Name: quantification of hypopigmentation activity in vitro
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Korea Instituut voor Planning en evaluatie voor technologie in voedsel, landbouw en bosbouw (IPET) via de Agri-dierziekte Technology Development Program, gefinancierd door het ministerie van landbouw, voedsel en plattelandsontwikkeling zaken (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) en de School van de biowetenschappen en de biotechnologie voor BK21 PLUS, Universiteit van Korea.

1. bereiding van Medium, verbindingen en reagentia
<ol><li>B16F10 groeimedium volledig voor te bereiden. De aanvulling Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (PEST).<ol>
<li>Meng om 500 mL van volledige medium, 445 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 50 mL FBS en 5 mL van de PEST in een gesteriliseerde 1 L-fles. Na het mengen zachtjes, filtreer het medium door een 0,2-µm fles-top-filter naar een nieuwe gesteriliseerde glazen fles en...

<ol>
	<li>Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+controlling+the+migration+of+melanocytes+and+melanoma+cells.">Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin.">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).</li><li>Galvan, I., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+chemistry+and+the+ecology+of+stress.">Melanin chemistry and the ecology of stress.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).</li><li>Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+whitening+cosmetics:+Feedback+and+challenges+in+the+development+of+natural+skin+lighteners.">Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners.</a> Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).</li><li>Cooksey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+indirect+formation+of+the+catecholic+intermediate+substrate+responsible+for+the+autoactivation+kinetics+of+tyrosinase.">Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).</li><li>Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+identify+inhibitors+of+melanin+biosynthesis+via+the+quality+control+of+tyrosinase.">Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).</li><li>Gillbro, J. M., Olsson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanogenesis+and+mechanisms+of+skin-lightening+agents+-+existing+and+new+approaches.">The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches.</a> International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).</li><li>Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+in+the+study+of+human+skin+melanocytes.">Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes.</a> Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Momilactione+B+inhibits+protein+kinase+A+signaling+and+reduces+tyrosinase-related+proteins+1+and+2+expression+in+melanocytes.">Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes.</a> Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibitions+of+lemon+balm+(Melissa+officinalis)+ethanolic+extract+on+melanogenesis+in+B16-F1+murine+melanocytes:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+its+gene+expression.">Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression.</a> Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-Coumaric+acid+inhibition+of+CREB+phosphorylation+reduces+cellular+melanogenesis.">p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis.</a> European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibition+of+&#947;-oryzanol+on+cellular+melanogenesis:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+reduction+of+melanogenic+gene+expression+by+a+protein+kinase+a-dependent+mechanism.">Dual inhibition of &#947;-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism.</a> Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).</li><li>Choi, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+isoflavone+puerarin+and+its+glycosides+on+melanogenesis+in+B16+melanocytes.">Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes.</a> European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).</li><li>Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+reduces+cellular+melanin+content+via+suppression+of+microphthalmia-associated+transcription+factor+in+B16-F1+murine+melanocytes.">Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes.</a> Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).</li><li>Overwijk, W. W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B16+as+a+mouse+model+for+human+melanoma.">B16 as a mouse model for human melanoma.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+protocol+for+assessing+regulators+of+pigmentation.">A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation.</a> Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).</li><li>D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+melanogenesis.">Signaling pathways in melanogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).</li><li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage:+interactions+between+KIT+and+MITF.">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).</li><li>Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-MSH+and+melanogenesis+in+normal+human+adult+melanocytes.">&#945;-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).</li><li>Hu, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+evaluation+of+melanin+content+and+production+of+pigment+cells+in+vitro.">Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).</li><li>Carriel, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+histochemical+method+for+a+simultaneous+staining+of+melanin+and+collagen+fibers.">A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).</li></ol>

Wij presenteerden protocollen voor de beoordeling van de activiteit van de verdikking van de test verbindingen met behulp van gekweekte melanocyten. De representatieve resultaten toonde het effect van de verdikking van de Arbutine, een tyrosinase-remmer die geremd tyrosinase-activiteit en cellulaire melanine inhoud. Deze methoden worden veel gebruikt in anti-melanogenic activiteit onderzoek. Met behulp van deze tests, hebben we ook met succes verschillende bioactieve stoffen die melanogenesis remmende effecten op B16F10 ...

Melanine speelt een cruciale rol in de fysiologie, pathologie en toxicologie van verscheidene organen waaronder de huid, ogen en hersenen1. Belangrijkste functies van melanine zijn foto-screening en biochemische effecten. Melanine absorbeert nabij-infrarood en zichtbaar licht, alsmede ultraviolette (UV) straling, met verhoogde absorptie tarieven bij kortere golflengten van het licht; melanine beschermt dus weefsels tegen schade veroorzaakt door zichtbaar licht of UV straling2. Melanine is een antioxidant en heeft een affiniteit voor metalen en andere giftige chemische stoffen; het kan daarom weefsels beschermen tegen oxidatieve en chemische stress3. De overmatige productie van melanine veroorzaakt echter dermatologische problemen.
De kwantiteit en kwaliteit van melanine in de huid en iris zijn de belangrijkste determinanten van de kleur van de iris en de huid. Individuen kunnen hebben verschillende huid kleurvoorkeuren; enkele gunst gebruinde huid, terwijl anderen het voordeel van lichtere kleuren van de huid. Afhankelijk van deze consument profielen, zijn hypopigmentatie cosmetica ontwikkeld om te voldoen aan individuele markten voor favoriete huid kleuren4. Dienovereenkomstig, zijn studies van hypopigmentatie en anti-melanogenic activiteiten belangrijk, zowel wetenschappelijk als praktisch.
Melanogenesis is het complexe proces van melanine biosynthese door middel van een reeks van enzymatische en spontane chemische reacties in de melanocyten. Een melanocyt wordt omgeven door ongeveer 36 keratinocyten en melanocyten zijn de melanine synthese fabrieken die verspreiden van hun product aan naburige keratinocyten. In de huid, wordt de melanine geproduceerd en opgeslagen in het compartiment van de melanosomal van melanocyten getransporteerd naar naburige keratinocyten in de opperhuid via dendrites.
L-Tyrosine serveert de eerste substraat voor melanogenesis en het enzym tyrosinase katalyseert twee opeenvolgende reacties die L-tyrosine naar 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) en vervolgens naar dopaquinone converteren. Deze reacties zijn de snelheidslimieten stap in melanogenesis5,6. Dienovereenkomstig, hypopigmentatie activiteit kan eerst worden gemeten door cellulaire tyrosinase-activiteit rechtstreeks te bepalen. Om dit te doen, melanocyt extracten met tyrosinase worden geïncubeerd met DOPA en de dopaquinone geproduceerd in de monsters kan worden gemeten door spectrofotometrie op 475 nm. De waarden zijn genormaliseerd door de concentraties van de eiwitten van de monsters, alsmede stoffen met hypopigmentatie activiteit resultaat in minder vorming van de dopaquinone vergeleken met besturingselementen.
Ten tweede, hypopigmentatie activiteit kan worden gekwantificeerd door het meten van melanine in gekweekte melanocyten direct. Na behandeling van cellen met het testmateriaal, melanine wordt gewonnen onder alkalische omstandigheden en de melanine inhoud wordt gekwantificeerd door spectrofotometrie bij 400 nm. Een verdikking agent zal resulteren in een lagere melanine inhoud dan de besturingselementen7.
Tot slot, de verdikking activiteit kan worden gekwantificeerd door Fontana-Masson melanine kleuring en latere beeldanalyse. Melanine korrels Verlaag ammoniak-zilvernitraat aan een zwarte metalen zichtbaarheidsstatus in Fontana-Masson kleuring, en de zwarte gebieden van cellen in de microscopische beelden vertegenwoordigen de hoeveelheid melanine.
Een verdikking agent geeft meestal consistente en vergelijkbare resultaten met deze drie methoden, die bevestigt dat de activiteit van de stof geldig is. Anderzijds kan het zinvol zijn om te meten de uitdrukking van essentiële genen en proteïnen in melanogenesis naar aanleiding van een teststof te onderzoeken van hypopigmentatie activiteit. Naast tyrosinase zijn tyrosinase-gerelateerde eiwitten (TRP-1) en dopachrome tautomerase (TRP-2) essentiële enzymen in melanogenesis8. De transcriptie factor microphthalmia-geassocieerde transcriptiefactor (MITF) is een meester regelgever in melanogenesis en kwantificering van de gene/proteïne expressie niveaus of een promotor activiteit assay kan ook worden gebruikt om te beoordelen van hypopigmentatie activiteit.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbutin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>#10960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Yakuri Pure Chemicals</td>
			<td>#16223</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold chloride</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>AHG0226</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Samchun chemical</td>
			<td>H0255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bio basic Canada Inc.</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#60218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duksan pure chemicals</td>
			<td>#81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100121</td>
			<td>Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#2163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Union Carbide</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosinase from mushroom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3824</td>
			<td>25 KU</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of hypopigmentation activity in vitro

Deze studie presenteert laboratoriumtechnieken voor de kwantificering van hypopigmentatie activiteit in vitro. Melanine, de grote pigment in de melanocyten, wordt gesynthetiseerd in reactie op meerdere factoren voor cellulaire en milieu. Melanine beschermt de huidcellen tegen ultraviolet schade, maar heeft ook biofysische en biochemische functies. Buitensporige productie of ophoping van melanine in de melanocyten kan leiden tot dermatologische problemen, zoals sproeten, donkere vlekken, melasma en mollen. Daarom is de controle van melanogenesis met hypopigmentatie agenten is belangrijk bij personen met klinische en cosmetische behoeften. Melanine is hoofdzakelijk gesynthetiseerd in de melanosomes van melanocyten in een complexe biochemische proces genaamd melanogenesis, die wordt beïnvloed door Extrinsieke en intrinsieke factoren, zoals hormonen, ontsteking, leeftijd en blootstelling aan ultraviolet licht. We beschrijven drie methoden om te bepalen van de activiteit van de verdikking van chemicaliën of natuurlijke stoffen in de melanocyten: meting van de 1) cellulaire tyrosinase-activiteit 2) melanine inhoud, en 3) kleuring en kwantificering cellulaire melanine met afbeelding analyse.
In melanogenesis katalyseert tyrosinase de snelheidslimieten stap dat L-tyrosine naar 3,4-dihydroxyphenylalanine (levodopa) en vervolgens naar dopaquinone converteert. Daarom is de remming van tyrosinase een primaire hypopigmentatie mechanisme. In gekweekte melanocyten, kan tyrosinase-activiteit worden gekwantificeerd door levodopa als een substraat toe te voegen en het meten van de dopaquinone productie door spectrofotometrie. Melanogenesis kan ook worden gemeten door het kwantificeren van de melanine inhoud. De melanine bevattende cellulaire fractie wordt geëxtraheerd met NaOH en melanine spectrophotometrically wordt gekwantificeerd. Tot slot kan de melanine inhoud worden gekwantificeerd door beeldanalyse na Fontana-Masson kleuring van melanine. Hoewel de resultaten van deze in-vitrotests kunnen niet altijd worden gereproduceerd in de menselijke huid, worden deze methoden veel gebruikt in melanogenesis onderzoek, met name als de eerste stap om te identificeren van potentiële hypopigmentatie activiteit. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt ter beoordeling van de melanocyt activiteit, groei en differentiatie. Consistente resultaten met de drie verschillende methoden zorgen de geldigheid van de effecten.

Representatieve resultaten voor de activiteit van de verdikking van de Arbutine, een anti-melanogenic samengestelde, in B16F10 melanocyten staan hieronder. Figuur 1A blijkt dat Arbutine sterk onderdrukt de cellulaire tyrosinase-activiteit in vergelijking met de controle van voertuig-behandeld. Ook was de melanine inhoud van cellen gestimuleerd met Arbutine aanzienlijk verminderd in vergelijking met de besturingselementen (figuur 1B</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

We beschrijven drie experimentele methoden voor de evaluatie van de activiteit van de verdikking van chemische stoffen in vitro: kwantificering van 1) cellulaire tyrosinase-activiteit en 2) melanine inhoud, en 3) meting van melanine door cellulaire melanine kleuring en beeld-analyse.

Kwantificering van hypopigmentatie activiteit In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Deze methode kan nuttig zijn bij de ontwikkeling van functionele cosmetica en huidagent met anti-melanogene activiteiten. Het is er om uit te voeren en het resultaat kan snel worden verkregen. Bovendien kan deze methode nuttig zijn voor onderzoekers, die de effecten of de verbindingen willen identificeren of onderzoeken of de antimelanogene of promelanogene activiteiten willen onderzoeken.Om te meten tyrosinase activiteit beginnen met het zaaien van B16-F10 Melaniciden op een vijf keer 10 tot de vierde cellen per put van een 24 put plaat concentratie in volledig medium gedurende 24 uur in een celcultuur incubator. De volgende dag, vervang de supernatant in elke put met DMEM aangevuld met vers bereide test verbinding en remmer controle of een negatieve controle en terug de plaat naar de incubator voor nog eens 72 uur. Spoel aan het einde van de behandeling de putten twee keer af met 300 microliter koude pbs per put en leg de plaat op ijs.Voeg vervolgens 300 microliter lysebuffer toe aan elke put met behulp van een celschraper om de celkrassen na vijf minuten te verzamelen. Breng de resulterende celdeeltjessuspensies over op individuele 1,5 milliliter microcentrifugebuizen. En homogeniseren de lysates drie keer gedurende twee seconden op 14, 500 rpm op ijs om de intercellulaire Tyrosinase release.Pellet het celpuin door centrifugatie en breng de supernatants over naar individuele 1,5 milliliter centrifugebuizen op ijs. Wijs 70 microliter van elke supernatant toe aan afzonderlijke putten van een duidelijke 96 put polystyreen microplaat en voeg 140 microliters van Tyrosinase substraatoplossing toe aan elke put van supernatant. Schudden van de plaat zacht om de put inhoud te mengen.Dan incubeer de plaat op 37 graden celsius voor twee uur. En meet tyrosinase activiteit op 475 nanometer op een microplate lezer. Om het melaninegehalte van de cellen te meten na het verzamelen van het lysaat van de behandelde cellen zoals aangetoond.Verzamel de lysates door centrifugatie en breng de supernatants over naar nieuwe buizen. Voeg 300 microliters van een normale natriumhydroxide toe aan elke pellet voor een incubatie van een uur bij 60 graden Celsius. Gevolgd door centrifugatie van de opgeloste celsuspensies.Breng vervolgens 200 microliters van de supernatants over naar elke put van een 96 putplaat. En meet de melanine inhoud op een microplate lezer op een golflengte van 400 nanometer. Voor Fontana-Masson Kleuring, was de behandelde cellen twee keer met 300 microliters koude pbs en bevestig de cellen met 200 microliters van 10% formaline gedurende een uur bij vier graden Celsius.Spoel de dikke cellen met gedestilleerd water en voeg 200 microliters van 58 tot 68 graden Celsius Ammoniacal zilver werkende oplossing aan elke put. Voor een uur incubatie bij 37 graden Celsius of totdat de cellen geelbruin van kleur. Spoel de gekleurde cellen met gedestilleerd water, gevolgd door twee minuten incubatie in 0,1%goudchloride bij kamertemperatuur.Spoel de met goudchloride behandelde cellen af met gedestilleerd water en voeg 200 microliter natriumthiosulfaatoplossing toe aan de cellen. Na twee minuten spoel de cellen weer. En label de cellen met 200 microliters van kernsnel rood per put gedurende vijf minuten.Was vervolgens de gekleurde cellen met leidingwater voordat beeldvorming onder een lichtmicroscoop. Open voor drempelanalyse de afbeeldingen in afbeelding J en selecteer afbeelding, aanpassen en Kleurdrempel. Als u het gebied wilt meten dat is bevlekt met Fontana Masson, stelt u de helderheidsparameterbalk in op nul en past u de helderheid aan op het punt waarop alle zwarte of bruine gekleurde cellen zijn opgenomen.Selecteer Deeltjes analyseren en analyseren en schakel het selectievakje samenvatten in het venster Deeltjes analyseren en klik vervolgens op oke om een samenvatting van de resultaten te verkrijgen en de gegevens in een spreadsheet te kopiëren en plakken. Arbutin behandeling onderdrukt de cellulaire Tyrosinase activiteit aanzienlijk in vergelijking met de controle voertuig behandelde cellen. Ook het melaninegehalte van cellen gestimuleerd met Arbutin is aanzienlijk verminderd in vergelijking met de controles.Hoewel de cellen morfologisch vergelijkbaar zijn tussen behandelingsgroepen, vermindert Arbutin het gebied van zwart pigment in vergelijking met de controle behandelde cellen. Deze methode is handig voor activiteiten screening met behulp van onze samengestelde bibliotheek. Er zijn meer dan honderden monsters die snel getest moeten worden.Bovendien kan deze methode ook worden gebruikt om het mechanisme met melanogenese te onderzoeken. Nadat de bioactieve kandidaten verbindingen zijn geïdentificeerd, voor hun getuigenis van de studie van biologische mechanismen of commerciële toepassingen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; en<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kwantificering van de overvloed en het opladen van de niveaus van overdracht RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Toewijzing metabolisme: Bewakingsactiviteit lactaat Dehydrogenase rechtstreeks in weefsel

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Een In Vitro Assay tRNA-Isopentenyl Transferase activiteit detecteren

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Detectie van Phospholipase C activiteit in de hersenen homogenaat van de honingbij

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro Ubiquitination en Deubiquitinisatie assays van Nucleosomale histonen

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...