Name: detection of phospholipase c activity in the brain homogenate from the honeybee
Uploaded: 2018-09-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee at JoVE.com

Figur 4B - 4 D ble endret fra Suenami et al. 24 med tillatelse fra biologi åpen. Forfatterne er takknemlig til utgiveren for tillatelse. Dette arbeidet ble støttet av den menneskelige Frontier Science Program (RGY0077/2016) Shota Suenami og Ryo Miyazaki.

1. ta av Foraging Honeybees
<ol><li>Kjøpe honeybee kolonier fra en forhandler.</li>
	<li>Bruker et insekt nettet, fange forager bier som til strukturen med pollen poser på deres bakben ben. Overføre bier til en standard 50 mL plast konisk rør og lue røret (figur 1). Legge røret på is til å bedøve bier. Merk: Bruk de angitte Jakkene for birøkt å unngå bie stikk. Sykepleie bier kan også samles avhengig av eksperimentet. For å fange sykepleier bier, observere bee's opptreden ...

<ol>
	<li>Winston, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of the Honey Bee. , (1991).</li><li>Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+and+non-associative+plasticity+in+Kenyon+cells+of+the+honeybee+mushroom+body.">Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).</li><li>M&#252;&#223;ig, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+disruption+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR1+in+the+honeybee+brain+selectively+impairs+memory+formation.">Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).</li><li>Devaud, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrate+for+higher-order+learning+in+an+insect:+mushroom+bodies+are+necessary+for+configural+discriminations.">Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).</li><li>Gr&#252;nbaum, L., M&#252;ller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+specific+olfactory+memory+leads+to+a+long-lasting+activation+of+protein+kinase+C+in+the+antennal+lobe+of+the+honeybee.">Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).</li><li>Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrated+expression+of+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+and+protein+kinase+C+in+the+mushroom+bodies+of+the+brain+of+the+honeybee+Apis+mellifera+L.">Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L.</a> The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).</li><li>Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+profiling+of+central+nervous+system+regions+in+three+species+of+honey+bee+during+dance+communication+behavior.">Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior.</a> PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).</li><li>Kaneko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+analysis+of+the+expression+of+futsch,+tau,+and+MESK2+homologues+in+the+brain+of+the+European+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.).</a> PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).</li><li>Kaneko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+middle-type+Kenyon+cells+in+the+honeybee+brain+revealed+by+area-preferential+gene+expression+analysis.">Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis.</a> PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).</li><li>Pasch, E., Muenz, T. S., R&#246;ssler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+is+differentially+localized+in+synaptic+regions+of+kenyon+cells+within+the+mushroom+bodies+of+the+honeybee+brain.">CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain.</a> The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).</li><li>Suenami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+differentiation+of+Kenyon+cell+subtypes+using+three+mushroom+body-preferential+genes+during+metamorphosis+in+the+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.).</a> PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).</li><li>Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+early+olfactory+processing+by+an+octopaminergic+reinforcement+pathway+in+the+honeybee.">Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).</li><li>Matsumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-gated+channels,+calmodulin,+adenylyl+cyclase,+and+calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+are+required+for+late,+but+not+early,+long-term+memory+formation+in+the+honeybee.">Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee.</a> Learning &amp; Memory. 21 (5), 272-286 (2014).</li><li>Scholl, C., K&#252;bert, N., Muenz, T. S., R&#246;ssler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+knockdown+affects+both+early+and+late+phases+of+olfactory+long-term+memory+in+the+honeybee.">CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee.</a> Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).</li><li>Miyata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+long-term+synaptic+depression+in+the+rostral+cerebellum+correlated+with+impaired+motor+learning+in+phospholipase+C+&#946;4+mutant+mice.">Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C &#946;4 mutant mice.</a> European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).</li><li>Koh, H. -. Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+social+behavior+and+sensorimotor+gating+in+mice+lacking+phospholipase+C&#946;1.">Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase C&#946;1.</a> Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).</li><li>Quan, W. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+behaviors+and+prepulse+inhibition+in+phospholipase+C&#949;-/-+mice.">Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase C&#949;-/- mice.</a> Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).</li><li>Rioult-Pedotti, M. -. S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+promotes+motor+cortex+plasticity+and+motor+skill+learning+via+PLC+activation.">Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).</li><li>Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+neurons:+molecular+mechanisms+and+cellular+consequences.">Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences.</a> Science. 268 (5208), 239-247 (1995).</li><li>Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipase+C&#949;+in+physiological+phosphoinositide+signaling+networks.">Role of phospholipase C&#949; in physiological phosphoinositide signaling networks.</a> Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).</li><li>Dusaban, S. S., Brown, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLC&#949;+mediated+sustained+signaling+pathways.">PLC&#949; mediated sustained signaling pathways.</a> Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).</li><li>Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetic+approaches+to+investigating+calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+function+in+plasticity+and+cognition.">Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).</li><li>Giese, K. P., Mizuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+protein+kinases+in+learning+and+memory.">The roles of protein kinases in learning and memory.</a> Learning &amp; Memory. 20 (10), 540-552 (2013).</li><li>Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+inhibition+of+phospholipase+C+in+the+brain+attenuates+early+memory+formation+in+the+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.).</a> Biology Open. 7 (1), (2018).</li><li>Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+phospholipase+C+encoded+by+the+norpA+gene+of+Drosophila+melanogaster.">Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).</li><li>Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorogenic,+small+molecule+reporter+for+mammalian+phospholipase+C+isozymes.">A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes.</a> ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).</li><li>Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+phosphatidylinositol+phosphodiesterase+in+the+head+of+a+Drosophila+visual+mutant,+norpA+(no+receptor+potential+A).">Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A).</a> The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).</li><li>Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLC&#946;3+mediates+cortactin+interaction+with+WAVE2+in+MCP1-induced+actin+polymerization+and+cell+migration.">PLC&#946;3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).</li><li>Fiala, A., M&#252;ller, U., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+downregulation+of+protein+kinase+A+during+olfactory+learning+using+antisense+technique+impairs+long-term+memory+formation+in+the+honeybee,+Apis+mellifera.">Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).</li><li>Thamm, M., Scheiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+in+honey+bees:+spatial+expression,+Amfor+gene+expression,+sucrose+responsiveness,+and+division+of+labor.">PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor.</a> The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).</li><li>Balfanz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+transmembrane+adenylyl+cyclases+from+the+honeybee+brain.">Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).</li><li>Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bifunctional+phospholipase+C+that+is+regulated+by+G&#945;12+and+stimulates+the+Ras/mitogen-activated+protein+kinase+pathway.">A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by G&#945;12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+membrane-associated,+fluorogenic+reporter+for+mammalian+phospholipase+C+isozymes.">A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).</li></ol>

Biokjemiske undersøkelse av protein aktivitet er svært viktig for å forstå molekylær signalering i hjernen, fordi aktiviteten til et enzym påvirkes av ulike molekyler, som underlag og hemmere, og kan dermed endre sammen med dyr atferd (f.eks, læring og hukommelse)5. I honeybee studier, er enzymer som syklisk AMP-avhengige protein kinase A, syklisk GMP-avhengige protein kinase, PKC, fosforylert CaMKII og adenylate cyclase rapportert å være ulikt uttrykt i ulike områder av hjernen...

Europeiske honeybee (APIene mellifera L.) er et eusocial insekt kvinnelige bier Vis caste-avhengige reproduksjon og alder-avhengige arbeidsdeling. For eksempel i sterilt kastesystemet av bier referert til som "arbeidere", mate yngre enkeltpersoner de han funderer mens eldre grovfôr nektar og pollen utenfor strukturen1. Læring og hukommelse evne er kritisk viktig i livet til honeybee, fordi sankere må gjentatte ganger går frem og tilbake mellom mat kilder og deres reir og deretter kommunisere plasseringen av god mat kilder til deres nestmates gjennom dans kommunikasjon1. Tidligere studier har vist at MB, en høyere hjernen sentrum i insekter, er involvert i læring og hukommelse evne til honeybee2,3,4. Ulikt uttrykt gener og proteiner er blitt identifisert i ulike områder av hjernen av honeybee5,6,7,8,9,10 ,11, noe som tyder på at de er knyttet til unike funksjoner av hver hjernen regionen. Men farmakologisk hemming eller aktivering av et protein av interesse er en godt brukt tilnærming til avsløre funksjonen av protein i honeybee atferd12,13,14, er det ukjent om alle medisiner har funksjonelle effekter i ulike områder av honeybee hjernen. Validering av funksjonene til slike legemidler vil styrke konklusjonene i studier av atferdsmessige farmakologi.
Her fokusere vi på PLC, en av enzymer innblandet i musen kognisjon15,16,17,18. PLC utløser kalsium signalering av nedverdigende phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) inn inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) og diacylglycerol (DAG)19,20,21. IP3 åpner IP3 reseptorer på det endoplasmatiske retikulum (ER), fører til utgivelsen av kalsiumioner fra ER. Utgitt kalsium aktiverer både kalsium/calmodulin-avhengige protein kinase II (CaMKII) med calmodulin og protein kinase C (PKC) i nærvær av DAG. Begge protein kinaser er involvert i læring og hukommelse22,23, konsekvent med involvering av PLC i denne prosessen. Foretak kategoriseres subtyper, inkludert PLCβ, PLCγ og PLCε, basert på deres strukturer20. Hver PLC undertype aktiveres i en annen sammenheng20, og gener som koder de subtyper uttrykkes ulikt i forskjellige vev. Vi viste tidligere at honeybee MBs express gener som koder PLCβ og PLCε subtyper på høyere nivå enn de resterende hjerne regioner24og at to pan-PLC hemmere (edelfosine og neomycin sulfate [neomycin]) redusere PLC aktivitet i forskjellige hjernen regioner og, faktisk, påvirke læring og hukommelse evne til honeybee24.
Tradisjonelt har den enzymatiske aktiviteten PLC blitt målt med radiolabeled PIP225, som krever hensiktsmessig opplæring, utstyr og fasiliteter. Nylig, et syntetisk fluorogenic substrat plc har vært etablert26, gjør det enkelt å vurdere PLC aktivitet i standard laboratoriet. Her presenterer vi en detaljert protokoll å oppdage PLC aktivitet i forskjellige hjernen regioner i honeybee bruker fluorogenic underlaget og deretter teste hemmende effekten av edelfosine og neomycin på PLC i disse vev. Fordi protokollen krever bare grunnleggende manipulasjoner, kan det være aktuelt å studier av PLC aktivitet i andre vev eller hjernen områder i bier tildelt forskjellige sosiale aktiviteter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:479px;" width="478">
	<tbody>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:113px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">23227</td>
			<td style="width:125px;">The reagent kit for measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:113px;">Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23209</td>
			<td style="width:125px;">The standard samples used in BCA assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">Paraffin wax</td>
			<td style="width:101px;">GC</td>
			<td>13B1X00155000141</td>
			<td style="width:125px;">Dental wax used as dissection stage</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">Insect pin</td>
			<td style="width:101px;">Shiga</td>
			<td>No. 0</td>
			<td style="width:125px;">Stainless, solid head</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">PLCglow</td>
			<td style="width:101px;">KXT Bio</td>
			<td>KCH-0001</td>
			<td style="width:125px;">A fluorogenic substrate of PLC</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:113px;">384-well microplate</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td>4511</td>
			<td style="width:125px;">Low-volume, round-bottom plate in black color</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:113px;">Gemini EM microplate reader</td>
			<td style="width:101px;">Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td style="width:125px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">Edelfosine</td>
			<td style="width:101px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-201021</td>
			<td style="width:125px;">pan-PLC inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:113px;">Neomycin sulfate</td>
			<td style="width:101px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-3573</td>
			<td style="width:125px;">pan-PLC inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of phospholipase c activity in the brain homogenate from the honeybee

Honeybee er en modell organisme for å vurdere komplekse atferd og høyere hjernefunksjon, for eksempel læring og hukommelse arbeidsdeling. Sopp kroppen (MB) er en høyere hjernen center foreslått å være nevrale underlaget komplekse honeybee atferd. Selv om tidligere studier identifisert gener og proteiner som er ulikt uttrykt i MBs og andre områder av hjernen, er aktiviteter proteinene i hver region ennå ikke fullt ut forstått. For å vise funksjonene av disse proteinene i hjernen, pharmacologic analyse er en mulig tilnærming, men det er først nødvendig for å bekrefte at pharmacologic manipulasjoner faktisk endre protein aktiviteten i disse områder av hjernen.
Vi tidligere identifisert en høyere uttrykket av gener som koder fosfolipase C (PLC) i MBs enn i andre områder av hjernen og vurdert farmakologisk involvering av PLC i honeybee atferd. I denne studien, vi biokjemisk testet to pharmacologic agenter og bekreftet at de redusert PLC aktivitet i MBs og andre områder av hjernen. Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av hvordan oppdage PLC aktivitet i honeybee hjernen homogenate. I denne analysen system, homogenates avledet fra forskjellige hjernen regioner er reagerte med en syntetisk fluorogenic substrat og fluorescens skyldes PLC aktivitet er kvantifisert og forhold mellom områder av hjernen. Også beskriver vi våre evaluering av hemmende effekten av visse legemidler PLC aktivitet bruker samme system. Selv om dette systemet er sannsynligvis påvirket av andre endogene fluorescens forbindelser og/eller absorbansen analysen komponentene og vev, måling av PLC aktivitet med dette systemet er tryggere og enklere enn det benytter tradisjonelle analysen, som krever radiolabeled underlag. Enkel prosedyre og manipulasjoner tillate oss å undersøke PLC aktivitet i hjernen og andre vev av honeybees involvert i ulike sosiale aktiviteter.

Protein konsentrasjonene i hjernen Homogenates: Vi forberedt homogenates bruker forager bier. De beregnede protein konsentrasjonene i den opprinnelige homogenates er vist i Figur 3. De omtrentlige protein konsentrasjonene i de opprinnelige homogenate var som følger: 1.5 mg/mL i MBs og 2,3 mg/mL i andre områder av hjernen. Vi brukte to bier per mye og seks mange ble analysert.
<...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee at JoVE.com

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Deteksjon av fosfolipase C aktivitet i hjernen Homogenate fra Honeybee

For å teste hemmende effekten av farmakologisk agenter på fosfolipase C (PLC) i ulike regioner av honeybee hjernen, presenterer vi en biokjemiske analysen for å måle PLC aktivitet i disse regionene. Denne analysen kan være nyttige for sammenligning PLC aktivitet blant vev, og bier viser forskjellige virkemåter.

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen nevrovitenskapfeltet, for eksempel om og hvordan PLC-aktiviteter i forskjellige hjerneregioner er involvert i hjernefunksjonen til honningbien. Den største fordelen med denne teknikken er at forskere enkelt kan forhåndsforme et eksperiment med standard laboratoriefasiliteter, da denne protokollen bare krever grunnleggende manipulasjoner. Til å begynne, legg et 50 ml rør som inneholder honningbier på is i 30 minutter for å bedøve biene. Deretter forbereder du disseksjonsstadiet ved å brette et stykke tannvoks i to og plassere den i en plastfat. Under et kikkert mikroskop, bruk pinsett for å skille biens hode fra kroppen. Deretter fikser du hodet på tannvoksen og setter inn insektpinner ved foten av hver antenne for å holde det indre av hodet i en oppadgående stilling. Hell deretter nok saltvannsløsning over hodet for å dekke den. Bruk pinsett fjerne antennen. Etter dette, bruk en skalpell for å lage et horisontalt kutt nær antennens baser og et langsgående kutt på grensen av de sammensatte øynene. Lag et horisontalt kutt på toppen av hodet og fjern skjellaget for å åpne et vindu over hjernen. Deretter bruker du pinsett for å fjerne retin øyet fra ossicle og trache fra den indre overflaten av hjernen. Deretter setter du pinsettene rett under øyesekaget for å fjerne bindevevet mellom skjellaget av de sammensatte øynene og retin øyet. Deretter fjerner du skjellaget og retin øyet av de sammensatte øynene. Deretter bruker du pinsettene til å forsiktig fjerne den gjenværende trache fra hjernens indre overflate. Deretter kutter bindevevet mellom hjernen og rundt vevet og dissekerer hjernen fra hodekapselen. Bruk pinsettene til å skrelle tracheen av hjernens bakre overflate. Bruk deretter en skalpell for å kutte forbindelsen mellom sopplegemer eller MBs og andre hjerneregioner ved siden av de vertikale fliker. Plasser dissekerte MB og eventuelle gjenværende hjernevev i 1,5 ml rør og frys dem raskt med tørris. Først legger du til 10 ml homogeniseringsbuffer til det frosne hjernevevet. Bruk en plastpesell til å homogenisere vevet manuelt i 1,5 ml røret. Etter dette overfører du den homogeniserte vevsløsningen til neste vev i tomten og gjentar homogeniseringsprosessen. Deretter legger du til 30

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Påvisning av pH-avhengig aktivitet av<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Anstand HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; og<em&gt; I Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Rensing av protein komplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Tilpasset peptid matriser for påvisning av HLA Alloantibodies i organtransplantasjon

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering gjenkjenning av LRRK2 aktivitet SDS-side med en fosfat-bindende kode

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Kolorimetrisk metode for å måle jerninnhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definere Hsp33's Redox regulert Anstandsdame aktivitet og kartlegging Conformational endringer på Hsp33 med Hydrogen-deuterium Exchange massespektrometri

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studier på metabolismen av seks systemiske insektmidler i en nylig etablert Cell suspensjon kultur avledet fra Tea (Camellia Sinensis L.) Blader

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for RNA Isolation fra endothelial celler in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheter (SUBEs) som verktøy for berikelse, isolasjon, identifisering og karakterisering av SUMO proteom i leverkreft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utnyttelse av Grafix for påvisning av forbigående interagere av Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...