Name: quantification of hypopigmentation activity in vitro
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Korea Institut for planlægning og evaluering for teknologi inden for fødevarer, landbrug og skovbrug (IPET) gennem programmet Agri-bioindustrien teknologi udvikling, finansieret af Ministeriet for landbrug, fødevarer og landdistrikter anliggender (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) og skole af biovidenskab og bioteknologi i BK21 PLUS, Korea Universitet.

1. forberedelse af Medium, stoffer og reagenser
<ol><li>Forberede B16F10 komplet vækstmediet. Supplement Dulbecco ændrede Eagle's medium (DMEM) med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (PEST).<ol>
<li>For at gøre 500 mL af komplette mellemstore, mix 445 mL Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med 50 mL af FBS og 5 mL af PEST i 1 L steriliseret glasflaske. Efter blandingen forsigtigt, filtreres mediet en 0,2 µm flaske-top filter til en ny steriliseret glasflaske og derefter opbevares ved...

<ol>
	<li>Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+controlling+the+migration+of+melanocytes+and+melanoma+cells.">Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin.">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).</li><li>Galvan, I., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+chemistry+and+the+ecology+of+stress.">Melanin chemistry and the ecology of stress.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).</li><li>Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+whitening+cosmetics:+Feedback+and+challenges+in+the+development+of+natural+skin+lighteners.">Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners.</a> Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).</li><li>Cooksey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+indirect+formation+of+the+catecholic+intermediate+substrate+responsible+for+the+autoactivation+kinetics+of+tyrosinase.">Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).</li><li>Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+identify+inhibitors+of+melanin+biosynthesis+via+the+quality+control+of+tyrosinase.">Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).</li><li>Gillbro, J. M., Olsson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanogenesis+and+mechanisms+of+skin-lightening+agents+-+existing+and+new+approaches.">The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches.</a> International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).</li><li>Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+in+the+study+of+human+skin+melanocytes.">Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes.</a> Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Momilactione+B+inhibits+protein+kinase+A+signaling+and+reduces+tyrosinase-related+proteins+1+and+2+expression+in+melanocytes.">Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes.</a> Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibitions+of+lemon+balm+(Melissa+officinalis)+ethanolic+extract+on+melanogenesis+in+B16-F1+murine+melanocytes:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+its+gene+expression.">Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression.</a> Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-Coumaric+acid+inhibition+of+CREB+phosphorylation+reduces+cellular+melanogenesis.">p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis.</a> European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibition+of+&#947;-oryzanol+on+cellular+melanogenesis:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+reduction+of+melanogenic+gene+expression+by+a+protein+kinase+a-dependent+mechanism.">Dual inhibition of &#947;-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism.</a> Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).</li><li>Choi, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+isoflavone+puerarin+and+its+glycosides+on+melanogenesis+in+B16+melanocytes.">Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes.</a> European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).</li><li>Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+reduces+cellular+melanin+content+via+suppression+of+microphthalmia-associated+transcription+factor+in+B16-F1+murine+melanocytes.">Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes.</a> Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).</li><li>Overwijk, W. W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B16+as+a+mouse+model+for+human+melanoma.">B16 as a mouse model for human melanoma.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+protocol+for+assessing+regulators+of+pigmentation.">A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation.</a> Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).</li><li>D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+melanogenesis.">Signaling pathways in melanogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).</li><li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage:+interactions+between+KIT+and+MITF.">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).</li><li>Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-MSH+and+melanogenesis+in+normal+human+adult+melanocytes.">&#945;-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).</li><li>Hu, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+evaluation+of+melanin+content+and+production+of+pigment+cells+in+vitro.">Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).</li><li>Carriel, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+histochemical+method+for+a+simultaneous+staining+of+melanin+and+collagen+fibers.">A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).</li></ol>

Vi præsenterede protokoller for at vurdere hypopigmentering aktiviteten af test forbindelser ved hjælp af kulturperler melanocytter. De repræsentative resultater viste hypopigmentering effekt af arbutin, en tyrosinase hæmmer, der hæmmede tyrosinase aktivitet og cellulære melanin indhold. Disse metoder er meget udbredt i anti-melanogenic aktivitet forskning. Bruger disse assays, vi har også med succes identificeret flere bioaktive stoffer, der har melanogenesis hæmmende effekter på B16F10 celler i sidste ti år<s...

Melanin spiller en afgørende rolle i fysiologi, patologi og toksikologi af flere organer, herunder hud, øjne og hjerne1. Hovedfunktioner af melanin er foto-screening og biokemiske virkninger. Melanin absorberer nær-infrarødt og synligt lys samt ultraviolet (UV) stråling, med øget absorption satser ved kortere bølgelængder af lys; således beskytter melanin væv fra skader forårsaget af synligt lys eller UV stråling2. Melanin er en antioxidant og har en affinitet for metaller og andre giftige kemikalier; Derfor kan det beskytte væv fra oxidative og kemiske stress3. Dog, overdreven produktion af melanin forårsager dermatologiske problemer.
Mængden og kvaliteten af melanin i huden og iris er de vigtigste determinanter for farven på iris og hud. Enkeltpersoner kan have forskellige hud farvepræferencer; nogle fordel garvet hud, mens andre favor lysere hudfarver. Afhængigt af disse forbruger profiler, er hypopigmentering kosmetik blevet udviklet for at opfylde individuelle markeder for begunstiget hud farver4. Derfor er undersøgelser af hypopigmentering og anti-melanogenic aktivitet vigtigt både videnskabeligt og praktisk.
Melanogenesis er en kompleks proces af melanin biosyntesen gennem en serie af enzymatiske og spontane kemiske reaktioner i melanocytter. Én melanocyte er omgivet af ca 36 keratinocytter og melanocytter er melanin syntese fabrikker, som distribuerer deres produkt til tilstødende keratinocytter. I huden transporteres melanin produceret og gemt i melanosomal rum af melanocytter til tilstødende keratinocytter i epidermis via dendritter.
L-tyrosin tjener som den oprindelige substrat for melanogenesis og enzymet tyrosinase katalyserer to på hinanden følgende reaktioner, der konverterer L-tyrosin i 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) og derefter ind i dopaquinone. Disse reaktioner er det hastighedsbegrænsende trin i melanogenesis5,6. Hypopigmentering aktivitet kan derfor først måles ved vurdering af cellulære tyrosinase aktivitet direkte. For at gøre det, melanocyte ekstrakter som indeholder tyrosinase inkuberes med DOPA og dopaquinone produceret i prøverne kan måles ved spektrofotometri på 475 nm. Værdierne er normaliseret af protein koncentrationer af prøver og stoffer med hypopigmentering aktivitet resulterer i mindre dopaquinone dannelse sammenlignet med kontrol.
For det andet, hypopigmentering aktivitet kan kvantificeres ved direkte måling af melanin i kulturperler melanocytter. Efter behandling af celler med teststoffet, melanin er udvundet alkalisk betingelser og melanin indhold er kvantificeret ved spektrofotometri på 400 nm. En hypopigmentering agent vil resultere i en lavere melanin indhold end kontrol7.
Endelig, hypopigmentering aktivitet kan kvantificeres ved Fontana-Masson melanin farvning og efterfølgende billedanalyse. I Fontana-Masson farvning, melanin granulat reducerer ammoniak-sølv nitrat til en synlig sort metallic tilstand og de sorte områder af celler i mikroskopiske billeder repræsenterer mængden af melanin.
En hypopigmentering agent giver normalt sammenhængende og sammenlignelige resultater med disse tre metoder, som bekræfter, at aktiviteten af stoffet er gyldig. Alternativt kan det være nyttigt at måle udtryk for centrale gener og proteiner i melanogenesis svar på en test-kemikaliet at undersøge hypopigmentering aktivitet. Tyrosinase er tyrosinase-relaterede proteiner (TRP-1) og dopachrome tautomerase (TRP-2) kritiske enzymer i melanogenesis8. Transskription faktor microphthalmia-associerede transskription faktor (MITF) er en master regulator i melanogenesis og kvantificering af dens gen/protein udtryk niveauer eller en promotor aktivitet assay kan også bruges til at vurdere hypopigmentering aktivitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbutin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>#10960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Yakuri Pure Chemicals</td>
			<td>#16223</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold chloride</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>AHG0226</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Samchun chemical</td>
			<td>H0255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bio basic Canada Inc.</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#60218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duksan pure chemicals</td>
			<td>#81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100121</td>
			<td>Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#2163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Union Carbide</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosinase from mushroom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3824</td>
			<td>25 KU</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of hypopigmentation activity in vitro

Denne undersøgelse præsenterer laboratoriemetoder til kvantificering af hypopigmentering aktivitet in vitro. Melanin, den store pigment i melanocytter, er syntetiseret i svar til flere cellulære og miljømæssige faktorer. Melanin beskytter hudceller fra ultraviolet skader, men også har biofysiske og biokemiske funktioner. Overdreven produktion eller ophobning af melanin i melanocytter kan forårsage dermatologiske problemer, såsom fregner, mørke pletter, melasma og modermærker. Derfor er kontrol af melanogenesis med hypopigmentering agenter vigtigt hos personer med klinisk eller kosmetiske behov. Melanin er primært syntetiseret i melanosomer af melanocytter i en kompleks biokemiske proces, der kaldes melanogenesis, som er påvirket af ydre og iboende faktorer, såsom hormoner, betændelse, alder og ultraviolet lys eksponering. Vi beskriver tre metoder til at bestemme hypopigmentering aktiviteter kemikalieproducenter eller naturlige stoffer i melanocytter: måling af 1) cellulære tyrosinase aktivitet og 2) melanin indhold og 3) farvning og kvantificere cellulære melanin med billede analyse.
I melanogenesis katalyserer tyrosinase trinnet trafikhastighedsbegrænsning, der konverterer L-tyrosin i 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) og derefter ind i dopaquinone. Hæmning af tyrosinase er derfor en primær hypopigmentering mekanisme. I kulturperler melanocytter, kan tyrosinase aktivitet kvantificeres ved at tilføje L-DOPA som substrat og måling af dopaquinone produktion af spektrofotometri. Melanogenesis kan også måles ved kvantificere melanin indhold. Melanin-holdige cellulære brøken ekstraheres med NaOH og melanin er kvantificeret spektrofotometrisk. Endelig, melanin indhold kan kvantificeres ved billedanalyse efter Fontana-Masson farvning af melanin. Selv om resultaterne af disse in vitro-assays ikke kan altid gengives i menneskelige hud, er disse metoder almindeligt anvendt i melanogenesis forskning, især som det første skridt til at identificere potentielle hypopigmentering aktivitet. Disse metoder kan også bruges til at vurdere melanocyte aktivitet, vækst og differentiering. Ensartede resultater med de tre forskellige metoder sikrer gyldigheden af virkningerne.

Repræsentative resultater for hypopigmentering aktivitet af arbutin, en anti-melanogenic sammensatte i B16F10 Melanocytter er vist nedenfor. Figur 1A viser, at arbutin betydeligt undertrykt cellulære tyrosinase aktivitet sammenlignet med kontrolelementet køretøjets-behandlet. På samme måde, melanin indhold af celler stimuleret med arbutin blev reduceret betydeligt sammenlignet med kontrol (figur 1B). Mikroskopiske billeder ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Vi beskriver tre eksperimentelle metoder til evaluering af hypopigmentering aktivitet af kemikalier in vitro: kvantificering af 1) cellulære tyrosinase aktivitet og 2) melanin indhold, og 3) måling af melanin af cellulære melanin farvning og billede analyse.

Kvantificering af hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Denne metode kan være nyttige i udviklingen af funktionelle kosmetik og hud agent med anti-melanogene aktiviteter. Det er der er at udføre, og resultatet kan opnås hurtigt. Desuden kan denne metode være nyttig for forskere, der ønsker at identificere eller undersøge virkningerne eller forbindelserne eller undersøge de antimelanogene eller promelanogene aktiviteter.At måle til tyrosinase aktivitet begynder med såning B16-F10 Melanicider på en fem gange 10 til den fjerde celler pr brønd af en 24 godt plade koncentration i komplet medium i 24 timer i en cellekultur inkubator. Den næste dag, erstatte supernatant i hver brønd med DMEM suppleret med frisklavet testforbindelse og inhibitor kontrol eller en negativ kontrol og returnere pladen til rugemaskinen i yderligere 72 timer. Ved afslutningen af behandlingen skylles brøndene to gange med 300 mikroliter kold pbs pr. brønd og læg pladen på is.Næste tilføje 300 mikroliter lysis buffer til hver brønd ved hjælp af en celle skraber til at indsamle cellen lysates efter fem minutter. De resulterende cellepartikelsuspensioner overføres til individuelle 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Og homogenisere lysates tre gange i to sekunder ved 14, 500 rpm på is til at frigive intercellulære tyrosinase.Pellet cellerester ved centrifugering og overfør supernatanterne til individuelle 1,5 milliliter centrifugerør på is. Fordel 70 mikroliter af hver supernatant til individuelle brønde af en klar 96 brønd polystyren mikroplade og tilsæt 140 mikroliter tyrosinase substrat opløsning til hver brønd af supernatant. Ryst pladen blid for at blande brøndens indhold.Derefter inkuberes pladen ved 37 grader celsius i to timer. Og måle til tyrosinase aktivitet på 475 nanometer på en mikroplade læser. At måle melaninindholdet i cellerne efter indsamling af lysatet af de behandlede celler som påvist.Opsaml lysaterne ved centrifugering, og overfør supernatanterne til nye rør. Der tilsættes 300 mikroliter af en normal natriumhydroxid til hver pellet i en times inkubation ved 60 grader Celsius. Efterfulgt af centrifugering af de opløste cellesuspensioner.Derefter overføres 200 mikroliter af supernatanterne til hver brønd på en 96 brøndplade. Og måle melaninindholdet på en mikropladelæser ved en 400 nanometerbølgelængde. For Fontana-Masson Farvning vaskes de behandlede celler to gange med 300 mikroliter kold pbs, og cellerne fastgøres med 200 mikroliter på 10% formalin i en time ved fire grader Celsius.Skyl de tykke celler med destilleret vand og tilsæt 200 mikroliter på 58 til 68 grader celsius ammoniak sølv arbejdsløsning til hver brønd. For en time inkubation ved 37 grader Celsius eller indtil cellerne bliver gul-brun i farven. Skyl de farvede celler med destilleret vand efterfulgt af to minutters inkubation i 0,1% guldchlorid ved stuetemperatur.Skyl guldchloridbehandlede celler med destilleret vand og tilsæt 200 mikroliter natrium thiosulfatopløsning til cellerne. Efter to minutter skylles cellerne igen. Og mærke cellerne med 200 mikroliter af nuklear hurtig rød pr brønd i fem minutter.Vask derefter de farvede celler med vand fra hanen, før der billeddannelse under et let mikroskop. Hvis du vil have tærskelanalyse, skal du åbne billederne i billede J og vælge billede, justere og farvegrænse. For at måle det område, der er bejdset med Fontana Masson, skal du indstille lysstyrkeparameteren til nul og justere lysstyrken til det punkt, hvor alle de sorte eller brune farvede celler er inkluderet.Vælg Analysér og analysér partikler, og markér feltet Sammenfat i vinduet Analysér partikler, og klik derefter på okay for at få en oversigt over resultaterne og kopiere og indsætte dataene i et regneark. Arbutin behandling betydeligt undertrykker cellulære tyrosinase aktivitet i forhold til kontrol køretøj behandlede celler. Tilsvarende melaninindholdet i celler stimuleret med Arbutin er væsentligt reduceret i forhold til kontrollerne.Selv om cellerne er morfologisk ens mellem behandlingsgrupper, Arbutin nedsætter området af sort pigment i forhold til kontrolbehandlede celler. Denne metode er nyttig til aktivitetsscreening ved hjælp af vores sammensatte bibliotek. Der er over hundredvis af prøver, der skal testes hurtigt.Desuden kan denne metode også bruges til at undersøge mekanismen, der involverer melanogenese. Efter de bioaktive kandidater forbindelser er blevet identificeret, for deres vidnesbyrd om studiet af biologiske mekanismer eller kommercielle anvendelser.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Påvisning af pH-afhængige aktivitet af<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In vitro</em&gt; og<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantificering af overfloden og opladning niveauer af overførsel RNA'er i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide kvantificering af oversættelse i spirende gær af ribosomet profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Kortlægning stofskifte: Overvågning af laktat Dehydrogenase aktiviteten direkte i væv

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

En In Vitro Assay at opdage tRNA-Isopentenyl-Transferase aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantificering af Protein Homo-oligomerisering ved hjælp af kommercielle instrumentering og gratis, Open Source lysstyrke analyse Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Påvisning af fosfolipase C aktivitet i hjernen homogenatet fra honningbien

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro-allestedsnærværende og Deubiquitinationassays af Nukleosomale histoner

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...