Name: detection of phospholipase c activity in the brain homogenate from the honeybee
Uploaded: 2018-09-14T13:30:00
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Figura 4B - 4D fue modificado de los pantanos et al. 24 con el permiso de Biología abierta. Los autores agradecemos a la editorial por el permiso. Este trabajo fue apoyado por el programa humano de ciencia frontera (RGY0077/2016) Shota Suenami y Ryo Miyazaki.

1. la captura de forrajeo de las abejas
<ol><li>Compra de colonias de abejas de un distribuidor local.</li>
	<li>Utilizando una red de insectos, atrapar las abejas del forager que vuelven a la colmena con las bolsas de polen en sus patas traseras. Transferencia de las abejas a un tubo cónico plástico estándar de 50 mL y la tapa del tubo (figura 1). Poner el tubo en hielo para anestesiar las abejas. Nota: Usar las chaquetas designadas para la apicultura evitar las picaduras de abeja. ...

<ol>
	<li>Winston, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of the Honey Bee. , (1991).</li><li>Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+and+non-associative+plasticity+in+Kenyon+cells+of+the+honeybee+mushroom+body.">Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).</li><li>M&#252;&#223;ig, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+disruption+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR1+in+the+honeybee+brain+selectively+impairs+memory+formation.">Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).</li><li>Devaud, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrate+for+higher-order+learning+in+an+insect:+mushroom+bodies+are+necessary+for+configural+discriminations.">Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).</li><li>Gr&#252;nbaum, L., M&#252;ller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+specific+olfactory+memory+leads+to+a+long-lasting+activation+of+protein+kinase+C+in+the+antennal+lobe+of+the+honeybee.">Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).</li><li>Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrated+expression+of+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+and+protein+kinase+C+in+the+mushroom+bodies+of+the+brain+of+the+honeybee+Apis+mellifera+L.">Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L.</a> The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).</li><li>Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+profiling+of+central+nervous+system+regions+in+three+species+of+honey+bee+during+dance+communication+behavior.">Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior.</a> PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).</li><li>Kaneko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+analysis+of+the+expression+of+futsch,+tau,+and+MESK2+homologues+in+the+brain+of+the+European+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.).</a> PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).</li><li>Kaneko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+middle-type+Kenyon+cells+in+the+honeybee+brain+revealed+by+area-preferential+gene+expression+analysis.">Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis.</a> PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).</li><li>Pasch, E., Muenz, T. S., R&#246;ssler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+is+differentially+localized+in+synaptic+regions+of+kenyon+cells+within+the+mushroom+bodies+of+the+honeybee+brain.">CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain.</a> The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).</li><li>Suenami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+differentiation+of+Kenyon+cell+subtypes+using+three+mushroom+body-preferential+genes+during+metamorphosis+in+the+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.).</a> PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).</li><li>Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+early+olfactory+processing+by+an+octopaminergic+reinforcement+pathway+in+the+honeybee.">Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).</li><li>Matsumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-gated+channels,+calmodulin,+adenylyl+cyclase,+and+calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+are+required+for+late,+but+not+early,+long-term+memory+formation+in+the+honeybee.">Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee.</a> Learning &amp; Memory. 21 (5), 272-286 (2014).</li><li>Scholl, C., K&#252;bert, N., Muenz, T. S., R&#246;ssler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+knockdown+affects+both+early+and+late+phases+of+olfactory+long-term+memory+in+the+honeybee.">CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee.</a> Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).</li><li>Miyata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+long-term+synaptic+depression+in+the+rostral+cerebellum+correlated+with+impaired+motor+learning+in+phospholipase+C+&#946;4+mutant+mice.">Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C &#946;4 mutant mice.</a> European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).</li><li>Koh, H. -. Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficits+in+social+behavior+and+sensorimotor+gating+in+mice+lacking+phospholipase+C&#946;1.">Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase C&#946;1.</a> Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).</li><li>Quan, W. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+behaviors+and+prepulse+inhibition+in+phospholipase+C&#949;-/-+mice.">Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase C&#949;-/- mice.</a> Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).</li><li>Rioult-Pedotti, M. -. S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+promotes+motor+cortex+plasticity+and+motor+skill+learning+via+PLC+activation.">Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).</li><li>Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+neurons:+molecular+mechanisms+and+cellular+consequences.">Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences.</a> Science. 268 (5208), 239-247 (1995).</li><li>Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipase+C&#949;+in+physiological+phosphoinositide+signaling+networks.">Role of phospholipase C&#949; in physiological phosphoinositide signaling networks.</a> Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).</li><li>Dusaban, S. S., Brown, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLC&#949;+mediated+sustained+signaling+pathways.">PLC&#949; mediated sustained signaling pathways.</a> Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).</li><li>Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+genetic+approaches+to+investigating+calcium/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+function+in+plasticity+and+cognition.">Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).</li><li>Giese, K. P., Mizuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+protein+kinases+in+learning+and+memory.">The roles of protein kinases in learning and memory.</a> Learning &amp; Memory. 20 (10), 540-552 (2013).</li><li>Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+inhibition+of+phospholipase+C+in+the+brain+attenuates+early+memory+formation+in+the+honeybee+(Apis+mellifera+L.).">Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.).</a> Biology Open. 7 (1), (2018).</li><li>Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+phospholipase+C+encoded+by+the+norpA+gene+of+Drosophila+melanogaster.">Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).</li><li>Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorogenic,+small+molecule+reporter+for+mammalian+phospholipase+C+isozymes.">A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes.</a> ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).</li><li>Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+phosphatidylinositol+phosphodiesterase+in+the+head+of+a+Drosophila+visual+mutant,+norpA+(no+receptor+potential+A).">Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A).</a> The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).</li><li>Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLC&#946;3+mediates+cortactin+interaction+with+WAVE2+in+MCP1-induced+actin+polymerization+and+cell+migration.">PLC&#946;3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).</li><li>Fiala, A., M&#252;ller, U., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+downregulation+of+protein+kinase+A+during+olfactory+learning+using+antisense+technique+impairs+long-term+memory+formation+in+the+honeybee,+Apis+mellifera.">Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).</li><li>Thamm, M., Scheiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKG+in+honey+bees:+spatial+expression,+Amfor+gene+expression,+sucrose+responsiveness,+and+division+of+labor.">PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor.</a> The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).</li><li>Balfanz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+transmembrane+adenylyl+cyclases+from+the+honeybee+brain.">Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).</li><li>Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bifunctional+phospholipase+C+that+is+regulated+by+G&#945;12+and+stimulates+the+Ras/mitogen-activated+protein+kinase+pathway.">A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by G&#945;12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+membrane-associated,+fluorogenic+reporter+for+mammalian+phospholipase+C+isozymes.">A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).</li></ol>

El examen bioquímico de la actividad de la proteína es profundamente importante para comprender la señalización molecular en el cerebro, porque la actividad de una enzima se ve afectada por varias moléculas, tales como sustratos e inhibidores y por lo tanto, puede cambiar a lo largo de con comportamiento animal (p. ej., aprendizaje y memoria)5. En los estudios de la abeja, enzimas tales como kinase de proteína dependiente de AMP cíclico A, proteína quinasa dependiente del GMP cíc...

La abeja europea (Apis mellifera L.) es un insecto eusocial, y las abejas hembra reproducción de castas dependientes y dependientes de la edad de división del trabajo. Por ejemplo, en la casta estéril de las abejas conocido como 'trabajadores', individuos más jóvenes alimentan las crías mientras que los más viejos de forraje néctar y polen fuera de la colmena1. Aprendizaje y la memoria de capacidad es de vital importancia en la vida de la abeja, porque forrajeros deben ir repetidamente hacia adelante y hacia atrás entre las fuentes de alimento y su nido y luego comunicar la ubicación de fuentes de comida a su similar a través del baile comunicación1. Estudios previos demostraron que los MB, un centro cerebral mayor en insectos, está implicado en la capacidad de aprendizaje y la memoria de la abeja2,3,4. Genes diferencialmente expresados y las proteínas se han identificado en varias regiones del cerebro de la abeja5,6,7,8,9,10 ,11, sugiriendo que están relacionados con las funciones únicas de cada región del cerebro. Aunque la inhibición farmacológica o activación de una proteína de interés es un método usado para revelar la función de la proteína en el comportamiento de las abejas12,13,14, no se sabe si todos los medicamentos tener efectos funcionales en diferentes regiones del cerebro de la abeja. La validación de las funciones de tales drogas fortalecerá conclusiones en estudios de farmacología conductual.
Aquí, nos centramos en PLC, una de las enzimas implicadas en el ratón cognición15,16,17,18. PLC activa calcio por degradación de fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2) en inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG)19,20,21. IP3 abre IP3 los receptores en el retículo endoplásmico (ER), conduce a la liberación de iones calcio de la ER. El calcio liberado activa dependiente de calcio/calmodulina quinasa II (CaMKII) calmodulina y proteína cinasa C (PKC) en presencia de DAG. Ambas proteínas quinasas están implicadas en el aprendizaje y la memoria22,23, coherente con la participación del PLC en este proceso. PLC ' s se dividen en subtipos, incluyendo PLCβ PLCγ y PLCε, basado en sus estructuras20. Cada subtipo PLC se activa en un contexto diferente de20, y los genes que codifican esos subtipos se expresan diferencialmente en diversos tejidos. Previamente demostramos que la abeja MBs expresarán genes que codifican los subtipos PLCβ y PLCε en niveles más altos que el resto de regiones cerebro24, y que dos inhibidores de la pan-PLC (edelfosine y neomicina sulfato [neomicina]) disminuyen la actividad PLC en diferentes regiones del cerebro y, de hecho, afectan la capacidad de aprendizaje y la memoria de la abeja24.
Tradicionalmente, se ha medido la actividad enzimática de PLC utilizando radiactivos PIP225, que requiere instalaciones, equipos y formación adecuada. Recientemente, un substrato sintético fluorógenos de PLC ha sido establecido26, haciéndolo fácil evaluar actividad de la PLC en el laboratorio estándar. Aquí, presentamos un protocolo detallado para detectar actividad de PLC en regiones diferentes del cerebro de la abeja con el sustrato fluorógenos y posteriormente probar los efectos inhibitorios de edelfosine y neomicina en PLC en estos tejidos. Debido a que el protocolo requiere solamente manipulaciones básicas, pueden ser aplicable a los estudios de actividad de la PLC en otros tejidos o áreas del cerebro en las abejas asignadas a diversas tareas sociales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:479px;" width="478">
	<tbody>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:113px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">23227</td>
			<td style="width:125px;">The reagent kit for measurement of protein concentration</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:113px;">Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL</td>
			<td style="width:101px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23209</td>
			<td style="width:125px;">The standard samples used in BCA assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">Paraffin wax</td>
			<td style="width:101px;">GC</td>
			<td>13B1X00155000141</td>
			<td style="width:125px;">Dental wax used as dissection stage</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">Insect pin</td>
			<td style="width:101px;">Shiga</td>
			<td>No. 0</td>
			<td style="width:125px;">Stainless, solid head</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">PLCglow</td>
			<td style="width:101px;">KXT Bio</td>
			<td>KCH-0001</td>
			<td style="width:125px;">A fluorogenic substrate of PLC</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:113px;">384-well microplate</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td>4511</td>
			<td style="width:125px;">Low-volume, round-bottom plate in black color</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:113px;">Gemini EM microplate reader</td>
			<td style="width:101px;">Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td style="width:125px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:113px;">Edelfosine</td>
			<td style="width:101px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-201021</td>
			<td style="width:125px;">pan-PLC inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:113px;">Neomycin sulfate</td>
			<td style="width:101px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-3573</td>
			<td style="width:125px;">pan-PLC inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of phospholipase c activity in the brain homogenate from the honeybee

La abeja es un organismo modelo para la evaluación de conductas complejas y funciones cerebrales superiores, como el aprendizaje, la memoria y la división del trabajo. El cuerpo de la seta (MB) es un centro mayor de cerebro propuesto para ser el sustrato neural de los comportamientos complejos de la abeja. Aunque estudios previos identificaron genes y proteínas que se expresan diferencialmente en los MBs y otras regiones cerebrales, las actividades de las proteínas en cada región no son entiende todavía completamente. Para descubrir las funciones de estas proteínas en el cerebro, análisis farmacológico es un método factible, pero es necesario para confirmar que las manipulaciones farmacológicas de hecho alteran la actividad de la proteína en estas regiones del cerebro.
Había identificado previamente una mayor expresión de genes que codifican la fosfolipasa C (PLC) en los MBs que en otras regiones del cerebro y evaluar farmacológicamente la participación del PLC en el comportamiento de las abejas. En ese estudio bioquímico había probado a dos agentes farmacológicos y confirmó que disminuyeron actividad PLC en el MBs y otras regiones del cerebro. Aquí, presentamos una descripción detallada de cómo detectar actividad PLC en homogeneizado de cerebro de la abeja. En este sistema de ensayo, homogenados derivados de regiones diferentes del cerebro se reaccionaron con un substrato sintético fluorógenos y fluorescencia resultantes de la actividad de la PLC es cuantificada y comparada entre regiones del cerebro. También Describimos nuestra evaluación de los efectos inhibitorios de ciertos fármacos sobre la actividad PLC utilizando el mismo sistema. Aunque este sistema probablemente afectados por otros compuestos endógenos de la fluorescencia o la absorbancia de los componentes del ensayo y los tejidos, la medición de la actividad de la PLC utilizando este sistema es más seguro y más fácil que eso usando el análisis tradicional, que requiere sustratos radiactivos. El procedimiento simple y manipulaciones nos permiten examinar la actividad PLC en el cerebro y otros tejidos de las abejas participan en diversas tareas sociales.

Concentraciones de proteína en homogenados de cerebro: Preparamos homogenados usando las abejas del forager. Las concentraciones de proteína calculada en homogenados original se muestran en la figura 3. Las concentraciones de proteína aproximada en el homogeneizado original fueron las siguientes: 1,5 mg/mL en el MBs y 2,3 mg/mL en otras regiones del cerebro. Hemos utilizado dos abejas por lote y se analizaron seis lotes.
<p class="j...

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Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Detección de actividad de fosfolipasa C en el homogeneizado de cerebro de la abeja

Para probar los efectos inhibitorios de agentes farmacológicos en la fosfolipasa C (PLC) en las diferentes regiones del cerebro de la abeja, presentamos un ensayo bioquímico para medir la actividad de la PLC en esas regiones. Este análisis podrían ser útil para comparar la actividad de la PLC entre los tejidos, así como entre las abejas exhibe diferentes comportamientos.

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como si y cómo las actividades del PLC en diferentes regiones del cerebro están involucrados en la función cerebral de la abeja melífera. La principal ventaja de esta técnica es que los investigadores pueden preformar fácilmente un experimento con las instalaciones de laboratorio estándar, ya que este protocolo requiere sólo manipulaciones básicas. Para comenzar, coloque un tubo de 50 ml que contenga abejas en hielo durante 30 minutos para anestesiar a las abejas. A continuación, prepare la etapa de disección doblando un trozo de cera dental por la mitad y colocándola en un plato de plástico. Bajo un microscopio binocular, usa pinzas para separar la cabeza de la abeja de su cuerpo. A continuación, fije la cabeza en la cera dental e inserte los pasadores de insectos en la base de cada antena para mantener el interior de la cabeza en una posición ascendente. A continuación, vierta suficiente solución salina sobre la cabeza para cubrirla. El uso de pinzas retire la antena. Después de esto, utilice un bisturí para hacer un corte horizontal cerca de las bases de la antena y un corte longitudinal en el borde de los ojos compuestos. Haga un corte horizontal en la parte superior de la cabeza y retire la cutícula para abrir una ventana sobre el cerebro. A continuación, usa pinzas para extraer el ojo de retin de la osícula y la tráquea de la superficie interior del cerebro. Luego, inserte las pinzas directamente debajo de la cutícula ocular para eliminar el tejido conectivo entre la cutícula de los ojos compuestos y el ojo retin. Después de eso, retire la cutícula y el ojo de retin de los ojos compuestos. A continuación, utilice las pinzas para eliminar cuidadosamente la tráquea restante de la superficie interior del cerebro. Luego, corta el tejido conectivo entre el cerebro y alrededor de los tejidos y disecciona el cerebro de la cápsula de la cabeza. Usando las pinzas, pela la tráquea de la superficie posterior del cerebro. Luego usa un bisturí para cortar la conexión entre los cuerpos de setas o MBs y otras regiones cerebrales junto a los lóbulos verticales. Coloque los MB diseccionados y los tejidos cerebrales restantes en tubos de 1,5 ml y congénelos rápidamente con hielo seco. Primero, agregue 10 ml de tampón de homogeneización al tejido cerebral congelado. Utilice una peselle de plástico para homogeneizar manualmente el tejido en el tubo de 1,5 ml. Después de esto, transferir la solución de tejido homogeneizado al siguiente tejido en el lote y repetir el proceso de homogeneización. A continuación, agregue 30

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

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Detección de la actividad dependiente del pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Acompañante HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; y<em&gt; En Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Investigación

Bioquímica

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

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Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

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In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

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Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Un método colorimétrico para medir el contenido de hierro en plantas

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Definición acompañante Regulación Redox actividad de Hsp33 y mapeo de cambios conformacionales en la Hsp33 mediante espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio

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Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

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Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

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Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para el aislamiento de ARN de células endoteliales in vivo

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SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

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Entidades de unión SUMO (SUBE) como herramientas para el enriquecimiento, aislamiento, identificación y caracterización del proteome SUMO en cáncer de hígado

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Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilización de Grafix para la detección de interactores transitorios de subcomplejos de Saccharomyces cerevisiae Spliceosome

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