Name: detection of phospholipase c activity in the brain homogenate from the honeybee
Uploaded: 2018-09-14T13:30:00
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Figura 4B - 4D è stata modificata da Suenami et al. 24 con il permesso della biologia Open. Gli autori sono grati all'editore per l'autorizzazione. Questo lavoro è stato supportato da Human Frontier Science Program (RGY0077/2016) a Shota Suenami e Ryo Miyazaki.

1. acquisizione delle api bottinatrici
<ol><li>Acquisto di colonie di API da un distributore locale.</li>
	<li>Utilizzando una rete dell'insetto, prendere le API forager che tornano all'alveare con i sacchetti di polline sulle zampe posteriori. Trasferire le API a un tubo conico in plastica da 50 mL standard e richiudere la provetta (Figura 1). Inserire il tubo sul ghiaccio per anestetizzare le API. Nota: Indossare le giacche designate per l'apicoltura evitare punture di API. Profession...

<ol>
	<li>Winston, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of the Honey Bee. , (1991).</li><li>Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+and+non-associative+plasticity+in+Kenyon+cells+of+the+honeybee+mushroom+body.">Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).</li><li>M&#252;&#223;ig, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+disruption+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR1+in+the+honeybee+brain+selectively+impairs+memory+formation.">Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).</li><li>Devaud, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrate+for+higher-order+learning+in+an+insect:+mushroom+bodies+are+necessary+for+configural+discriminations.">Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).</li><li>Gr&#252;nbaum, L., M&#252;ller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+specific+olfactory+memory+leads+to+a+long-lasting+activation+of+protein+kinase+C+in+the+antennal+lobe+of+the+honeybee.">Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).</li><li>Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrated+expression+of+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+and+protein+kinase+C+in+the+mushroom+bodies+of+the+brain+of+the+honeybee+Apis+mellifera+L.">Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L.</a> The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).</li><li>Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+profiling+of+central+nervous+system+regions+in+three+species+of+honey+bee+during+dance+communication+behavior.">Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior.</a> PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).</li><li>Kaneko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+analysis+of+the+expression+of+futsch,+tau,+and+MESK2+homologues+in+the+brain+of+the+European+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.).</a> PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).</li><li>Kaneko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+middle-type+Kenyon+cells+in+the+honeybee+brain+revealed+by+area-preferential+gene+expression+analysis.">Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis.</a> PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).</li><li>Pasch, E., Muenz, T. S., R&#246;ssler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+is+differentially+localized+in+synaptic+regions+of+kenyon+cells+within+the+mushroom+bodies+of+the+honeybee+brain.">CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain.</a> The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).</li><li>Suenami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+differentiation+of+Kenyon+cell+subtypes+using+three+mushroom+body-preferential+genes+during+metamorphosis+in+the+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.).</a> PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).</li><li>Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+early+olfactory+processing+by+an+octopaminergic+reinforcement+pathway+in+the+honeybee.">Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).</li><li>Matsumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-gated+channels,+calmodulin,+adenylyl+cyclase,+and+calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+are+required+for+late,+but+not+early,+long-term+memory+formation+in+the+honeybee.">Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee.</a> Learning &amp; Memory. 21 (5), 272-286 (2014).</li><li>Scholl, C., K&#252;bert, N., Muenz, T. S., R&#246;ssler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+knockdown+affects+both+early+and+late+phases+of+olfactory+long-term+memory+in+the+honeybee.">CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee.</a> Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).</li><li>Miyata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+long-term+synaptic+depression+in+the+rostral+cerebellum+correlated+with+impaired+motor+learning+in+phospholipase+C+&#946;4+mutant+mice.">Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C &#946;4 mutant mice.</a> European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).</li><li>Koh, H. -. Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+social+behavior+and+sensorimotor+gating+in+mice+lacking+phospholipase+C&#946;1.">Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase C&#946;1.</a> Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).</li><li>Quan, W. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+behaviors+and+prepulse+inhibition+in+phospholipase+C&#949;-/-+mice.">Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase C&#949;-/- mice.</a> Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).</li><li>Rioult-Pedotti, M. -. S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+promotes+motor+cortex+plasticity+and+motor+skill+learning+via+PLC+activation.">Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).</li><li>Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+neurons:+molecular+mechanisms+and+cellular+consequences.">Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences.</a> Science. 268 (5208), 239-247 (1995).</li><li>Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipase+C&#949;+in+physiological+phosphoinositide+signaling+networks.">Role of phospholipase C&#949; in physiological phosphoinositide signaling networks.</a> Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).</li><li>Dusaban, S. S., Brown, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLC&#949;+mediated+sustained+signaling+pathways.">PLC&#949; mediated sustained signaling pathways.</a> Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).</li><li>Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetic+approaches+to+investigating+calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+function+in+plasticity+and+cognition.">Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).</li><li>Giese, K. P., Mizuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+protein+kinases+in+learning+and+memory.">The roles of protein kinases in learning and memory.</a> Learning &amp; Memory. 20 (10), 540-552 (2013).</li><li>Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+inhibition+of+phospholipase+C+in+the+brain+attenuates+early+memory+formation+in+the+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.).</a> Biology Open. 7 (1), (2018).</li><li>Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+phospholipase+C+encoded+by+the+norpA+gene+of+Drosophila+melanogaster.">Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).</li><li>Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorogenic,+small+molecule+reporter+for+mammalian+phospholipase+C+isozymes.">A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes.</a> ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).</li><li>Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+phosphatidylinositol+phosphodiesterase+in+the+head+of+a+Drosophila+visual+mutant,+norpA+(no+receptor+potential+A).">Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A).</a> The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).</li><li>Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLC&#946;3+mediates+cortactin+interaction+with+WAVE2+in+MCP1-induced+actin+polymerization+and+cell+migration.">PLC&#946;3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).</li><li>Fiala, A., M&#252;ller, U., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+downregulation+of+protein+kinase+A+during+olfactory+learning+using+antisense+technique+impairs+long-term+memory+formation+in+the+honeybee,+Apis+mellifera.">Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).</li><li>Thamm, M., Scheiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+in+honey+bees:+spatial+expression,+Amfor+gene+expression,+sucrose+responsiveness,+and+division+of+labor.">PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor.</a> The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).</li><li>Balfanz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+transmembrane+adenylyl+cyclases+from+the+honeybee+brain.">Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).</li><li>Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bifunctional+phospholipase+C+that+is+regulated+by+G&#945;12+and+stimulates+the+Ras/mitogen-activated+protein+kinase+pathway.">A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by G&#945;12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+membrane-associated,+fluorogenic+reporter+for+mammalian+phospholipase+C+isozymes.">A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).</li></ol>

L'esame biochimico della attività della proteina è profondamente importante per comprendere la segnalazione molecolare nel cervello, perché l'attività di un enzima è influenzata da varie molecole, quali substrati e inibitori e può, quindi, cambiare lungo con comportamento animale (ad es., apprendimento e memoria)5. Negli studi dell'ape mellifica, enzimi come la chinasi AMP ciclico-dipendente della proteina A, protein-chinasi GMP ciclico-dipendente, PKC, CaMKII fosforilato e adenilat...

L'ape europea (Apis mellifera L.) è un insetto eusociali e API femminile mostrano una riproduzione casta-dipendente ed età-dipendente divisione del lavoro. Ad esempio, nella casta sterile delle API che si riferisce come "lavoratori", i più giovani individui feed nidiate mentre quelli più vecchi foraggio nettare e polline fuori l' alveare1. Apprendimento e memoria capacità è criticamente importante nella vita dell'ape, perché api bottinatrici devono ripetutamente ad andare avanti e indietro tra fonti alimentari e loro nido e quindi comunicare le posizioni delle origini di buon cibo ai loro membri ancora in vita attraverso la danza comunicazione1. Gli studi precedenti hanno dimostrato che il MB, un centro superiore di cervello negli insetti, è coinvolto nella capacità di apprendimento e la memoria del honeybee2,3,4. Proteine e geni differenzialmente espressi sono stati identificati in varie regioni del cervello del honeybee5,6,7,8,9,10 ,11, suggerendo che sono collegate alle funzioni uniche di ogni regione del cervello. Sebbene l'inibizione farmacologica o l'attivazione di una proteina di interesse è un approccio ben utilizzato per rivelare la funzione della proteina dell'ape mellifica comportamento12,13,14, non si sa se tutti farmaci hanno effetti funzionali in diverse regioni del cervello dell'ape mellifica. La convalida delle funzioni di tali farmaci rafforzerà conclusioni negli studi di farmacologia comportamentale.
Qui, ci concentriamo su PLC, uno degli enzimi implicati in mouse cognizione15,16,17,18. PLC attiva segnalazione degradando fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2) in inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3) e diacilglicerolo (DAG)19,20,21calcio. IP3 apre recettori di3 IP il reticolo endoplasmatico (ER), che conduce al rilascio di ioni calcio dall'ER. Il calcio rilasciato attiva sia calcio/calmodulina-dipendente della proteina chinasi II (CaMKII) con calmodulina e protein chinasi C (PKC) in presenza di DAG. Entrambi chinasi di proteina sono coinvolti nell'apprendimento e nella memoria22,23, coerente con il coinvolgimento di PLC in questo processo. PLC sono suddivisi in sottotipi, tra cui PLCβ, PLCγ e PLCε, basato sulle loro strutture20. Ogni sottotipo PLC viene attivato in un contesto diverso20e geni che codificano per tali sottotipi sono differenzialmente espressi in tessuti differenti. Precedentemente abbiamo dimostrato che honeybee MBs esprimono geni che codificano per sottotipi PLCβ e PLCε a livelli più alti del restante cervello regioni24, e che due inibitori di pan-PLC (edelfosine e neomicina solfato [neomicina]) diminuiscono PLC attività in differenti regioni del cervello e, infatti, influenzare la capacità di apprendimento e la memoria del honeybee24.
Tradizionalmente, l'attività enzimatica di PLC è stato misurato usando radiomarcato PIP225, che richiede strutture, attrezzature e formazione adeguata. Recentemente, un substrato fluorogenico sintetico di PLC è stato stabilito26, rendendo facile valutare l'attività PLC in laboratorio standard. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per rilevare l'attività PLC nelle regioni differenti del cervello dell'ape usando il substrato fluorogenic e successivamente testare gli effetti inibitori di edelfosine e neomicina su PLC in questi tessuti. Poiché il protocollo richiede solo manipolazioni di base, può essere applicabile agli studi di PLC attività in altri tessuti o aree del cervello nelle API assegnate ai diversi compiti sociali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:479px;" width="478">
	<tbody>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:113px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">23227</td>
			<td style="width:125px;">The reagent kit for measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:113px;">Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23209</td>
			<td style="width:125px;">The standard samples used in BCA assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">Paraffin wax</td>
			<td style="width:101px;">GC</td>
			<td>13B1X00155000141</td>
			<td style="width:125px;">Dental wax used as dissection stage</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">Insect pin</td>
			<td style="width:101px;">Shiga</td>
			<td>No. 0</td>
			<td style="width:125px;">Stainless, solid head</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">PLCglow</td>
			<td style="width:101px;">KXT Bio</td>
			<td>KCH-0001</td>
			<td style="width:125px;">A fluorogenic substrate of PLC</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:113px;">384-well microplate</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td>4511</td>
			<td style="width:125px;">Low-volume, round-bottom plate in black color</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:113px;">Gemini EM microplate reader</td>
			<td style="width:101px;">Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td style="width:125px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">Edelfosine</td>
			<td style="width:101px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-201021</td>
			<td style="width:125px;">pan-PLC inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:113px;">Neomycin sulfate</td>
			<td style="width:101px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-3573</td>
			<td style="width:125px;">pan-PLC inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of phospholipase c activity in the brain homogenate from the honeybee

L'ape è un organismo modello per la valutazione di comportamenti complessi e funzioni cerebrali superiori, come apprendimento, memoria e divisione del lavoro. Il corpo del fungo (MB) è un centro superiore di cervello proposto per essere il substrato neurale dei comportamenti complessi dell'ape mellifica. Sebbene studi precedenti identificati geni e proteine differenzialmente espressi in MBs e altre regioni del cervello, l'attività delle proteine in ogni regione non sono ancora pienamente compreso. Per rivelare le funzioni di queste proteine nel cervello, analisi farmacologica sono un approccio fattibile, ma è prima necessario confermare che le manipolazioni farmacologiche infatti alterano l'attività della proteina in queste regioni del cervello.
Abbiamo precedentemente identificato un' più alta espressione di geni che codificano la fosfolipasi C (PLC) in MBs che in altre regioni del cervello e farmacologicamente valutato il coinvolgimento di PLC nel comportamento dell'ape mellifica. In quello studio, abbiamo biochimicamente testato due agenti farmacologici e confermato che hanno attività in diminuzione PLC in MBs e altre regioni del cervello. Qui, presentiamo una descrizione dettagliata di come rilevare attività PLC in omogeneato del cervello dell'ape mellifica. In questo sistema di dosaggio, omogeneati derivati dalle regioni differenti del cervello sono ha reagiti con un substrato fluorogenico sintetico e fluorescenza risultanti da attività PLC è quantificato e rispetto tra regioni del cervello. Inoltre descriviamo la nostra valutazione degli effetti inibitori di determinate droghe sulle attività del PLC utilizzando lo stesso sistema. Anche se questo sistema è probabilmente influenzata da altri composti endogeni fluorescenza e/o l'assorbanza dei tessuti e dei componenti di analisi, la misurazione dell'attività PLC utilizzando questo sistema è più sicuro e più facile che quello usando l'analisi tradizionale, che richiede substrati radioattivi. La procedura semplice e manipolazioni consentono di esaminare l'attività PLC nel cervello ed in altri tessuti delle API da miele coinvolti in diverse attività sociali.

Concentrazioni di proteina in omogeneati del cervello: Abbiamo preparato gli omogeneati usando le API foraggiere. Le concentrazioni di proteina calcolati in omogenati di originale sono mostrate in Figura 3. Le concentrazioni di proteina approssimativo nell'omogeneato originale erano come segue: 1,5 mg/mL in MBs e 2,3 mg/mL in altre regioni del cervello. Abbiamo usato due API per lotto e sei lotti sono stati analizzati.
<p class="jove_c...

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Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Rilevamento di attività della fosfolipasi C in omogeneato del cervello dall'ape

Per verificare gli effetti inibitori di agenti farmacologici sulla fosfolipasi C (PLC) in diverse regioni del cervello dell'ape mellifica, presentiamo un'analisi biochimica per misurare l'attività del PLC in quelle regioni. Questo test potrebbe essere utile per confrontare attività PLC tra tessuti, così come tra le API che esibiscono comportamenti diversi.

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze come se e come le attività PLC in diverse regioni cerebrali sono coinvolte nella funzione cerebrale dell'ape. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i ricercatori possono facilmente preformare un esperimento con le strutture di laboratorio standard in quanto questo protocollo richiede solo manipolazioni di base. Per iniziare, posizionare un tubo da 50 ml contenente api da miele sul ghiaccio per 30 minuti per anestetizzare le api. Successivamente, preparare la fase di dissezione piegando un pezzo di cera dentale a metà e posizionandolo in un piatto di plastica. Al microscopio binoculare, usa le pinzette per separare la testa dell'ape dal suo corpo. Quindi, fissare la testa sulla cera dentale e inserire spilli per insetti alla base di ogni antenna per tenere l'interno della testa in posizione verso l'alto. Quindi, versare abbastanza soluzione salina sopra la testa per coprirlo. Usando le pinzette rimuovere l'antenna. Dopo questo, usa un bisturi per fare un taglio orizzontale vicino alle basi dell'antenna e un taglio longitudinale al bordo degli occhi composti. Fai un taglio orizzontale nella parte superiore della testa e rimuovi la cuticola per aprire una finestra sul cervello. Successivamente, utilizzare una pinzetta per rimuovere l'occhio della retina dall'ossicolo e il trache dalla superficie interna del cervello. Quindi, inserire le pinzette direttamente sotto la cuticola oculare per rimuovere il tessuto connettivo tra la cuticola degli occhi composti e l'occhio retin. Successivamente, rimuovere la cuticola e l'occhio retin degli occhi composti. Quindi, utilizzare le pinzette per rimuovere con cura il trache rimanente dalla superficie interna del cervello. Quindi, tagliare il tessuto connettivo tra il cervello e intorno ai tessuti e sezionare il cervello dalla capsula della testa. Usando le pinzette, staccare il trache dalla superficie posteriore del cervello. Quindi usa un bisturi per tagliare la connessione tra i corpi dei funghi o gli MB e altre regioni cerebrali accanto ai lobi verticali. Posizionare gli MB sezionati e tutti i tessuti cerebrali rimanenti in tubi da 1,5 ml e congelarli rapidamente con ghiaccio secco. In primo luogo, aggiungere 10 ml di tampone di omogeneizzazione al tessuto cerebrale congelato. Utilizzare una peselle di plastica per omogeneizzare manualmente il tessuto nel tubo da 1,5 ml. Successivamente, trasferire la soluzione di tessuto omogeneizzato al tessuto successivo nel lotto e ripetere il processo di omogeneizzazione. Quindi, aggiungi 30

Research

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Biochemistry

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