Name: hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells
Uploaded: 2018-08-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells at JoVE.com

Dit werk werd gesteund met middelen uit de NIH (R21NS093199) en de UCLA ARC 3R's Award. Onze oprechte dank gaat uit naar het laboratorium van Dr. Harley Kornblum voor bepaling van de cellijnen HK301 en HK157. Wij danken ook UCLA weefsel pathologie Core laboratorium (TPCL) voor cryosectioning, geavanceerde licht microscopie/spectroscopie kern faciliteit (ALMS) in California Nanosystems Institute (CNSI) aan de UCLA voor gebruik van de confocal microscoop, UCLA Crump Instituut voor Moleculaire beeldvorming voor het gebruik van IVIS imaging systeem, UCLA moleculaire Instrumentation Center (MIC) voor het verstrekken van magnetische resonantie spectroscopie en Stroom Cytometry kern in Jonsson uitgebreide Cancer Center (JCCC) aan de UCLA voor het verstrekken van instrumentatie voor stroom Cytometry.

Alle menselijk weefsel collectie stappen werden uitgevoerd onder institutioneel goedgekeurde protocollen.
1. Thiolation van hyaluronzuur
Opmerking: Molaire ratio's zijn vermeld met betrekking tot het totale aantal carboxylaat groepen tenzij anders aangegeven.
<ol><li>Los 500 mg natrium hyaluronaat (HA, 500-750 kDa) bij 10 mg/mL in gedeïoniseerd, gedestilleerd water (DiH2van O) in een autoclaaf gesteriliseerd, 250 mL conische kolf. Roer de oplossing (~ ...

<ol>
	<li>Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-mimetic+3d+culture+platforms+allow+investigation+of+cooperative+effects+of+extracellular+matrix+features+on+therapeutic+resistance+in+glioblastoma.">Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma.</a> Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).</li><li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+multiforme:+the+terminator.">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBTRUS+statistical+report:+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2006+-+2010.">CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 - 2010.</a> Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).</li><li>Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microregional+extracellular+matrix+heterogeneity+in+brain+modulates+glioma+cell+invasion.">Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).</li><li>Zamecnik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+space+and+matrix+of+gliomas.">The extracellular space and matrix of gliomas.</a> Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).</li><li>Jadin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+expression+in+primary+and+secondary+brain+tumors.">Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors.</a> Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).</li><li>Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hyaluronan+in+glioma+invasion.">Role of hyaluronan in glioma invasion.</a> Cell adhesion &amp; migration. 2 (3), 202-207 (2008).</li><li>Pedron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+graded+hydrogels+for+preclinical+testing+of+glioblastoma+anticancer+therapeutics.">Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics.</a> MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).</li><li>Jiglaire, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+cultures+of+glioblastoma+in+three-dimensional+hydrogel+maintain+the+original+tumor+growth+behavior+and+are+suitable+for+preclinical+drug+and+radiation+sensitivity+screening.">Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening.</a> Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).</li><li>Florczyk, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+chitosan-hyaluronic+acid+scaffolds+as+a+mimic+of+glioblastoma+microenvironment+ECM.">Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM.</a> Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).</li><li>Day, A. J., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan-binding+proteins:+tying+up+the+giant.">Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).</li><li>Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+interferon+and+anti-CD44+antibody+on+mouse+glioma+invasiveness+in+vitro.">The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro.</a> Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+microenvironment.">The brain tumor microenvironment.</a> GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).</li><li>Gilg, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+hyaluronan+interactions+in+malignant+gliomas+and+their+drug-resistant+multipotent+progenitors.">Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors.</a> Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).</li><li>Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+hyaluronan+and+its+receptors+(CD44,+RHAMM)+regulate+the+activities+of+inflammation+and+cancer.">Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer.</a> Frontiers in immunology. 6, 201 (2015).</li><li>Varga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+invasion-related+extracellular+matrix+molecules+in+human+glioblastoma+versus+intracerebral+lung+adenocarcinoma+metastasis.">Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis.</a> Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).</li><li>Guo, W., Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signalling+during+tumour+progression.">Integrin signalling during tumour progression.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).</li><li>Bello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;v&#946;3+and+&#945;v&#946;5+integrin+expression+in+glioma+periphery.">&#945;v&#946;3 and &#945;v&#946;5 integrin expression in glioma periphery.</a> Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).</li><li>Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+treatment+for+glioblastoma:+integrin+inhibition.">A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition.</a> Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).</li><li>Chopra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmentation+of+integrin-mediated+mechanotransduction+by+hyaluronic+acid.">Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).</li><li>Kim, Y., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44-mediated+adhesion+to+hyaluronic+acid+contributes+to+mechanosensing+and+invasive+motility.">CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility.</a> Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).</li><li>Joo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+orthotopic+glioblastoma+xenograft+models+recapitulate+the+histopathology+and+biology+of+human+glioblastomas+in+situ.">Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ.</a> Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).</li><li>Oh, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+validation+of+personalized+treatment+strategy+based+on+genetic+characteristics+of+glioblastoma.">Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma.</a> PloS one. 9 (8), e103327 (2014).</li><li>Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glioma+cell+phenotype+in+3D+matrices+by+hyaluronic+acid.">Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).</li><li>Wang, C., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+3D+brain+tumor+model+to+elucidate+the+effects+of+matrix+stiffness+on+glioblastoma+cell+behavior+using+PEG-based+hydrogels.">Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels.</a> Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).</li><li>Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+modification+of+poly(ethylene+glycol)+hydrogels+for+tissue+engineering.">Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering.</a> Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).</li><li>Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+fragments:+an+information-rich+system.">Hyaluronan fragments: an information-rich system.</a> European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).</li><li>Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ellman's+reagent:+5,+5&#8242;-dithiobis+(2-nitrobenzoic+acid)-a+reexamination.">Ellman's reagent: 5, 5&#8242;-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination.</a> Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).</li><li>Jin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+hyaluronic+acid-poly+(ethylene+glycol)+hydrogels+via+Michael+addition:+An+injectable+biomaterial+for+cartilage+repair.">Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair.</a> Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+intracranial+brain+tumor+xenografts+with+subsequent+analysis+of+tumor+growth+and+response+to+therapy+using+bioluminescence+imaging.">Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging.</a> Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).</li></ol>

Generatie van reproduceerbare gegevens met behulp van dit systeem 3D cultuur vereist: 1) consistent-charges-thiolation van de HA, 2) de praktijk te komen tot efficiënte mengen van hydrogel precursoren en behandeling van hydrogel culturen om schade te voorkomen en 3) geoptimaliseerd zaaien dichtheid voor elke regel van de cel gebruikt.
Wanneer een bepaald gewicht percentage van HA in de hydrogel gewenst is, bepaalt de mate van thiolation van HA de dwarslijn dichtheid. Het is raadzaam om met be...

Driedimensionale (3D) cultuur systemen recapituleren interacties tussen cellen en hun omliggende extracellulaire matrix (ECM) in native weefsels beter dan hun tegenhangers van tweedimensionale (2D)1,2. Vooruitgang in weefselengineering hebben opgeleverd verfijnde, 3D cultuur platformen waarmee gecontroleerde onderzoeken naar 1) hoe chemische en fysische componenten van de matrix communicatie beïnvloeden cel gedrag en 2) de werkzaamheid van nieuwe therapeutische strategieën voor een aantal ziekten, waaronder kanker2. Terwijl in vitro modellen kunnen niet goed zijn voor systemische factoren, zoals de endocriene en immuun signalen, en dus niet volledig in vivo modellen vervangen, bieden ze verschillende voordelen met inbegrip van reproduceerbaarheid, experimentele controle, betaalbaarheid en snelheid. Hier beschrijven we het gebruik van hersenen-mimetische hydrogels in welke 3D culturen van tumor patiënt afkomstige hersencellen veel aspecten van tumor fysiologie, in het bijzonder, de dynamiek vangen van het verwerven van behandeling weerstand3. Vergeleken met andere methoden in vitro , vertegenwoordigen deze culturen beter in vivo de modellen van de tumor en klinische waarnemingen3.
Glioblastoma (GBM) is de meest frequente en dodelijke kanker van oorsprong in de hersenen, met een mediane overleving van slechts 1-2 jaar-4,5. In de afgelopen jaren hebben vele studies gericht op de invloed van tumor matrix milieu in GBM6,7,8. De unieke hersenen ECM is gemeld bij GBM cel migratie, proliferatie, en therapeutische weerstand6,7,8,9,10,11 , 12. hyaluronzuur (HA) is een overvloedige glycosaminoglycaan (GAG) in de hersenen, waar het interageert met andere GAGs en proteoglycans te vormen een hydrogel-achtige gaas13. Vele studies hebben gemeld HA overexpressie GBM tumoren en haar latere gevolgen voor kanker progressie8,9,13,14,15,16 ,17. Andere ECM-onderdelen ook invloed op GBM tumor groei en invasie6,7,15,18. Bijvoorbeeld, fibronectin en vitronectin, die zijn meestal overexpressie in GBM, induceren heterodimerization van cel oppervlakte integrine receptoren door binding aan de "RGD"-reeks en initiëren van complexe signalering cascades ter bevordering van de tumor survival19 2120, ,. Naast biochemische invloeden beïnvloeden fysische eigenschappen van de weefsels-matrix ook GBM progressie22,23.
Voortdurende verwerving van weerstand tegen therapieën is een van de belangrijkste drijfveren van GBM letaliteit4. Drugs veelbelovende resultaten in 2D of gliomasphere modellen hebben gefaald in latere dierstudies en klinische gevallen3, die aangeeft dat de effecten van microenvironmental factoren in belangrijke mate aan GBM tumor antwoord1 bijgedragen. Hoewel diermodellen een 3D bieden kunnen, fysiologisch geschikte communicatie naar xenografted patiënt cellen en genereren van klinisch relevante uitkomsten24,25, de complexiteit van de hersenen communicatie in vivo maakt het uitdagend om te bepalen welke functies, met inbegrip van cel-matrix interacties, zijn de sleutel tot specifieke biologische uitkomsten. Identificatie van nieuwe therapeutische doelen zullen profiteren van het gebruik van vereenvoudigde cultuur platforms waarin biochemische en biofysische eigenschappen worden gedefinieerd.
In tegenstelling tot de eerder gemelde biomaterial modellen van de GBM tumor communicatie26,27 , die echte orthogonale controle over afzonderlijke biochemische en fysieke kenmerken van de ECM, het biomaterial platform niet hebben bereikt gerapporteerde hier stelt ontkoppeling van de bijdragen van meerdere onafhankelijke functies GBM cel fenotype. Hier presenteren we een systeem van de HA-based, orthogonaal afstembare, hydrogel voor 3D cultuur van patiënt-afgeleide GBM cellen. Hydrogels bestaan uit twee polymeer onderdelen: 1) biologisch actieve HA en 2) biologisch inerte polyethyleenglycol (PEG). PEG is een veel gebruikte biocompatibel en hydrofiele materiaal met laag eiwitgehalte adsorptie en minimale immunogeniciteit28. Ongeveer 5% van glucuronic zuur wordt op HA kettingen zijn hier, matiemaatschappij met thiol-groepen om crosslinking aan een commercieel beschikbare 4-arm-PEG beëindigd met maleimides via Michael-type toevoeging. In zijn meest voorkomende vorm in het lichaam bestaat HA in ultrahoog moleculair gewicht (HMW) ketens. Hier, bijdraagt een lage mate van wijziging van HMW HA (500-750 kDa) tot de bescherming van inheemse interacties van HA en zijn cel receptoren, met inbegrip van CD4429. Door vervanging van PEG-thiol voor HA-thiol met behoud van een constante molaire verhouding van totale thiolen te maleimides, kan HA concentratie worden losgekoppeld van de mechanische eigenschappen van het resulterende hydrogels. Bovendien kunnen stoichiometrische besturingselementen worden gebruikt voor conjugaat van cysteïne-beëindigd peptiden aan een opgegeven gemiddelde aantal armen maleimide-beëindigd op elk 4-arm-PEG. Opneming van ECM-afgeleid, zelfklevende peptiden kan interacties met verschijnsel op gekweekte cellen, waardoor biochemische en chemische signalen getransduceerde1 zijn. Maleimide-thiol toevoeging vindt zeer snel plaats onder fysiologische omstandigheden, minimaliseren van de tijd die nodig is voor de cel inkapselen en maximaliseren voortbestaan van patiënt-afgeleide cellen. Bovendien hydrogel culturen kunnen worden behandeld als typische weefsel specimen en zijn compatibel met standaard karakterisering technieken waaronder westelijke bevlekken, stroom cytometry en immunofluorescentie kleuring. Het volgende protocol beschrijft de procedures voor het fabriceren van hydrogels, tot de oprichting van 3D culturen van patiënt-afgeleide GBM cellen en technieken voor biochemische analyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2204px;" width="2203">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pH meter</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:1579px;">Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Stir plate</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td>General lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Erlenmeyer flask (125mL)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">FB-501-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">dialysis tubes</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">21-152-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">2L polypropylene beaker</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">S01916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">sodium hyaluronan</td>
			<td style="width:136px;">Lifecore</td>
			<td style="width:121px;">HA700k-5</td>
			<td>500-750 kDa range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">PI-22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td style="width:136px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:121px;">130672-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">SA48-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Cystamine dihydrochloride</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">AC111770250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">BP172-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:368px;">Ellman&#39;s test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">D218200-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Deuterated water (deuterium oxide)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">AC166301000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">0.22&#181;m vacuum driven filter</td>
			<td style="width:136px;">CellTreat</td>
			<td style="width:121px;">229706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">P32080-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Hanks&#39; balanced salt saline (HBSS)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">MT-21-022-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">4-arm-PEG-maleimide</td>
			<td style="width:136px;">JenKem Technology</td>
			<td style="width:121px;">A7029-1</td>
			<td>molecular weight around 20kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">4-arm-PEG-thiol</td>
			<td style="width:136px;">JenKem Technology</td>
			<td style="width:121px;">A7039-1</td>
			<td>molecular weight around 20kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">L-Cysteine&#160;</td>
			<td style="width:136px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:121px;">C7880-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">RGD ECM mimetic peptide</td>
			<td style="width:136px;">Genscript Biotech</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td>Custom peptide with sequence &#34;GCGYGRGDSPG&#34;, N-terminal should be acetylated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">silicone molds</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">GBL664201-25EA</td>
			<td>Use razor blade to cut into single pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">complete culture medium</td>
			<td style="width:136px;">Various</td>
			<td style="width:121px;">Various</td>
			<td>DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25&#181;g/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">patient derived GBM cell</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">20G needle</td>
			<td style="width:136px;">BD medical</td>
			<td style="width:121px;">305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">1mL syringe</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">10mL syringe</td>
			<td style="width:136px;">BD medical</td>
			<td style="width:121px;">302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">RIPA Buffer</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">PI-89901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">protease/phosphatase inhibitor mini tablet</td>
			<td style="width:136px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:121px;">5892970001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">vortex shaker</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">12-814-5Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">70&#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">AC416785000</td>
			<td>Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">D-sucrose</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">NC9373881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td>Any General One with 5% CO2 and 37C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">fridge/freezer</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td>Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Disposable embedding molds</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Lyapholizer</td>
			<td style="width:136px;">Labconco</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td>Any -105C freeze dryers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">HEPES</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Amber vial</td>
			<td style="width:136px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:121px;">60912D-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Wide orifice pipette tips</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">9405120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">2-methylbutane</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">03551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells

Glioblastoma (GBM) is de meest voorkomende, maar meest dodelijke, centraal zenuwstelsel kanker. In de afgelopen jaren hebben vele studies gericht op hoe de extracellulaire matrix (ECM) van het unieke hersenen milieu, zoals hyaluronzuur (HA), GBM progressie en invasie vergemakkelijkt. Echter, de meeste in vitro cultuur modellen omvatten GBM cellen buiten de context van een ECM. Lymfkliertest xenografts GBM cellen worden vaak ook gebruikt. Echter, in vivo modellen maken het moeilijk om te isoleren van de bijdragen van de afzonderlijke functies van de complexe tumor communicatie gedrag van de tumor. Hier beschrijven we een HA hydrogel gebaseerde, driedimensionale (3D) cultuur platform waarmee onderzoekers te wijzigen onafhankelijk HA concentratie en stijfheid. Ultrahoog moleculair gewicht HA en polyethyleenglycol (PEG) omvatten hydrogels, die kruisverwijzende via Michael-type toevoeging in de aanwezigheid van levende cellen. 3D hydrogel culturen van patiënt-afgeleide GBM cellen tentoonstelling levensvatbaarheid en proliferatie tarieven zo goed als of beter dan, wanneer gekweekt als standaard gliomaspheres. De hydrogel systeem kunt ook opneming van ECM-mimetische peptides te isoleren van effecten van specifieke cel-ECM interacties. Hydrogels zijn optisch transparant zodat levende cellen kunnen worden beeld in 3D cultuur. Ten slotte zijn HA hydrogel culturen compatibel met standaardtechnieken voor moleculaire en cellulaire analyses, met inbegrip van PCR, het westelijke bevlekken en cryosectioning gevolgd door immunofluorescentie kleuring.

Voor elke partij van thiolated HA, moet de mate van thiolation worden geverifieerd met behulp van H1-NMR of van een Ellman test. HA wijziging volgens de procedure hier consequent genereert ~ 5% thiolation (gedefinieerd als de molaire verhouding van thiolen naar HA disachariden) (Figuur 1).
Opzetten van deze nieuwe cultuur platform vergt elk laboratorium om strenge testen ...

Watch this Scientific Journal Video about Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells at JoVE.com

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Hier presenteren we een protocol voor driedimensionale cultuur van glioblastoma patiënt-afgeleide cellen binnen orthogonaal afstembare biomaterialen ontworpen na te bootsen de hersenen-matrix. Deze aanpak biedt een in vitro, experimenteel platform die veel kenmerken van in vivo glioblastoma cellen meestal verloren in cultuur onderhoudt.

Hyaluronzuur gebaseerd Hydrogels voor 3-dimensionale cultuur van Glioblastoma patiënt-afgeleide cellen

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Micropatterned Oppervlakken aan hyaluronzuur Interacties met kanker cellen te bestuderen

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Fabricage van micropatterned Hydrogelen voor Neurale Cultuur Systems met behulp van Dynamic Mask Projectie Fotolithografie

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Een methode voor ovariële follikel Encapsulation en cultuur in een proteolytisch Afbreekbare 3 dimensionale systeem

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Alginaat Hydrogelen voor Three-Dimensional orgelcultuur van de eierstokken en eileiders

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Organotypische Collageen I Assay: een Smeedbaar Platform to Cell Gedrag beoordelen in een 3-dimensionale Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende celkweek systemen for Human Cultuur van de Cel: Human trofoblast cellen als een model

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

De synthese van RGD-gefunctionaliseerde Hydrogels als een instrument voor therapeutische toepassingen

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Light-gemedieerde Vorming en patroonvorming van hydrogels voor Cultuur van de Cel Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...