Name: hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells
Uploaded: 2018-08-24T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה במימון NIH (R21NS093199) ופרס של 3R UCLA קשת. תודתנו שנמנמתי ללכת למעבדה של ד ר הארלי קורנבלום למתן השורות תא HK301 ו- HK157. אנו מודים גם UCLA רקמות פתולוגיה הליבה מעבדה (TPCL) עבור cryosectioning, מתקן ליבה מתקדמות אור מיקרוסקופ/ספקטרוסקופיה (צדקה) ב קליפורניה Nanosystems המכון (CNSI) באוניברסיטת קליפורניה לשימוש של מיקרוסקופ קונפוקלי, UCLA Crump המכון הדמיה מולקולרית באמצעות מערכת הדמיה IVIS, UCLA מולקולרית מכשור מרכז (MIC) למתן ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית, ו Cytometry Core זרימה של Jonsson מקיף סרטן מרכז (JCCC) באוניברסיטת קליפורניה על מתן אינסטרומנטציה עבור זרימת cytometry.

כל השלבים אוסף רקמה אנושית בוצעו תחת פרוטוקולים המאושרות כמוסד.
1. Thiolation של חומצה היאלורונית
הערה: יחסי טוחנת מתוארים לגבי המספר הכולל של קבוצות carboxylate אלא אם צוין אחרת.
<ol><li>להמיס 500 מ"ג נתרן היאלורונית (HA, 500-750 kDa) ב 10 מ"ג/מ"ל במים מזוקקים, יונים (לשכפל2O) ב ה?...

<ol>
	<li>Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. , (2017).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-mimetic+3d+culture+platforms+allow+investigation+of+cooperative+effects+of+extracellular+matrix+features+on+therapeutic+resistance+in+glioblastoma.">Brain-mimetic 3d culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma.</a> Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).</li><li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+multiforme:+the+terminator.">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBTRUS+statistical+report:+primary+brain+and+central+nervous+system+tumors+diagnosed+in+the+United+States+in+2006+-+2010.">CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2006 - 2010.</a> Journal of Neuro-Oncology. 15 (6), 788-796 (2013).</li><li>Bellail, A. C., Hunter, S. B., Brat, D. J., Tan, C., Van Meir, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microregional+extracellular+matrix+heterogeneity+in+brain+modulates+glioma+cell+invasion.">Microregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36 (6), 1046-1069 (2004).</li><li>Zamecnik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+space+and+matrix+of+gliomas.">The extracellular space and matrix of gliomas.</a> Acta Neuropathologica. 110 (5), 435-442 (2005).</li><li>Jadin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+expression+in+primary+and+secondary+brain+tumors.">Hyaluronan expression in primary and secondary brain tumors.</a> Annals of translational medicine. 3 (6), (2015).</li><li>Park, J. B., Kwak, H. J., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hyaluronan+in+glioma+invasion.">Role of hyaluronan in glioma invasion.</a> Cell adhesion &amp; migration. 2 (3), 202-207 (2008).</li><li>Pedron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+graded+hydrogels+for+preclinical+testing+of+glioblastoma+anticancer+therapeutics.">Spatially graded hydrogels for preclinical testing of glioblastoma anticancer therapeutics.</a> MRS communications. 7 (3), 442-449 (2017).</li><li>Jiglaire, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+cultures+of+glioblastoma+in+three-dimensional+hydrogel+maintain+the+original+tumor+growth+behavior+and+are+suitable+for+preclinical+drug+and+radiation+sensitivity+screening.">Ex vivo cultures of glioblastoma in three-dimensional hydrogel maintain the original tumor growth behavior and are suitable for preclinical drug and radiation sensitivity screening.</a> Experimental cell research. 321 (2), 99-108 (2014).</li><li>Florczyk, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+chitosan-hyaluronic+acid+scaffolds+as+a+mimic+of+glioblastoma+microenvironment+ECM.">Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM.</a> Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).</li><li>Day, A. J., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan-binding+proteins:+tying+up+the+giant.">Hyaluronan-binding proteins: tying up the giant.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 4585-4588 (2002).</li><li>Wiranowska, M., Tresser, N., Saporta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+interferon+and+anti-CD44+antibody+on+mouse+glioma+invasiveness+in+vitro.">The effect of interferon and anti-CD44 antibody on mouse glioma invasiveness in vitro.</a> Anticancer Research. 18 (5A), 3331-3338 (1998).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+microenvironment.">The brain tumor microenvironment.</a> GLIA. 59 (8), 1169-1180 (2011).</li><li>Gilg, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+hyaluronan+interactions+in+malignant+gliomas+and+their+drug-resistant+multipotent+progenitors.">Targeting hyaluronan interactions in malignant gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors.</a> Clinical Cancer Research. 14 (6), 1804-1813 (2008).</li><li>Misra, S., Hascall, V. C., Markwald, R. R., Ghatak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+hyaluronan+and+its+receptors+(CD44,+RHAMM)+regulate+the+activities+of+inflammation+and+cancer.">Interactions between hyaluronan and its receptors (CD44, RHAMM) regulate the activities of inflammation and cancer.</a> Frontiers in immunology. 6, 201 (2015).</li><li>Varga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+invasion-related+extracellular+matrix+molecules+in+human+glioblastoma+versus+intracerebral+lung+adenocarcinoma+metastasis.">Expression of invasion-related extracellular matrix molecules in human glioblastoma versus intracerebral lung adenocarcinoma metastasis.</a> Zentralblatt fur Neurochirurgie. 71 (4), 173-180 (2010).</li><li>Guo, W., Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signalling+during+tumour+progression.">Integrin signalling during tumour progression.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 816-826 (2004).</li><li>Bello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;v&#946;3+and+&#945;v&#946;5+integrin+expression+in+glioma+periphery.">&#945;v&#946;3 and &#945;v&#946;5 integrin expression in glioma periphery.</a> Neurosurgery. 49 (2), 380-390 (2001).</li><li>Chamberlain, M. C., Cloughsey, T., Reardon, D. A., Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+treatment+for+glioblastoma:+integrin+inhibition.">A novel treatment for glioblastoma: integrin inhibition.</a> Expert review of neurotherapeutics. 12 (4), 421-435 (2012).</li><li>Chopra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmentation+of+integrin-mediated+mechanotransduction+by+hyaluronic+acid.">Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).</li><li>Kim, Y., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44-mediated+adhesion+to+hyaluronic+acid+contributes+to+mechanosensing+and+invasive+motility.">CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility.</a> Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).</li><li>Joo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+orthotopic+glioblastoma+xenograft+models+recapitulate+the+histopathology+and+biology+of+human+glioblastomas+in+situ.">Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ.</a> Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).</li><li>Oh, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+validation+of+personalized+treatment+strategy+based+on+genetic+characteristics+of+glioblastoma.">Translational validation of personalized treatment strategy based on genetic characteristics of glioblastoma.</a> PloS one. 9 (8), e103327 (2014).</li><li>Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glioma+cell+phenotype+in+3D+matrices+by+hyaluronic+acid.">Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).</li><li>Wang, C., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+3D+brain+tumor+model+to+elucidate+the+effects+of+matrix+stiffness+on+glioblastoma+cell+behavior+using+PEG-based+hydrogels.">Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels.</a> Molecular pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).</li><li>Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+modification+of+poly(ethylene+glycol)+hydrogels+for+tissue+engineering.">Bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogels for tissue engineering.</a> Biomaterials. 31 (17), 4639-4656 (2010).</li><li>Stern, R., Asari, A. A., Sugahara, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+fragments:+an+information-rich+system.">Hyaluronan fragments: an information-rich system.</a> European journal of cell biology. 85 (8), 699-715 (2006).</li><li>Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ellman's+reagent:+5,+5&#8242;-dithiobis+(2-nitrobenzoic+acid)-a+reexamination.">Ellman's reagent: 5, 5&#8242;-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)-a reexamination.</a> Analytical biochemistry. 94 (1), 75-81 (1979).</li><li>Jin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+hyaluronic+acid-poly+(ethylene+glycol)+hydrogels+via+Michael+addition:+An+injectable+biomaterial+for+cartilage+repair.">Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) hydrogels via Michael addition: An injectable biomaterial for cartilage repair.</a> Acta biomaterialia. 6 (6), 1968-1977 (2010).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+intracranial+brain+tumor+xenografts+with+subsequent+analysis+of+tumor+growth+and+response+to+therapy+using+bioluminescence+imaging.">Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging.</a> Journal of visualized experiments. 41, 3-7 (2010).</li></ol>

הדור של לשחזור נתונים באמצעות מערכת תלת-ממד תרבות זו דורשת: 1) עקבי thiolation אצווה-כדי-אצווה של HA, 2) תרגול כדי להשיג ערבוב של הידרוג מבשרי וטיפול יעיל של הידרוג תרבויות כדי למנוע נזק ו- 3) ממוטבים זריעה צפיפות עבור כל קו תא בשימוש.
כאשר אחוז משקל מסוים של HA היא הרצויה ב הידרוג, מידת t...

מערכות תלת מימד (3D) תרבות מסכם את הדברים אינטראקציות בין התאים שלהם שמסביב (ECM) מטריצה חוץ-תאית ברקמות מקורית יותר שלהם1,דו מימדי עמיתיהם (2D)2. החידושים הנדסת רקמות הניבו תרבות מתוחכם, 3D פלטפורמות המאפשרות מבוקרת חקירות רכיבים כימיים 1) איך של מטריקס microenvironment משפיעים על תא התנהגויות ו 2) היעילות של חדש טיפולית אסטרטגיות עבור מספר מחלות, כולל סרטן2. בעוד במבחנה מודלים יכול לזהותה, סיסטמי אותות האנדוקרינית ואת המערכת החיסונית, ולכן לא יכול להחליף לחלוטין ויוו מודלים, הם מספקים מספר יתרונות כולל הפארמצבטית, בקרה ניסויית, כל אחד מהחדרים מכיל ומהירות. כאן, אנו מתארים את השימוש hydrogels המוח-מימטי שבו תלת-ממד תרביות של תאים סרטניים במוח החולה-derived ללכוד היבטים רבים של פיזיולוגיה הגידול, בפרט, הדינמיקה של רכישת טיפול ההתנגדות3. לעומת שיטות אחרות במבחנה , תרבויות אלה כדאי מייצגים ויוו הגידול מודלים, מחקרים קליניים3.
גליובלסטומה (GBM) הוא הסרטן תכופים וקטלני ביותר שמקורם במוח, עם חציון ההישרדות של 1-2 שנים רק4,5. בשנים האחרונות, מחקרים רבים התמקדו השפעת הסביבה מטריקס הגידול ב- GBM-6,-7,-8. ECM המוח ייחודי דווחה להשפיע על נדידת תאים GBM, התפשטות והתנגדות טיפולית6,7,8,9,10,11 , 12. חומצה היאלורונית (HA) הוא גליקוזאמינוגליקן שופע (איסור פרסום) במוח, זה מקיים אינטראקציה עם אחרים GAGs ואיפה proteoglycans לטופס הידרוג דמוי רשת שינוי13. מחקרים רבים דיווחו על HA ביטוי בגידולים GBM והשלכותיה עוקבות על סרטן התקדמות8,9,13,14,15,16 ,17. רכיבים אחרים ECM להשפיע גם על GBM גידול וצמיחה של הפלישה6,7,15,18. לדוגמה, fibronectin ו vitronectin, אשר בדרך כלל overexpressed ב- GBM, לגרום heterodimerization של קולטני אינטגרין פני שטח התא דרך איגוד רצף "RGD" וליזום מורכבים cascades איתות המקדמים הגידול הישרדות19 20, ,21. מלבד השפעות הביוכימי, תכונות פיזיקליות של המטריקס רקמות להשפיע גם על GBM התקדמות22,23.
רכישת מתמיד של עמידות לטיפולים הוא אחד המניעים העיקריים של GBM קטלני4. סמים מציג תוצאות מבטיחות במודלים 2D או gliomasphere נכשלו מחקרים בבעלי חיים מאוחרים יותר, מקרים קליניים3, המציין כי ההשפעות של גורמים microenvironmental באופן משמעותי תרמו GBM הגידול תגובה1. בעוד מודלים בעלי חיים יכול לספק תלת-ממד, מבחינה פיזיולוגית המתאים microenvironment לתאים החולה xenografted ולהפיק24,תוצאות הרלוונטית קלינית25, המורכבות של המוח microenvironment ויוו הופך מאתגרת כדי לקבוע אילו תכונות, כולל אינטראקציות סלולרי-מטריקס, מפתח על ספציפי לתוצאות ביולוגי. זיהוי של מטרות טיפוליות חדשות ייהנו משימוש של פלטפורמות תרבות פשוטה שבה מוגדרים הביוכימי ומאפייני ביופיזיקלי.
בניגוד biomaterial שדווחה בעבר דגמי26,27 microenvironment הגידול GBM, אשר לא מתגשם נכון שליטה בתכונות הביוכימי ופיזית בודדים של ECM, פלטפורמת biomaterial אורתוגונלית סופגת מאפשר כאן דיווח על התרומות של תכונות עצמאיות מרובות פנוטיפ תאים GBM. כאן, אנו מציגים מערכת הידרוג מבוסס-HA, orthogonally tunable, לתרבות תלת-ממד של החולה-derived תאים GBM. Hydrogels נוצרות מתוך שני מרכיבים פולימריים: HA פעילים ביולוגית 1) ו- 2) ביולוגית אינרטי פוליאתילן גליקול (PEG). פג הוא חומר מסתיימים, הידרופילית בשימוש נרחב עם חלבון נמוכה ספיחה ו מינימלית immunogenicity28. כאן, כ- 5% של moieties חומצה גלוקורונית ב- HA שרשראות הן functionalized עם קבוצות תיול כדי לאפשר crosslinking כדי זמינים מסחרית 4-זרוע-יתד הסתיים עם maleimides באמצעות תוספת מסוג מיכאל. בצורתו הנפוצה ביותר בגוף, HA קיימת בשלשלאות משקל מולקולרי גבוה (HMW). כאן, רמה נמוכה של שינוי של HMW HA (500-750 kDa) מסייעת לשמירה על אינטראקציות מקורית של HA, קולטני התא שלה, כולל CD4429. על ידי החלפת פג-תיול HA-תיול תוך שמירה על יחס טוחנת קבועה של תיולים הכולל כדי maleimides, ריכוז HA יכול להיות decoupled מן התכונות המכאניות של hydrogels שנוצר. יתר על כן, הפקדים stoichiometric יכול לשמש כדי נזווג המסתיימת בציסטאין פפטידים למספר ממוצע מוגדר של הזרועות המסתיימת ב- maleimide על כל 4-זרוע-יתד. התאגדות של פפטידים נגזר ECM, דבק מאפשרת אינטראקציות עם אינטגרינים על תאים בתרבית, שדרכו אותות ביוכימיים וכימיים הן transduced1. תוספת Maleimide-תיול מתרחשת מהר מאוד בתנאים פיזיולוגיים, צמצום הזמן הנדרש תא כימוס, למקסם הישרדות של החולה-derived תאים. יתר על כן, תרבויות הידרוג יכולים להיות מטופלים כמו דגימות רקמה טיפוסי, עולים בקנה אחד עם טכניקות אפיון סטנדרטי כולל סופג המערבי, cytometry זרימה של immunofluorescence מכתים. הפרוטוקול הבא מתאר את נהלי בדיית hydrogels, הקמת תרבויות תלת-ממד של החולה-derived תאים GBM וטכניקות לניתוח הביוכימי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2204px;" width="2203">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pH meter</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td style="width:1579px;">Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Stir plate</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td>General lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Erlenmeyer flask (125mL)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">FB-501-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">dialysis tubes</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">21-152-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">2L polypropylene beaker</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">S01916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">sodium hyaluronan</td>
			<td style="width:136px;">Lifecore</td>
			<td style="width:121px;">HA700k-5</td>
			<td>500-750 kDa range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">PI-22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td style="width:136px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:121px;">130672-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">SA48-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">SS266-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Cystamine dihydrochloride</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">AC111770250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">BP172-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:368px;">Ellman&#39;s test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">D218200-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Deuterated water (deuterium oxide)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">AC166301000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">0.22&#181;m vacuum driven filter</td>
			<td style="width:136px;">CellTreat</td>
			<td style="width:121px;">229706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">P32080-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Hanks&#39; balanced salt saline (HBSS)</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">MT-21-022-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">4-arm-PEG-maleimide</td>
			<td style="width:136px;">JenKem Technology</td>
			<td style="width:121px;">A7029-1</td>
			<td>molecular weight around 20kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">4-arm-PEG-thiol</td>
			<td style="width:136px;">JenKem Technology</td>
			<td style="width:121px;">A7039-1</td>
			<td>molecular weight around 20kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">L-Cysteine&#160;</td>
			<td style="width:136px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:121px;">C7880-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">RGD ECM mimetic peptide</td>
			<td style="width:136px;">Genscript Biotech</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td>Custom peptide with sequence &#34;GCGYGRGDSPG&#34;, N-terminal should be acetylated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">silicone molds</td>
			<td style="width:136px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">GBL664201-25EA</td>
			<td>Use razor blade to cut into single pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">complete culture medium</td>
			<td style="width:136px;">Various</td>
			<td style="width:121px;">Various</td>
			<td>DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25&#181;g/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">patient derived GBM cell</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">20G needle</td>
			<td style="width:136px;">BD medical</td>
			<td style="width:121px;">305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">1mL syringe</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">10mL syringe</td>
			<td style="width:136px;">BD medical</td>
			<td style="width:121px;">302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">RIPA Buffer</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">PI-89901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">protease/phosphatase inhibitor mini tablet</td>
			<td style="width:136px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:121px;">5892970001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">vortex shaker</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">12-814-5Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">70&#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">AC416785000</td>
			<td>Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">D-sucrose</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">NC9373881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td>Any General One with 5% CO2 and 37C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">fridge/freezer</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td>Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Disposable embedding molds</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">12-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Lyapholizer</td>
			<td style="width:136px;">Labconco</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td>Any -105C freeze dryers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">HEPES</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Amber vial</td>
			<td style="width:136px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:121px;">60912D-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Wide orifice pipette tips</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">9405120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">2-methylbutane</td>
			<td style="width:136px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:121px;">03551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:121px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells

גליובלסטומה (GBM) הוא הסרטן הנפוץ ביותר, עדיין הקטלני ביותר, מערכת העצבים המרכזית. בשנים האחרונות, מחקרים רבים התמקדו איך מטריצה חוץ-תאית (ECM) של הסביבה המוח ייחודי, כדוגמת חומצה היאלורונית (HA), מקלה על התקדמות GBM, הפלישה. עם זאת, רוב במבחנה הדגמים תרבות כוללים תאים GBM מחוץ להקשר של ה-ECM. Xenografts מאתר של תאים GBM נמצאים בשימוש נפוץ גם כן. עם זאת, מודלים ויוו להקשות לבודד התרומות של תכונות בודדות של microenvironment הגידול מורכב להתנהגות הגידול. כאן, אנו מתארים פלטפורמה מבוססת הידרוג תלת מימדי (3D) תרבות HA זה מאפשר לחוקרים לשנות באופן עצמאי ריכוז HA וקשיחות. משקל מולקולרי גבוה HA, פוליאתילן גליקול (PEG) מהווים hydrogels, אשר תפור באמצעות תוספת מסוג מייקל בנוכחות תאים חיים. תרבויות הידרוג תלת-ממד של החולה-derived הכדאיות בנספח תאים GBM והתפשטות שיעורי כמו, או טוב יותר, כאשר תרבותי gliomaspheres כסטנדרט. מערכת הידרוג מאפשר גם התאגדות של פפטידים ECM-מימטי לבודד את ההשפעות של תאים ספציפיים-ECM אינטראקציות. Hydrogels שקופים שטיחות כך תאים חיים יכול לדימות בתרבות תלת-ממד. לבסוף, HA הידרוג תרבויות תואמים טכניקות סטנדרטי עבור ניתוחים מולקולרית, תאית, כולל PCR, סופג המערבי cryosectioning ואחריו immunofluorescence מכתים.

עבור כל אצווה של thiolated HA, מידת thiolation צריך אפשרות לאמת באמצעות H1-NMR או הבדיקה של אלמן. חה שינוי באמצעות ההליך שמתואר כאן באופן עקבי יוצר thiolation ~ 5% (המוגדר כיחס טוחנת תיולים כדי HA disaccharides) (איור 1).
הגדרה זו פלטפורמ?...

Watch this Scientific Journal Video about Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells at JoVE.com

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבות תלת מימדי של החולה-derived גליובלסטומה תאים בתוך orthogonally tunable biomaterials כחיקוי של מטריקס המוח. גישה זו מספקת במבחנה, פלטפורמה ניסיוני זה שומר על מאפיינים רבים של ויוו גליובלסטומה תאים בדרך כלל לאיבוד בתרבות.

חומצה היאלורונית מבוסס Hydrogels לתרבות תלת-ממדי של החולה-Derived גליובלסטומה תאים

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

משטחים micropatterned לחקר אינטראקציות חומצה היאלורונית עם תאים סרטניים

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

המצאה של הידרוג micropatterned למערכות התרבות עצבית באמצעות photolithography דינמי הקרנה מסכת

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

שיטה Encapsulation השחלות זקיק ותרבות מערכת 3 מתכלה Proteolytically מימדי

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

קולגן אני Assay Organotypic: פלטפורמה חשילה לבחינת התנהגות תא בהקשר 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

טיפוח האדם ובתאים עצבית ב Hydrogel עצמית להרכבת 3 מימדי פפטיד

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

הסינתזה של RGD פונקציונלית הידרוג ככלי יישומים טיפוליים

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...