Name: detection of phospholipase c activity in the brain homogenate from the honeybee
Uploaded: 2018-09-14T13:30:00
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Figura 4B - 4D foi modificado de Suenami et al . 24 com a permissão do aberto de biologia. Os autores são gratos ao Publicador para a permissão. Este trabalho foi apoiado pela humana Frontier Science Program (RGY0077/2016) para Shota Suenami e Ryo Miyazaki.

1. captura de abelhas operárias
<ol><li>Colônias de abelhas de compra de um distribuidor local.</li>
	<li>Usando uma rede do inseto, pega as abelhas campeiras que voltar para a colmeia com os sacos de pólen em suas patas. Transferir as abelhas para um padrão 50 mL tubo cônico de plástico e tampa do tubo (Figura 1). Colocar o tubo no gelo para anestesiar as abelhas. Nota: Use as jaquetas designadas para apicultura evitar picadas de abelha. Abelhas de enfermagem também podem ser co...

<ol>
	<li>Winston, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of the Honey Bee. , (1991).</li><li>Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+and+non-associative+plasticity+in+Kenyon+cells+of+the+honeybee+mushroom+body.">Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).</li><li>M&#252;&#223;ig, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+disruption+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR1+in+the+honeybee+brain+selectively+impairs+memory+formation.">Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).</li><li>Devaud, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrate+for+higher-order+learning+in+an+insect:+mushroom+bodies+are+necessary+for+configural+discriminations.">Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).</li><li>Gr&#252;nbaum, L., M&#252;ller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+specific+olfactory+memory+leads+to+a+long-lasting+activation+of+protein+kinase+C+in+the+antennal+lobe+of+the+honeybee.">Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).</li><li>Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrated+expression+of+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+and+protein+kinase+C+in+the+mushroom+bodies+of+the+brain+of+the+honeybee+Apis+mellifera+L.">Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L.</a> The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).</li><li>Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+profiling+of+central+nervous+system+regions+in+three+species+of+honey+bee+during+dance+communication+behavior.">Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior.</a> PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).</li><li>Kaneko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+analysis+of+the+expression+of+futsch,+tau,+and+MESK2+homologues+in+the+brain+of+the+European+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.).</a> PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).</li><li>Kaneko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+middle-type+Kenyon+cells+in+the+honeybee+brain+revealed+by+area-preferential+gene+expression+analysis.">Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis.</a> PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).</li><li>Pasch, E., Muenz, T. S., R&#246;ssler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+is+differentially+localized+in+synaptic+regions+of+kenyon+cells+within+the+mushroom+bodies+of+the+honeybee+brain.">CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain.</a> The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).</li><li>Suenami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+differentiation+of+Kenyon+cell+subtypes+using+three+mushroom+body-preferential+genes+during+metamorphosis+in+the+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.).</a> PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).</li><li>Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+early+olfactory+processing+by+an+octopaminergic+reinforcement+pathway+in+the+honeybee.">Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).</li><li>Matsumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-gated+channels,+calmodulin,+adenylyl+cyclase,+and+calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+are+required+for+late,+but+not+early,+long-term+memory+formation+in+the+honeybee.">Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee.</a> Learning &amp; Memory. 21 (5), 272-286 (2014).</li><li>Scholl, C., K&#252;bert, N., Muenz, T. S., R&#246;ssler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+knockdown+affects+both+early+and+late+phases+of+olfactory+long-term+memory+in+the+honeybee.">CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee.</a> Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).</li><li>Miyata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+long-term+synaptic+depression+in+the+rostral+cerebellum+correlated+with+impaired+motor+learning+in+phospholipase+C+&#946;4+mutant+mice.">Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C &#946;4 mutant mice.</a> European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).</li><li>Koh, H. -. Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+social+behavior+and+sensorimotor+gating+in+mice+lacking+phospholipase+C&#946;1.">Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase C&#946;1.</a> Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).</li><li>Quan, W. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+behaviors+and+prepulse+inhibition+in+phospholipase+C&#949;-/-+mice.">Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase C&#949;-/- mice.</a> Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).</li><li>Rioult-Pedotti, M. -. S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipase+C&#949;+in+physiological+phosphoinositide+signaling+networks.">Role of phospholipase C&#949; in physiological phosphoinositide signaling networks.</a> Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).</li><li>Dusaban, S. S., Brown, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLC&#949;+mediated+sustained+signaling+pathways.">PLC&#949; mediated sustained signaling pathways.</a> Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).</li><li>Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetic+approaches+to+investigating+calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+function+in+plasticity+and+cognition.">Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).</li><li>Giese, K. P., Mizuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+protein+kinases+in+learning+and+memory.">The roles of protein kinases in learning and memory.</a> Learning &amp; Memory. 20 (10), 540-552 (2013).</li><li>Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+inhibition+of+phospholipase+C+in+the+brain+attenuates+early+memory+formation+in+the+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.).</a> Biology Open. 7 (1), (2018).</li><li>Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+phospholipase+C+encoded+by+the+norpA+gene+of+Drosophila+melanogaster.">Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).</li><li>Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorogenic,+small+molecule+reporter+for+mammalian+phospholipase+C+isozymes.">A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes.</a> ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).</li><li>Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+phosphatidylinositol+phosphodiesterase+in+the+head+of+a+Drosophila+visual+mutant,+norpA+(no+receptor+potential+A).">Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A).</a> The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).</li><li>Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLC&#946;3+mediates+cortactin+interaction+with+WAVE2+in+MCP1-induced+actin+polymerization+and+cell+migration.">PLC&#946;3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).</li><li>Fiala, A., M&#252;ller, U., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+downregulation+of+protein+kinase+A+during+olfactory+learning+using+antisense+technique+impairs+long-term+memory+formation+in+the+honeybee,+Apis+mellifera.">Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).</li><li>Thamm, M., Scheiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+in+honey+bees:+spatial+expression,+Amfor+gene+expression,+sucrose+responsiveness,+and+division+of+labor.">PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor.</a> The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).</li><li>Balfanz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+transmembrane+adenylyl+cyclases+from+the+honeybee+brain.">Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).</li><li>Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bifunctional+phospholipase+C+that+is+regulated+by+G&#945;12+and+stimulates+the+Ras/mitogen-activated+protein+kinase+pathway.">A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by G&#945;12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+membrane-associated,+fluorogenic+reporter+for+mammalian+phospholipase+C+isozymes.">A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).</li></ol>

O exame bioquímico de atividade da proteína é profundamente importante para a compreensão molecular de sinalização no cérebro, porque a atividade de uma enzima é afectada por várias moléculas, tais como substratos e inibidores e pode, assim, mudar junto com comportamento animal (por exemplo, aprendizagem e memória)5. Em estudos de abelhas, enzimas como a adenilato ciclase, GMP cíclico-dependente da proteína quinase, PKC, CaMKII fosforilada e AMP cíclico-dependente da proteí...

A Europeu abelhas (Apis mellifera L.) é um inseto eusocial e abelhas femininas mostram reprodução da casta-dependente e dependente da idade de divisão do trabalho. Por exemplo, na casta estéril de abelhas, conhecido como "trabalhadores", indivíduos mais jovens alimentam as ninhadas quando mais velhos forragem néctar e pólen fora da colmeia1. Aprendizagem e memória capacidade é criticamente importante na vida da abelha, porque operárias devem repetidamente ir e voltar entre fontes de alimento e seu ninho e então comunicar os locais das fontes de boa comida para seus nestmates através da dança comunicação1. Estudos anteriores demonstraram que o MB, um centro maior do cérebro em insetos, está envolvida na aprendizagem e memória capacidade da abelha2,3,4. Genes diferencialmente expressos e proteínas foram identificadas em várias regiões do cérebro das abelhas5,6,7,8,9,10 ,11, sugerindo que eles estão relacionados com as funções exclusivas de cada região do cérebro. Embora a inibição farmacológica ou ativação de uma proteína de interesse é uma abordagem bem utilizada para revelar a função da proteína no comportamento de abelhas a12,13,14, é desconhecido se todos drogas. têm efeitos funcionais em diferentes regiões do cérebro de abelhas. A validação das funções dessas drogas reforçará as conclusões em estudos de farmacologia comportamental.
Aqui, focalizamos PLC, uma das enzimas implicadas no rato cognição15,16,17,18. Cálcio de gatilhos PLC sinalização degradando o fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) em inositol 1, 4,5-triphosphate (IP3) e diacilglicerol (DAG)19,20,21. IP3 abre receptores IP3 , sobre o retículo endoplasmático (ER), levando à liberação de íons cálcio da emergência. O cálcio liberado ativa tanto cálcio-dependente/calmodulina proteína quinase II (CaMKII) com calmodulina e proteína quinase C (PKC) na presença de DAG. Ambos quinases de proteína estão envolvidos na aprendizagem e memória22,23, consistente com o envolvimento de PLC neste processo. CLPs são classificados em subtipos, incluindo PLCβ, PLCγ e PLCε, com base em suas estruturas de20. Cada subtipo PLC é ativado em um contexto diferente de20, e os genes que codificam os subtipos são diferencialmente expressos em diferentes tecidos. Demonstramos anteriormente que a abelha MBs expressam genes que codificam os subtipos PLCβ e PLCε em níveis mais elevados do que o restante de regiões cerebrais24, e que dois inibidores de pan-PLC (edelfosine e neomicina sulfato [neomicina]) diminuem a atividade PLC em diferentes regiões do cérebro e, de fato, afetar a capacidade de aprendizagem e memória do abelha24.
Tradicionalmente, a atividade enzimática da PLC foi medida usando radiolabeled PIP225, que requer instalações, equipamento e treinamento apropriado. Recentemente, um substrato fluorogenic sintético de PLC tem sido estabelecida26, tornando mais fácil para avaliar a atividade PLC em laboratório padrão. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para detectar atividade PLC em regiões cerebrais diferentes da abelha utilizando o substrato fluorogenic e posteriormente testar os efeitos inibitórios da edelfosine e neomicina no PLC nestes tecidos. Porque o protocolo exige apenas manipulações básicas, pode ser aplicável aos estudos da atividade PLC em outros tecidos ou áreas do cérebro em abelhas atribuídas tarefas sociais diferentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:479px;" width="478">
	<tbody>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:113px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">23227</td>
			<td style="width:125px;">The reagent kit for measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:113px;">Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23209</td>
			<td style="width:125px;">The standard samples used in BCA assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">Paraffin wax</td>
			<td style="width:101px;">GC</td>
			<td>13B1X00155000141</td>
			<td style="width:125px;">Dental wax used as dissection stage</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">Insect pin</td>
			<td style="width:101px;">Shiga</td>
			<td>No. 0</td>
			<td style="width:125px;">Stainless, solid head</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">PLCglow</td>
			<td style="width:101px;">KXT Bio</td>
			<td>KCH-0001</td>
			<td style="width:125px;">A fluorogenic substrate of PLC</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:113px;">384-well microplate</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td>4511</td>
			<td style="width:125px;">Low-volume, round-bottom plate in black color</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:113px;">Gemini EM microplate reader</td>
			<td style="width:101px;">Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td style="width:125px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">Edelfosine</td>
			<td style="width:101px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-201021</td>
			<td style="width:125px;">pan-PLC inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:113px;">Neomycin sulfate</td>
			<td style="width:101px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-3573</td>
			<td style="width:125px;">pan-PLC inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of phospholipase c activity in the brain homogenate from the honeybee

A abelha é um organismo modelo para avaliação de comportamentos complexos e função cerebral, como aprendizagem, memória e divisão do trabalho. O corpo de cogumelo (MB) é um centro de cérebro superior proposto para ser o substrato neural dos comportamentos complexos da abelha. Embora estudos anteriores identificaram genes e proteínas diferencialmente expressas no MBs e outras regiões do cérebro, as atividades das proteínas em cada região não são ainda totalmente compreendidas. Para revelar as funções destas proteínas no cérebro, análise farmacológica é uma abordagem viável, mas é primeiro necessário para confirmar que manipulações farmacológicas de fato alteram a atividade de proteínas nestas regiões do cérebro.
Anteriormente, identificamos uma maior expressão dos genes que codificam a fosfolipase C (PLC) no MBs do que em outras regiões do cérebro e farmacologicamente avaliado o envolvimento do PLC no comportamento de abelhas. Nesse estudo, bioquimicamente testamos dois agentes farmacológicos e confirmou que eles diminuíram a atividade PLC no MBs e outras regiões do cérebro. Aqui, apresentamos uma descrição detalhada de como detectar atividade PLC na abelha cerebral homogeneizado. Neste sistema de ensaio, homogenates derivados de regiões diferentes do cérebro são reagiu com um substrato fluorogenic sintético, e fluorescência resultantes da actividade da PLC é quantificada e comparada entre regiões do cérebro. Também descrevemos a nossa avaliação dos efeitos inibitórios de certas drogas na atividade PLC, usando o mesmo sistema. Embora este sistema seja provável afetado por outros compostos endógenos fluorescência e/ou a absorção dos componentes do ensaio e tecidos, a medição da atividade PLC, usando este sistema é mais seguro e mais fácil do que usando o ensaio tradicional, que necessita de substratos radiolabeled. O procedimento simples e manipulações nos permitem examinar a atividade PLC no cérebro e outros tecidos das abelhas envolvidos nas diferentes tarefas sociais.

Concentrações de proteína no cérebro Homogenates: Estamos dispostos a homogenates usando abelhas campeiras. As concentrações de proteína calculada em homogenates o original são mostradas na Figura 3. As concentrações de proteína aproximado em homogeneizado o original foram como segue: 1,5 mg/mL no MBs e 2,3 mg/mL em outras regiões do cérebro. Nós usamos duas abelhas por lote e seis lotes foram analisados.
<p class="jove_c...

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Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Deteção da fosfolipase C atividade no cérebro Homogenate da abelha

Para testar os efeitos inibitórios dos agentes farmacológicos na fosfolipase C (PLC) em diferentes regiões do cérebro de abelhas, apresentamos um ensaio bioquímico para medir a atividade PLC nessas regiões. Este ensaio pode ser útil para comparar a atividade PLC entre os tecidos, assim como entre abelhas exibindo comportamentos diferentes.

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da neurociência, como se e como as atividades de PLC em diferentes regiões cerebrais estão envolvidas na função cerebral da abelha. A principal vantagem dessa técnica é que os pesquisadores podem facilmente pré-formar um experimento com as instalações de laboratório padrão, pois este protocolo requer apenas manipulações básicas. Para começar, coloque um tubo de 50ml contendo abelhas no gelo por 30 minutos para anestesiar as abelhas. Em seguida, prepare o estágio de dissecção dobrando um pedaço de cera dentária ao meio e colocando-o em um prato de plástico. Sob um microscópio binóculo, use pinças para separar a cabeça da abelha de seu corpo. Em seguida, fixar a cabeça na cera dentária e inserir pinos de inseto na base de cada antena para manter o interior da cabeça em uma posição ascendente. Em seguida, despeje solução salina suficiente sobre a cabeça para cobri-la. Usando pinças, remova a antena. Depois disso, use um bisturi para fazer um corte horizontal perto das bases da antena e um corte longitudinal na borda dos olhos compostos. Faça um corte horizontal na parte superior da cabeça e remova a cutícula para abrir uma janela sobre o cérebro. Em seguida, use pinças para remover o olho de retin da ossícula e a traqueia da superfície interior do cérebro. Em seguida, insira a pinça diretamente sob a cutícula dos olhos para remover o tecido conjuntivo entre a cutícula dos olhos compostos e o olho de retin. Depois disso, remova a cutícula e o olho de retin dos olhos compostos. Em seguida, use a pinça para remover cuidadosamente a traqueia restante da superfície interior do cérebro. Então, corte o tecido conjuntivo entre o cérebro e ao redor dos tecidos e disseca o cérebro da cápsula da cabeça. Usando a pinça, retire a traque da superfície posterior do cérebro. Em seguida, use um bisturi para cortar a conexão entre os corpos de cogumelos ou MBs e outras regiões cerebrais ao lado dos lóbulos verticais. Coloque os MBs dissecados e quaisquer tecidos cerebrais restantes em tubos de 1,5ml e congele-os rapidamente com gelo seco. Primeiro, adicione 10ml de tampão de homogeneização ao tecido cerebral congelado. Use uma peselle plástica para homogeneizar manualmente o tecido no tubo de 1,5ml. Depois disso, transfira a solução de tecido homogeneizado para o próximo tecido do lote e repita o processo de homogeneização. Em seguida, adicione 30

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Bioquímica

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Personalizado do Peptide matrizes para a deteção de aloanticorpos HLA no transplante de órgãos

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Um método colorimétrico para medir o teor de ferro nas plantas

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Estudo sobre o metabolismo de seis inseticidas sistêmicas em uma cultura de suspensão celular recém-estabelecida derivada do chá (Camellia sinensis L.) Folhas

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traduzindo a purificação de afinidade Ribossome (TRAP) para isolamento de RNA de células endoteliais in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Entidades vinculantes ao SUMO (SUBEs) como ferramentas para enriquecimento, isolamento, identificação e caracterização do Proteome SUMO em Câncer de Fígado

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilização de Grafix para a detecção de Interagentes Transintes de Saccharomyces cerevisiae Subcomplexos Spliceosome

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...