Name: quantification of hypopigmentation activity in vitro
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها معهد كوريا لتخطيط وتقييم التكنولوجيا في مجال الأغذية والزراعة، والحراجة (إيبيت) من خلال "برنامج تطوير التكنولوجيا" الزراعية-الصناعة البيولوجية، تموله وزارة الزراعة والأغذية، والشؤون الريفية (مافرا ) (116159-02-2-WT011) ومدرسة علوم الحياة والتكنولوجيا الحيوية ل BK21 بالإضافة إلى ذلك، جامعة كوريا.

1-إعداد المتوسطة والمركبات والمواد الكاشفة
<ol><li>إعداد B16F10 المتوسطة كاملة النمو. تعديل الملحق دولبيكو المتوسطة النسر (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 1% البنسلين/ستربتوميسين (مكافحة الآفات).<ol>
<li>لجعل 500 مل متوسطة كاملة، مزيج مل 445 من المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) مع 50 مل من FBS و 5 مل من ال?...

<ol>
	<li>Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+controlling+the+migration+of+melanocytes+and+melanoma+cells.">Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin.">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).</li><li>Galvan, I., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+chemistry+and+the+ecology+of+stress.">Melanin chemistry and the ecology of stress.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).</li><li>Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+whitening+cosmetics:+Feedback+and+challenges+in+the+development+of+natural+skin+lighteners.">Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners.</a> Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).</li><li>Cooksey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+indirect+formation+of+the+catecholic+intermediate+substrate+responsible+for+the+autoactivation+kinetics+of+tyrosinase.">Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).</li><li>Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+identify+inhibitors+of+melanin+biosynthesis+via+the+quality+control+of+tyrosinase.">Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).</li><li>Gillbro, J. M., Olsson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanogenesis+and+mechanisms+of+skin-lightening+agents+-+existing+and+new+approaches.">The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches.</a> International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).</li><li>Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+in+the+study+of+human+skin+melanocytes.">Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes.</a> Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Momilactione+B+inhibits+protein+kinase+A+signaling+and+reduces+tyrosinase-related+proteins+1+and+2+expression+in+melanocytes.">Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes.</a> Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibitions+of+lemon+balm+(Melissa+officinalis)+ethanolic+extract+on+melanogenesis+in+B16-F1+murine+melanocytes:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+its+gene+expression.">Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression.</a> Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-Coumaric+acid+inhibition+of+CREB+phosphorylation+reduces+cellular+melanogenesis.">p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis.</a> European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibition+of+&#947;-oryzanol+on+cellular+melanogenesis:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+reduction+of+melanogenic+gene+expression+by+a+protein+kinase+a-dependent+mechanism.">Dual inhibition of &#947;-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism.</a> Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).</li><li>Choi, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+isoflavone+puerarin+and+its+glycosides+on+melanogenesis+in+B16+melanocytes.">Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes.</a> European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).</li><li>Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+reduces+cellular+melanin+content+via+suppression+of+microphthalmia-associated+transcription+factor+in+B16-F1+murine+melanocytes.">Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes.</a> Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).</li><li>Overwijk, W. W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B16+as+a+mouse+model+for+human+melanoma.">B16 as a mouse model for human melanoma.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+protocol+for+assessing+regulators+of+pigmentation.">A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation.</a> Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).</li><li>D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+melanogenesis.">Signaling pathways in melanogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).</li><li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage:+interactions+between+KIT+and+MITF.">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).</li><li>Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-MSH+and+melanogenesis+in+normal+human+adult+melanocytes.">&#945;-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).</li><li>Hu, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+evaluation+of+melanin+content+and+production+of+pigment+cells+in+vitro.">Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).</li><li>Carriel, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+histochemical+method+for+a+simultaneous+staining+of+melanin+and+collagen+fibers.">A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).</li></ol>

وقد عرضنا بروتوكولات لتقييم النشاط نقص التصبغ لاختبار المركبات باستخدام الخلايا الصباغية مثقف. وأظهرت نتائج الممثل أثر نقص التصبغ اربوتين، مثبط التيروزينات تثبيط التيروزينات النشاط والخلوية محتوى الميلانين. هذه الأساليب تستخدم على نطاق واسع في ميلانوجينيك مكافحة نشاط البحث. باستخدام ?...

الميلانين يلعب دوراً حاسما في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض، وعلم السموم للعديد من الأجهزة بما في ذلك الجلد والعيون، والدماغ1. المهام الرئيسية الميلانين تأثيرات الصور-الفحص والبيوكيميائية. يمتص الميلانين الخفيفة القريبة من الأشعة تحت الحمراء والمرئية فضلا عن إشعاع الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)، مع معدلات زيادة امتصاص عند أطوال موجية أقصر من الضوء؛ وهكذا، الميلانين تحمي الأنسجة من الأضرار التي يسببها الضوء المرئي أو الأشعة فوق البنفسجية الإشعاع2. الميلانين هو مضاد للأكسدة وقد تقارب للمعادن وغيرها من المواد الكيميائية السامة؛ ولذلك، يمكن أن تحمي الأنسجة من الإجهاد التأكسدي والكيميائية3. بيد الإفراط في إنتاج الميلانين يسبب مشاكل الأمراض الجلدية.
كمية ونوعية الميلانين في الجلد وقزحية العين هي أهم العوامل المحددة للون قزحية العين والجلد. قد يكون الأفراد تفضيلات لون البشرة المختلفة؛ لصالح بعض الجلد المدبوغة، بينما آخرون يفضلون ألوان البشرة أخف. اعتماداً على هذه التشكيلات الجانبية للمستهلك، استحدثت مستحضرات التجميل نقص التصبغ لإرضاء الأسواق الفردية للجلد يفضل الألوان4. وبناء على ذلك، دراسات النشاط نقص التصبغ ومكافحة ميلانوجينيك أهميتها علمياً وعملياً على حد سواء.
ميلانوجينيسيس هو عملية معقدة تخليق الميلانين الحيوي من خلال سلسلة من التفاعلات الكيميائية الانزيمية وعفوية في الخلايا الصباغية. الصباغية واحد محاط بحوالي 36 الكيراتينيه والصباغية الميلانين التوليف المصانع التي تقوم بتوزيع منتجاتها إلى الكيراتينيه المجاورة. في الجلد، ويتم نقل الميلانين تنتج وتخزن في حجرة ميلانوسومال الخلايا الصباغية إلى الكيراتينيه المجاورة في البشرة عبر dendrites.
لام-التيروزين بمثابة الركيزة الأولى ميلانوجينيسيس والتيروزينات إنزيم يحفز اثنين من ردود فعل متتالية تحويل لتيروزين في 3 و 4-ديهيدروكسيفينيلالانيني (دوبا) ومن ثم إلى دوباكوينوني. ردود الفعل هذه هي الخطوة الحد من معدل في ميلانوجينيسيس5،6. وبناء على ذلك، يمكن قياس النشاط نقص التصبغ أولاً بتقييم النشاط التيروزينات الخلوية مباشرة. للقيام بذلك، يتم المحتضنة مقتطفات الصباغية التي تحتوي على التيروزينات مع دوبا ويمكن قياس دوباكوينوني المنتجة في العينات التي كانت في 475 نيوتن متر. القيم التي يتم تطبيع بتركيزات بروتين العينات، والمواد مع نقص التصبغ نتيجة النشاط في تشكيل دوباكوينوني أقل مقارنة مع عناصر التحكم.
ثانيا، يمكن قياس النشاط نقص التصبغ بقياس الميلانين في الخلايا الصباغية مثقف مباشرة. بعد علاج الخلايا بمادة الاختبار، يتم استخراج الميلانين تحت ظروف قلوية ومحتوى الميلانين هو الكمية التي كانت في 400 نانومتر. سيؤدي إلى انخفاض محتوى الميلانين من ضوابط7عامل نقص التصبغ.
وأخيراً، يمكن قياسها كمياً النشاط نقص التصبغ بصبغة الميلانين فونتانا-ماسون وتحليل الصور اللاحقة. في تلطيخ فونتانا-ماسون، حبيبات الميلانين خفض نترات الأمونيا والفضة لدولة معدني أسود مرئية والمناطق السوداء من الخلايا الموجودة في الصور المجهرية تمثل كمية الميلانين.
عادة ما يعطي عامل نقص التصبغ نتائج متسقة وقابلة للمقارنة مع هذه الأساليب الثلاثة، مما يؤكد أن نشاط المضمون صالحة. وبدلاً من ذلك، قد يكون من المفيد لقياس التعبير عن الجينات الرئيسية والبروتينات في ميلانوجينيسيس استجابة لمادة اختبار لدراسة النشاط نقص التصبغ. البروتينات ذات الصلة التيروزينات (الحزب-1) ودوباتشرومي توتوميراسي (الحزب-2) بالإضافة إلى التيروزينات، الإنزيمات الحيوية في ميلانوجينيسيس8. عامل النسخ مرتبطة بتشوهات عامل النسخ (ميتف) منظم رئيسي في ميلانوجينيسيس والتحديد الكمي لمستويات التعبير الجيني/البروتين أو تحليل نشاط مروج يمكن استخدامها أيضا لتقييم النشاط نقص التصبغ.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbutin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>#10960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Yakuri Pure Chemicals</td>
			<td>#16223</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold chloride</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>AHG0226</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Samchun chemical</td>
			<td>H0255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bio basic Canada Inc.</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#60218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duksan pure chemicals</td>
			<td>#81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100121</td>
			<td>Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#2163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Union Carbide</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosinase from mushroom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3824</td>
			<td>25 KU</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of hypopigmentation activity in vitro

تقدم هذه الدراسة الطرق المختبرية للتحديد الكمي لنقص التصبغ النشاط في المختبر. هو توليف الميلانين، صبغة رئيسية في الخلايا الصباغية، استجابة للعوامل الخلوية وبيئية متعددة. الميلانين يحمي خلايا الجلد من أضرار الأشعة فوق البنفسجية، ولكن أيضا بالوظائف البيولوجية الفيزيائية والكيميائية الحيوية. الإنتاج المفرط أو تراكم الميلانين في الخلايا الصباغية يمكن أن يسبب مشاكل جلدية، مثل البقع الداكنة والكلف، النمش والشامات. ولذلك، من المهم مراقبة ميلانوجينيسيس مع عوامل نقص التصبغ في الأفراد ذوي الاحتياجات السريرية أو مستحضرات التجميل. أساسا هو توليف الميلانين في الأجسام الصباغية الخلايا الصباغية في عملية بيوكيميائية معقدة تسمى ميلانوجينيسيس، الذي يتأثر بالخارجية والعوامل الجوهرية، مثل الهرمونات، والتهاب، والعمر، والتعرض للضوء فوق البنفسجي. يصف لنا ثلاثة أساليب لتحديد النشاط نقص التصبغ من المواد الكيميائية أو المواد الطبيعية في الخلايا الصباغية: قياس النشاط التيروزينات 1) الخلوية ومحتوى 2) الميلانين، والميلانين الخلوية 3) المصبوغة وتحديد مع الصورة تحليل.
في ميلانوجينيسيس، يحفز التيروزينات هذه الخطوة الحد من معدل تحويل لتيروزين في 3 و 4-ديهيدروكسيفينيلالانيني (L-DOPA)، ومن ثم إلى دوباكوينوني. ولذلك، تثبيط التيروزينات إليه نقص التصبغ الأولية. في الصباغية مثقف، يمكن قياسها كمياً التيروزينات النشاط عن طريق إضافة لدوبا كركيزة وقياس الإنتاج دوباكوينوني التي كانت. ويمكن أيضا قياس ميلانوجينيسيس بالتحديد الكمي لمحتوى الميلانين. يتم استخراج الكسر الخلوية التي تحتوي على الميلانين مع هيدروكسيد الصوديوم وهو كمية الميلانين سبيكتروفوتوميتريكالي. وأخيراً، يمكن قياسها كمياً محتوى الميلانين بتحليل الصور بعد ماسون فونتانا صبغة الميلانين. على الرغم من أن نتائج هذه الاختبارات في المختبر قد لا دائماً تكون مستنسخة في جلد الإنسان، تستخدم هذه الأساليب على نطاق واسع في البحوث ميلانوجينيسيس، خاصة كخطوة أولى لتحديد احتمال نقص التصبغ النشاط. يمكن أيضا استخدام هذه الأساليب لتقييم الخلايا الصباغية، والنمو، والتمايز. ضمان نتائج متسقة مع ثلاثة أساليب مختلفة صحة الآثار.

مجمع نتائج تمثيلية للنشاط نقص التصبغ اربوتين، مكافحة--ميلانوجينيك، في B16F10 الصباغية موضحة أدناه. ويبين الشكل 1A أن اربوتين قمعها إلى حد كبير النشاط التيروزينات الخلوية مقارنة مع مراقبة المعالجة بالمركبات. وبالمثل، انخفضت محتوى الميلانين من خلايا حفز مع ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

يصف لنا ثلاثة أساليب تجريبية لتقييم النشاط نقص التصبغ للمواد الكيميائية في المختبر: القياس الكمي لمحتوى النشاط أو 2) الميلانين التيروزينات 1) الخلوية و 3) قياس الميلانين بتحليل صورة وتلطيخ الميلانين الخلوية.

التحديد الكمي لنشاط نقص التصبغ في المختبر

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

قد تكون هذه الطريقة مفيدة في تطوير مستحضرات التجميل وظيفية وعامل الجلد مع الأنشطة المضادة للميلانوجين. انها هناك لأداء ويمكن الحصول على النتيجة بسرعة. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون هذه الطريقة مفيدة للباحثين، الذين يرغبون في تحديد أو التحقيق في الآثار أو المركبات أو التحقيق في الأنشطة المضادة للميل أو بروميلانوجينيك.لقياس نشاط التيروزيناس تبدأ بذر B16-F10 مبيدات الميلانين في خمس مرات 10 إلى الخلايا الرابعة في البئر من تركيز 24 لوحة جيدا في المتوسط الكامل لمدة 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية. في اليوم التالي، استبدال المابير في كل بئر مع DMEM تستكمل مع مجمع اختبار أعدت حديثا ومثبط السيطرة أو سيطرة سلبية والعودة لوحة إلى الحاضنة لمدة 72 ساعة أخرى. في نهاية العلاج شطف الآبار مرتين مع 300 ميكرولتر من pbs الباردة في البئر ووضع لوحة على الجليد.أضف التالي 300 ميكرولترات من العازلة تحلل إلى كل بئر باستخدام مكشطة الخلية لجمع lysates الخلية بعد خمس دقائق. نقل تعليق جزيئات الخلية الناتجة إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة الفردية 1.5 ملليلتر. ويجانس الستينات ثلاث مرات لمدة ثانيتين في 14، 500 دورة في الدقيقة على الجليد للافراج عن التيروزيناز بين الخلايا.بيليه حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي ونقل المواد الفوقية إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفردية 1.5 ملليلتر على الجليد. تخصيص 70 ميكرولترات من كل اغنيض لآبار الفردية من 96 لوحة صغيرة 96 جيدا البوليسترين وإضافة 140 ميكرولترات من حل الركيزة التيروزيناسي لكل بئر من عظمى. يهز لوحة لطيف لخلط محتويات البئر.ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. وقياس نشاط التيروزيناس في 475 نانومتر على قارئ microplate. لقياس محتوى الميلانين من الخلايا بعد جمع lysate من الخلايا المعالجة كما هو موضح.جمع lysates عن طريق الطرد المركزي ونقل عظمى إلى أنابيب جديدة. إضافة 300 ميكرولترات من هيدروكسيد الصوديوم العادي واحد إلى كل بيليه لمدة ساعة واحدة حضانة في 60 درجة مئوية. متبوعاً بالطرد المركزي لتعليق الخلايا المذابة.ثم نقل 200 ميكرولترات من superants إلى كل بئر من 96 بئر لوحة. وتقيس محتويات الميلانين على قارئ الصهقرة الدقيقة في طول موجة 400 نانومتر. لفونتانا ماسون تلطيخ، وغسل الخلايا المعالجة مرتين مع 300 ميكرولترات من pbs الباردة وإصلاح الخلايا مع 200 ميكرولترات من 10٪ formalin لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية.شطف الخلايا السميكة مع الماء المقطر وإضافة 200 ميكرولترات من 58 إلى 68 درجة مئوية فضي الأمونيال حل العمل لكل بئر. لمدة ساعة واحدة حضانة في 37 درجة مئوية أو حتى الخلايا تصبح صفراء اللون في اللون. شطف الخلايا الملطخة بالماء المقطر تليها حضانة لمدة دقيقتين في كلوريد الذهب 0.1٪في درجة حرارة الغرفة.شطف الخلايا المعالجة من كلوريد الذهب بالماء المقطر وإضافة 200 ميكرولترات من محلول ثيوسلفات الصوديوم إلى الخلايا. بعد دقيقتين شطف الخلايا مرة أخرى. وتسمية الخلايا مع 200 ميكرولترات من الأحمر السريع النووي في بئر لمدة خمس دقائق.ثم اغسل الخلايا الملطخة بمياه الصنبور قبل التصوير تحت مجهر خفيف. لتحليل العتبة، افتح الصور في الصورة J وحدد الصورة، وضبط، وعتبة اللون. لقياس المنطقة الملطخة مع فونتانا ماسون تعيين شريط المعلمة سطوع إلى الصفر وضبط السطوع إلى النقطة التي يتم فيها تضمين جميع الخلايا الملونة الأسود أو البني.حدد تحليل وتحليل الجسيمات وحدد مربع التلخيص في إطار تحليل الجسيمات ثم انقر فوق "موافق" للحصول على ملخص النتائج ونسخ ولصق البيانات في جدول بيانات. علاج أربوتين يقمع بشكل كبير النشاط التيروزين الخلوية مقارنة بالخلايا المعالجة مركبة التحكم. وبالمثل فإن محتوى الميلانين من الخلايا حفزت مع Arbutin هو انخفاض كبير بالمقارنة مع الضوابط.على الرغم من أن الخلايا متشابهة بشكل رفرفولوجي بين مجموعات العلاج، Arbutin يقلل من مساحة الصباغ الأسود مقارنة بالخلايا المعالجة التحكم. هذه الطريقة مفيدة لأنشطة الفحص باستخدام المكتبة المجمعة. هناك أكثر من مئات العينات التي سيتم اختبارها بسرعة.وعلاوة على ذلك يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة للتحقيق في آلية تنطوي على الميلانوجين. بعد تحديد المركبات المرشحة النشطة بيولوجيا، لشهادتها على دراسة الآليات البيولوجية أو التطبيقات التجارية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من<em&gt; كولاي</em&gt; الوصيفة HdeB<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

التحديد الكمي للوفرة وفرض مستويات نقل الكشف في الإشريكيّة القولونية

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

على نطاق الجينوم الكمي للترجمة في مهدها الخميرة بالتنميط الريبوسوم

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

رسم الخرائط الأيض: رصد النشاط نازعة لاكتات مباشرة في الأنسجة

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

تحليل في المختبر للكشف عن النشاط ترانسفيراز إيسوبينتينيل الحمض الريبي النووي النقال

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

الكشف عن نشاط ج فوسفوليباسي في هوموجيناتي المخ من نحل العسل

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

في كل مكان في المختبر واختبارات الديوبيكيتيمنت النيوكليوسوم

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...