene+expression+analysis.">Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis.</a> PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).</li><li>Pasch, E., Muenz, T. S., R&#246;ssler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+is+differentially+localized+in+synaptic+regions+of+kenyon+cells+within+the+mushroom+bodies+of+the+honeybee+brain.">CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain.</a> The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).</li><li>Suenami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+differentiation+of+Kenyon+cell+subtypes+using+three+mushroom+body-preferential+genes+during+metamorphosis+in+the+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.).</a> PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).</li><li>Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+early+olfactory+processing+by+an+octopaminergic+reinforcement+pathway+in+the+honeybee.">Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).</li><li>Matsumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-gated+channels,+calmodulin,+adenylyl+cyclase,+and+calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+are+required+for+late,+but+not+early,+long-term+memory+formation+in+the+honeybee.">Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee.</a> Learning &amp; Memory. 21 (5), 272-286 (2014).</li><li>Scholl, C., K&#252;bert, N., Muenz, T. S., R&#246;ssler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+knockdown+affects+both+early+and+late+phases+of+olfactory+long-term+memory+in+the+honeybee.">CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee.</a> Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).</li><li>Miyata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+long-term+synaptic+depression+in+the+rostral+cerebellum+correlated+with+impaired+motor+learning+in+phospholipase+C+&#946;4+mutant+mice.">Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C &#946;4 mutant mice.</a> European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).</li><li>Koh, H. -. Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+social+behavior+and+sensorimotor+gating+in+mice+lacking+phospholipase+C&#946;1.">Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase C&#946;1.</a> Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).</li><li>Quan, W. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+behaviors+and+prepulse+inhibition+in+phospholipase+C&#949;-/-+mice.">Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase C&#949;-/- mice.</a> Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).</li><li>Rioult-Pedotti, M. -. S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+promotes+motor+cortex+plasticity+and+motor+skill+learning+via+PLC+activation.">Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).</li><li>Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+neurons:+molecular+mechanisms+and+cellular+consequences.">Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences.</a> Science. 268 (5208), 239-247 (1995).</li><li>Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipase+C&#949;+in+physiological+phosphoinositide+signaling+networks.">Role of phospholipase C&#949; in physiological phosphoinositide signaling networks.</a> Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).</li><li>Dusaban, S. S., Brown, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLC&#949;+mediated+sustained+signaling+pathways.">PLC&#949; mediated sustained signaling pathways.</a> Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).</li><li>Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetic+approaches+to+investigating+calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+function+in+plasticity+and+cognition.">Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).</li><li>Giese, K. P., Mizuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+protein+kinases+in+learning+and+memory.">The roles of protein kinases in learning and memory.</a> Learning &amp; Memory. 20 (10), 540-552 (2013).</li><li>Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+inhibition+of+phospholipase+C+in+the+brain+attenuates+early+memory+formation+in+the+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.).</a> Biology Open. 7 (1), (2018).</li><li>Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+phospholipase+C+encoded+by+the+norpA+gene+of+Drosophila+melanogaster.">Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).</li><li>Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorogenic,+small+molecule+reporter+for+mammalian+phospholipase+C+isozymes.">A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes.</a> ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).</li><li>Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+phosphatidylinositol+phosphodiesterase+in+the+head+of+a+Drosophila+visual+mutant,+norpA+(no+receptor+potential+A).">Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A).</a> The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).</li><li>Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLC&#946;3+mediates+cortactin+interaction+with+WAVE2+in+MCP1-induced+actin+polymerization+and+cell+migration.">PLC&#946;3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).</li><li>Fiala, A., M&#252;ller, U., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+downregulation+of+protein+kinase+A+during+olfactory+learning+using+antisense+technique+impairs+long-term+memory+formation+in+the+honeybee,+Apis+mellifera.">Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).</li><li>Thamm, M., Scheiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+in+honey+bees:+spatial+expression,+Amfor+gene+expression,+sucrose+responsiveness,+and+division+of+labor.">PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor.</a> The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).</li><li>Balfanz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+transmembrane+adenylyl+cyclases+from+the+honeybee+brain.">Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).</li><li>Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bifunctional+phospholipase+C+that+is+regulated+by+G&#945;12+and+stimulates+the+Ras/mitogen-activated+protein+kinase+pathway.">A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by G&#945;12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+membrane-associated,+fluorogenic+reporter+for+mammalian+phospholipase+C+isozymes.">A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).</li></ol>

Het biochemisch onderzoek van eiwit activiteit is uiterst belangrijk voor het begrip van de moleculaire signalering in de hersenen, omdat de activiteit van het enzym wordt beïnvloed door verschillende moleculen, zoals substraten en inhibitors, en dus mee kunt wijzigen dierlijk gedrag (b.v., leren en geheugen)5. In studies van de honingbij, worden enzymen zoals cyclisch AMP-afhankelijk proteïne kinase A, cyclisch GMP-afhankelijk proteïne kinase PKC, gefosforyleerd CaMKII en adenylaat cy...

De Europese honingbij (Apis mellifera L.) is een insect eusociale en vrouwelijke bijen Toon kaste-afhankelijke reproductie en leeftijd-afhankelijke verdeling van de arbeid. Bijvoorbeeld in de steriele kaste van bijen hierna aangeduid als "werknemers", voedt jongere personen de broedsels, terwijl oudere nectar en pollen buiten de korf-1 voedergewassen. Leren en geheugen, vermogen is kritisch belangrijk in het leven van de honingbij, omdat foragers moet herhaaldelijk gaan heen en weer tussen voedselbronnen en hun nest en vervolgens de locaties van goed voedselbronnen aan hun nestmates door middel van dans communiceren mededeling1. Vorige studies aangetoond dat de MB, een hogere centrum van de hersenen bij insecten, bij de mogelijkheid van het leren en geheugen van de honingbij2,3,4 betrokken is. Differentially uitgedrukte genen en eiwitten zijn geïdentificeerd in verschillende hersengebieden van de honingbij5,6,7,8,9,10 ,11, suggereren dat ze gerelateerd zijn aan de unieke functies van elke regio van de hersenen. Hoewel de farmacologische remming of activering van een proteïne van belang een goed gebruikt aanpak is te onthullen van de functie van het eiwit in honingbij gedrag12,13,14, is het niet bekend of alle drugs functionele gevolgen hebben in verschillende gebieden van de hersenen van de honingbij. De validatie van de functies van dergelijke drugs zal versterken conclusies in studies van gedrags farmacologie.
Hier, richten we ons op PLC, één van de enzymen die betrokken zijn bij muis cognitie15,16,17,18. PLC triggers calcium signalering door vernederende phosphatidylinositol 4,5-difosfaat (PIP2) in inositol-1,4,5-trisphosphate (IP-3) en diacylglycerol (DAG)19,20,21. IP-3 opent IP-3 receptoren op het endoplasmatisch reticulum (ER), wat leidt tot de vrijlating van calciumionen uit de ER. Het vrijgegeven calcium activeert zowel calcium/Calmoduline-afhankelijk proteïne kinase II (CaMKII) met Calmoduline en proteïne kinase, C (PKC) in aanwezigheid van de DAG. Beide kinases eiwitten zijn betrokken bij het leren en geheugen22,23, consistent met de betrokkenheid van PLC in dit proces. NV's zijn onderverdeeld in subtypes, waaronder PLCβ, PLCγ en PLCε, op basis van hun structuren20. Elk subtype PLC is geactiveerd in een andere context20en genen coderend voor deze subtypen worden differentieel uitgedrukt in verschillende weefsels. Wij eerder aangetoond dat honingbij MBs express genen coderend voor PLCβ en PLCε subtypen op een hoger niveau dan de resterende hersenen regio's24, en dat twee pan-PLC-remmers (edelfosine en neomycine sulfaat [neomycine]) afnemen PLC activiteit in verschillende regio's brain en, inderdaad, invloed hebben op het leren en geheugen van de honingbij24.
Traditioneel, heeft de enzymatische activiteit van PLC is gemeten met behulp van radiolabeled PIP225, waarvoor passende opleiding, apparatuur en faciliteiten. Onlangs, een synthetische fluorogenic substraat van PLC geweest gevestigde26, waardoor het gemakkelijk is om te beoordelen PLC activiteit in het standaard laboratorium. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te detecteren PLC activiteit in verschillende hersengebieden van de honingbij met behulp van het substraat fluorogenic en vervolgens de remmende effecten van edelfosine en neomycine op PLC in deze weefsels te testen. Omdat het protocol alleen elementaire manipulaties vereist, kan zij toepassing op studies van PLC activiteiten in andere weefsels of hersengebieden in bijen toegewezen aan verschillende sociale taken worden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:479px;" width="478">
	<tbody>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:113px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">23227</td>
			<td style="width:125px;">The reagent kit for measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:113px;">Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23209</td>
			<td style="width:125px;">The standard samples used in BCA assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">Paraffin wax</td>
			<td style="width:101px;">GC</td>
			<td>13B1X00155000141</td>
			<td style="width:125px;">Dental wax used as dissection stage</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">Insect pin</td>
			<td style="width:101px;">Shiga</td>
			<td>No. 0</td>
			<td style="width:125px;">Stainless, solid head</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">PLCglow</td>
			<td style="width:101px;">KXT Bio</td>
			<td>KCH-0001</td>
			<td style="width:125px;">A fluorogenic substrate of PLC</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:113px;">384-well microplate</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td>4511</td>
			<td style="width:125px;">Low-volume, round-bottom plate in black color</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:113px;">Gemini EM microplate reader</td>
			<td style="width:101px;">Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td style="width:125px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">Edelfosine</td>
			<td style="width:101px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-201021</td>
			<td style="width:125px;">pan-PLC inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:113px;">Neomycin sulfate</td>
			<td style="width:101px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-3573</td>
			<td style="width:125px;">pan-PLC inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of phospholipase c activity in the brain homogenate from the honeybee

De honingbij is een modelorganisme voor het evalueren van complexe gedrag en hogere hersenfunctie, zoals leren, geheugen en verdeling van de arbeid. De paddestoel lichaam (MB) is een hogere hersenen centrum voorgesteld als de neurale substraat van complexe honingbij gedrag. Hoewel eerdere studies geïdentificeerd genen en proteïnen die differentieel op de MBs en andere hersengebieden worden uitgedrukt, zijn de activiteiten van de eiwitten in elke regio nog niet volledig begrepen. Om weer te geven van de functies van deze eiwitten in de hersenen, farmacologische analyse is een haalbare aanpak, maar is het eerst nodig om te bevestigen dat farmacologische manipulaties inderdaad veranderen als u de activiteit van het eiwit in deze hersengebieden.
Wij eerder een hogere uitdrukking van genen coderend voor phospholipase C (PLC's) in de MBs dan in andere hersengebieden, en farmacologisch beoordeeld de betrokkenheid van PLC in het gedrag van de honingbij. In deze studie, wij biochemically twee farmacologische agenten getest en bevestigd dat ze PLC activiteit in de MBs en andere hersengebieden daalde. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van hoe te detecteren PLC activiteit in honingbij hersenen homogenaat. In dit systeem assay homogenates afgeleid van verschillende hersengebieden zijn reageerde met een synthetische fluorogenic substraat en fluorescentie die voortvloeien uit de activiteit van de PLC is gekwantificeerd en vergeleken tussen hersengebieden. Ook beschrijven we onze evaluatie van de remmende effecten van bepaalde drugs op de activiteit van de PLC met behulp van hetzelfde systeem. Hoewel dit systeem waarschijnlijk beïnvloed door andere endogene fluorescentie-verbindingen en/of de absorptie van de onderdelen van de test en de weefsels is, de meting van de activiteit van de PLC met behulp van dit systeem is veiliger en gemakkelijker dan dat het gebruik van de traditionele bepaling, die vereist radiolabeled substraten. De eenvoudige procedure en de manipulaties laten te onderzoeken PLC activiteit in de hersenen en andere weefsels van honingbijen die betrokken zijn bij verschillende sociale taken.

De concentraties van de eiwitten in de hersenen Homogenates: Wij homogenates met behulp van forager bijen. De berekende eiwit-concentraties in de oorspronkelijke homogenates zijn afgebeeld in Figuur 3. De geschatte eiwit-concentraties in de oorspronkelijke homogenaat waren als volgt: 1,5 mg/mL in de MBs en 2.3 mg/mL in andere hersengebieden. We gebruikten twee bijen per partij en zes veel werden geanalyseerd.
<p class="jove_content" fo...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee at JoVE.com

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Detectie van Phospholipase C activiteit in de hersenen homogenaat van de honingbij

Om te testen de remmende effecten van farmacologische agenten op phospholipase C (PLC) in verschillende gebieden van de hersenen van de honingbij, presenteren we een biochemische assay voor het meten van de PLC activiteit in die regio's. Deze bepaling zou kunnen zijn handig voor het vergelijken van PLC activiteit onder weefsels, alsook tussen de bijen verschillende gedragingen vertonen.

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurowetenschappen, zoals of en hoe PLC-activiteiten in verschillende hersengebieden betrokken zijn bij de hersenfunctie van de honingbij. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat onderzoekers gemakkelijk een experiment met de standaard laboratoriumfaciliteiten kunnen voorvormen aangezien dit protocol slechts basismanipulaties vereist. Om te beginnen plaatst u een 50 ml buis met honingbijen 30 minuten op ijs om de bijen te verdoven. Bereid vervolgens de dissectiefase door een stuk tandwas doormidden te vouwen en in een plastic schaal te plaatsen. Gebruik onder een verrekijkermicroscoop een pincet om het hoofd van de bij van zijn lichaam te scheiden. Bevestig vervolgens het hoofd op de tandwas en steek insectenspelden in aan de basis van elke antenne om het interieur van het hoofd in een opwaartse positie te houden. Giet vervolgens voldoende zoutoplossing over het hoofd om het te bedekken. Met behulp van een pincet verwijder de antenne. Gebruik hierna een scalpel om een horizontale snede te maken in de buurt van de basissen van de antenne en een longitudinale snede aan de rand van de samengestelde ogen. Maak een horizontale snede aan de bovenkant van het hoofd en verwijder de cuticula om een venster over de hersenen te openen. Gebruik vervolgens een pincet om het retinoog uit de ossicle en de trache van het binnenoppervlak van de hersenen te verwijderen. Steek vervolgens de pincet direct onder de oogsnoekje om het bindweefsel tussen de nagelriem van de samengestelde ogen en retin oog te verwijderen. Verwijder daarna de cuticula en retin oog van de samengestelde ogen. Gebruik vervolgens de pincet om de resterende trache voorzichtig te verwijderen uit het binnenoppervlak van de hersenen. Snijd vervolgens het bindweefsel tussen de hersenen en rond de weefsels en ontleed de hersenen uit de hoofdcapsule. Met behulp van de pincet, schil de trache af van het achterste oppervlak van de hersenen. Gebruik dan een scalpel om de verbinding tussen de paddestoel lichamen of MB's en andere hersengebieden naast de verticale lobben snijden. Plaats de ontleed MB's en eventuele resterende hersenweefsels in 1,5 ml buizen en vries ze snel in met droogijs. Voeg eerst 10 ml homogenisatiebuffer toe aan het bevroren hersenweefsel. Gebruik een plastic peselle om het weefsel handmatig in de buis van 1,5 ml te homogeniseren. Breng hierna de gehomogeniseerde weefseloplossing over naar het volgende weefsel in de partij en herhaal het homogenisatieproces. Voeg vervolgens 30 toe

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; en<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Gepersonaliseerd Peptide Arrays voor detectie van HLA Alloantibodies in orgaantransplantatie

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Een colorimetrische methode voor het meten van ijzergehalte in planten

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33 de Redox-gereglementeerde Chaperone activiteit definiëren en in kaart brengen van de wijzigingen van de conformationele op Hsp33 met behulp van spectrometrie van de massa van de Exchange waterstof-deuterium

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie over het metabolisme van zes systemische insecticiden in een nieuw opgerichte cel schorsing cultuur afgeleid van thee (Camellia sinensis L.) Bladeren

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Het vertalen van ribosome Affiniteits zuivering (TRAP) voor RNA-isolatie van endotheel cellen in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende entiteiten (SUBEs) als hulpmiddelen voor de verrijking, isolatie, identificatie en karakterisering van de SUMO proteome in leverkanker

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Gebruik van Grafix voor de detectie van transiënte interactoren van Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexen

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...