Name: quantification of hypopigmentation activity in vitro
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00
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Ce travail a été soutenu par l’Institut de planification de la Corée et l’évaluation des technologies en alimentation, Agriculture et foresterie (IPET) du programme de développement de technologie Agri-bio-industrie, financé par le ministère de l’Agriculture, alimentation et affaires rurales (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) et l’école des Sciences de la vie et la biotechnologie pendant PLUS de BK21, Université de Corée.

1. préparation du milieu, composés et réactifs
<ol><li>Préparer le milieu complet de croissance B16F10. Supplément Dulbecco aigle modifié (DMEM) avec 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine (PEST).<ol>
<li>Pour faire 500 mL de milieu complet, mélangez 445 mL du milieu de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 50 mL de FBS et 5 mL de PEST dans une bouteille en verre stérilisé 1 L. Après avoir mélangé doucement, le support de filtration par un filtre de flacon de 0,2 µm pour une nou...

<ol>
	<li>Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+controlling+the+migration+of+melanocytes+and+melanoma+cells.">Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin.">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).</li><li>Galvan, I., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+chemistry+and+the+ecology+of+stress.">Melanin chemistry and the ecology of stress.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).</li><li>Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+whitening+cosmetics:+Feedback+and+challenges+in+the+development+of+natural+skin+lighteners.">Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners.</a> Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).</li><li>Cooksey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+indirect+formation+of+the+catecholic+intermediate+substrate+responsible+for+the+autoactivation+kinetics+of+tyrosinase.">Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).</li><li>Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+identify+inhibitors+of+melanin+biosynthesis+via+the+quality+control+of+tyrosinase.">Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).</li><li>Gillbro, J. M., Olsson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanogenesis+and+mechanisms+of+skin-lightening+agents+-+existing+and+new+approaches.">The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches.</a> International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).</li><li>Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+in+the+study+of+human+skin+melanocytes.">Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes.</a> Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Momilactione+B+inhibits+protein+kinase+A+signaling+and+reduces+tyrosinase-related+proteins+1+and+2+expression+in+melanocytes.">Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes.</a> Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibitions+of+lemon+balm+(Melissa+officinalis)+ethanolic+extract+on+melanogenesis+in+B16-F1+murine+melanocytes:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+its+gene+expression.">Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression.</a> Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-Coumaric+acid+inhibition+of+CREB+phosphorylation+reduces+cellular+melanogenesis.">p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis.</a> European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibition+of+&#947;-oryzanol+on+cellular+melanogenesis:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+reduction+of+melanogenic+gene+expression+by+a+protein+kinase+a-dependent+mechanism.">Dual inhibition of &#947;-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism.</a> Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).</li><li>Choi, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+isoflavone+puerarin+and+its+glycosides+on+melanogenesis+in+B16+melanocytes.">Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes.</a> European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).</li><li>Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+reduces+cellular+melanin+content+via+suppression+of+microphthalmia-associated+transcription+factor+in+B16-F1+murine+melanocytes.">Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes.</a> Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).</li><li>Overwijk, W. W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B16+as+a+mouse+model+for+human+melanoma.">B16 as a mouse model for human melanoma.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+protocol+for+assessing+regulators+of+pigmentation.">A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation.</a> Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).</li><li>D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+melanogenesis.">Signaling pathways in melanogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).</li><li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage:+interactions+between+KIT+and+MITF.">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).</li><li>Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-MSH+and+melanogenesis+in+normal+human+adult+melanocytes.">&#945;-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).</li><li>Hu, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+evaluation+of+melanin+content+and+production+of+pigment+cells+in+vitro.">Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).</li><li>Carriel, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+histochemical+method+for+a+simultaneous+staining+of+melanin+and+collagen+fibers.">A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).</li></ol>

Nous avons présenté des protocoles d’évaluation de l’activité de l’hypopigmentation des composés d’essai à l’aide de mélanocytes cultivés. Les résultats représentatifs ont montré l’effet de l’hypopigmentation de l’arbutine, un inhibiteur de la tyrosinase qui inhibe la tyrosinase activité et cellulaires mélanine contenu. Ces méthodes sont largement utilisées dans la recherche de l’activité anti-mélanogénique. À l’aide de ces tests, nous avons identifié avec succès plusieurs compos?...

Mélanine joue un rôle essentiel dans la physiologie, la pathologie et toxicologie de plusieurs organes, y compris la peau, des yeux et cerveau1. Principales fonctions de mélanine sont effets photo-dépistage et biochimiques. La mélanine absorbe la lumière visible et proche infrarouge ainsi que des rayonnements ultraviolets (UV), avec des taux d’absorption accrue de courtes longueurs d’onde de la lumière ; ainsi, la mélanine protège les tissus contre les dommages causés par la lumière visible ou UV radiation2. La mélanine est un antioxydant et a une affinité pour les métaux et autres produits chimiques toxiques ; par conséquent, il peut protéger des tissus du stress oxydatif et chimiques3. Cependant, la production excessive de mélanine entraîne des problèmes dermatologiques.
La quantité et la qualité de la mélanine dans la peau et les iris sont les déterminants les plus importants de la couleur de l’iris et la peau. Personnes peuvent avoir des préférences de couleur de peau différente ; certains favorisent la peau bronzée, tandis que d’autres favorisent les couleurs de peau plus légères. Selon ces profils de consommateurs, une hypopigmentation cosmétiques ont été développés pour satisfaire les marchés individuels pour peau favorisée couleurs4. En conséquence, études d’activité hypopigmentation et anti-mélanogenèse sont importantes tant scientifiquement que pratiquement.
Mélanogénèse est le complex processus de biosynthèse de la mélanine par une série de réactions chimiques enzymatiques et spontanées dans les mélanocytes. Un mélanocyte est entouré d’environ 36 kératinocytes et mélanocytes sont les usines de synthèse de la mélanine qui distribuent leurs produits aux kératinocytes voisins. Dans la peau, la mélanine produite et stockée dans le compartiment de melanosomal de mélanocytes est transportée vers les kératinocytes voisins dans l’épiderme via dendrites.
L-Tyrosine sert de substrat initial pour la mélanogénèse et l’enzyme tyrosinase catalyse deux réactions consécutives qui convertissent la L-tyrosine en 3, 4-dihydroxyphénylalanine (DOPA), puis en dopaquinone. Ces réactions sont l’étape cinétiquement limitante dans la mélanogénèse5,6. En conséquence, une hypopigmentation activité peut tout d’abord être mesurée en évaluant l’activité de la tyrosinase cellulaire directement. Pour ce faire, des extraits de mélanocytes contenant la tyrosinase sont incubés avec DOPA et la dopaquinone produite dans les échantillons peut être mesurée par spectrophotométrie à 475 nm. Les valeurs sont normalisées par les concentrations de protéines des échantillons et les substances ayant une hypopigmentation activité donnent lieu à moins dopaquinone formation comparée aux témoins.
Deuxièmement, une hypopigmentation activité peut être quantifiée en mesurant la mélanine dans les mélanocytes cultivés directement. Après le traitement des cellules avec la substance d’essai, la mélanine est extraite dans des conditions alcalines et de la teneur en mélanine est quantifiée par spectrophotométrie à 400 nm. Un agent de l’hypopigmentation se traduira par une plus faible teneur de mélanine que les contrôles7.
Enfin, l’activité de l’hypopigmentation peut être quantifiée par la coloration de la mélanine de Fontana-Masson et analyse d’images ultérieures. Coloration de Fontana-Masson, granules de mélanine réduisent le nitrate d’ammoniaque et d’argent à un état métallique noir visible et les zones noires de cellules dans des images microscopiques représentent la quantité de mélanine.
Un agent de l’hypopigmentation donne généralement des résultats cohérents et comparables avec ces trois méthodes, qui confirme que l’activité de la substance est valide. Alternativement, il peut être utile de mesurer l’expression des gènes clés et des protéines dans la mélanogénèse en réponse à une substance d’essai pour examiner l’activité hypopigmentation. En plus de la tyrosinase, protéines tyrosinase (TRP-1) et tautomerase tautomèrase (TRP-2) sont des enzymes critiques dans la mélanogénèse8. Le facteur de transcription associée à une microphtalmie de facteur de transcription (MITF) est un maître régulateur dans la mélanogénèse et la quantification des niveaux d’expression de ses gènes/protéines ou un dosage de l’activité du promoteur permet également d’évaluer l’activité hypopigmentation.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbutin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>#10960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Yakuri Pure Chemicals</td>
			<td>#16223</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold chloride</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>AHG0226</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Samchun chemical</td>
			<td>H0255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bio basic Canada Inc.</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#60218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duksan pure chemicals</td>
			<td>#81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100121</td>
			<td>Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#2163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Union Carbide</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosinase from mushroom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3824</td>
			<td>25 KU</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of hypopigmentation activity in vitro

Cette étude présente les méthodes de laboratoire pour la quantification de l’hypopigmentation activité in vitro. La mélanine, le pigment majeur dans les mélanocytes, est synthétisée en réponse à de multiples facteurs cellulaires et de l’environnementales. La mélanine protège les cellules de la peau contre les dommages UV, mais a aussi des fonctions biochimiques et biophysiques. Production excessive ou l’accumulation de mélanine dans les mélanocytes peut causer des problèmes dermatologiques, comme les taches de rousseur, taches brunes, mélasma et taupes. Donc, le contrôle de la mélanogenèse avec des agents de l’hypopigmentation est important chez les personnes nécessitant des soins cliniques ou cosmétiques. La mélanine est principalement synthétisée dans les mélanosomes de mélanocytes dans un processus biochimique complexe appelé mélanogénèse, qui est influencé par extrinsèque et facteurs intrinsèques, tels que les hormones, l’inflammation, l’âge et exposition à la lumière ultraviolette. Nous décrivons trois méthodes permettant de déterminer l’activité de l’hypopigmentation de produits chimiques ou des substances naturelles dans les mélanocytes : mesure de l’activité de la tyrosinase 1) cellulaires et teneur en mélanine 2) 3) coloration et quantification mélanine cellulaire avec image analyse.
Dans la mélanogénèse, tyrosinase catalyse l’étape cinétiquement limitante qui convertit la L-tyrosine en 3, 4-dihydroxyphénylalanine (L-DOPA), puis en dopaquinone. Par conséquent, l’inhibition de la tyrosinase est un mécanisme primaire d’hypopigmentation. Les mélanocytes, activité de la tyrosinase peut être quantifiée en ajoutant la L-DOPA comme substrat et en mesurant la dopaquinone production par spectrophotométrie. Mélanogénèse peut également être mesurée en quantifiant la teneur en mélanine. La fraction cellulaire contenant de la mélanine est extraite avec NaOH et la mélanine est quantifiée par spectrophotométrie. Enfin, la teneur en mélanine peut être quantifiée par analyse d’image après coloration de Fontana-Masson de la mélanine. Bien que les résultats de ces essais in vitro ne peuvent pas toujours être reproduits dans la peau humaine, ces méthodes sont largement utilisés dans la recherche de la mélanogénèse, surtout comme l’étape initiale pour identifier l’activité potentielle de l’hypopigmentation. Ces méthodes permettent également d’évaluer la différenciation, la croissance et l’activité des mélanocytes. Des résultats cohérents avec les trois différentes méthodes assurer la validité des effets.

Des résultats représentatifs de l’activité de l’hypopigmentation de l’arbutine, un anti-mélanogenèse composés en B16F10 mélanocytes sont indiqués ci-dessous. Figure 1 a montre qu’arbutine supprimée significativement l’activité de la tyrosinase cellulaires comparée au témoin imprégnées sur le véhicule. De même, la teneur en mélanine des cellules stimulées avec arbutine a été réduite significativement par rapport aux témoins (<st...

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Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Nous décrivons trois méthodes expérimentales pour l’évaluation de l’activité de l’hypopigmentation des produits chimiques in vitro : quantification du contenu de l’activité et la mélanine 2) tyrosinase 1) cellulaire et 3) mesure de mélanine de mélanine cellulaire coloration et analyse d’images.

Quantification de l’activité In Vitro de l’Hypopigmentation

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Cette méthode peut être utile dans le développement des cosmétiques fonctionnels et de l’agent de peau avec des activités anti-melanogenic. Il est là pour effectuer et le résultat peut être obtenu rapidement. En outre, cette méthode peut être utile pour les chercheurs, qui veulent identifier ou étudier les effets ou les composés ou étudier les activités antimelanogéniques ou promelanogenic.Pour mesurer à tyrosinase activité commencer par l’ensemencement B16-F10 Mélanicides à cinq fois 10 à la quatrième cellule par puits d’une concentration de 24 plaques de puits dans le milieu complet pendant 24 heures dans un incubateur de culture cellulaire. Le lendemain, remplacez le supernatant dans chaque puits par du DMEM complété par un composé d’essai fraîchement préparé et un contrôle inhibiteur ou un contrôle négatif et retournez la plaque à l’incubateur pendant encore 72 heures. À la fin du traitement rincer les puits deux fois avec 300 microlitres de pbs froids par puits et placer la plaque sur la glace.Ajouter ensuite 300 microlitres de tampon de lyse à chaque puits à l’aide d’un grattoir cellulaire pour recueillir les lysates cellulaires après cinq minutes. Transférez les suspensions de particules cellulaires qui en résultent dans des tubes individuels de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre. Et homogénéiser les lysates trois fois pendant deux secondes à 14 500 r/h sur la glace pour libérer la Tyrosinase intercellulaire.Pelleter les débris cellulaires par centrifugation et transférer les supernatants à des tubes de centrifugeuse individuels de 1,5 millilitre sur la glace. Allouer 70 microlitres de chaque supernatant à des puits individuels d’une micro plaque de polystyrène clair de 96 puits et ajouter 140 microlitres de solution de substrat tyrosinase à chaque puits de supernatant. Secouer la plaque doucement pour mélanger le contenu du puits.Puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Et mesurez l’activité tyrosinase à 475 nanomètres sur un lecteur de microplaque. Mesurer la teneur en mélanine des cellules après avoir recueilli le lysate des cellules traitées comme démontré.Recueillir les lysates par centrifugation et transférer les supernatants dans de nouveaux tubes. Ajouter 300 microlitres d’un hydroxyde de sodium normal à chaque granulé pendant une incubation d’une heure à 60 degrés Celsius. Suivi d’une centrifugation des suspensions cellulaires dissoutes.Ensuite, transférez 200 microlitres des supernatants à chaque puits d’une plaque de puits de 96. Et mesurez le contenu de mélanine sur un lecteur de microplaque à une longueur d’onde de 400 nanomètres. Pour la coloration Fontana-Masson, laver les cellules traitées deux fois avec 300 microlitres de pbs froids et fixer les cellules avec 200 microlitres de 10% de formaline pendant une heure à quatre degrés Celsius.Rincez les cellules épaisses avec de l’eau distillée et ajoutez 200 microlitres de 58 à 68 degrés Celsius solution de travail d’argent ammoniaque à chaque puits. Pendant une heure d’incubation à 37 degrés Celsius ou jusqu’à ce que les cellules deviennent de couleur jaune-brun. Rincer les cellules tachées à l’eau distillée suivie d’une incubation de deux minutes dans du chlorure d’or à 0,1 % à température ambiante.Rincer les cellules traitées au chlorure d’or avec de l’eau distillée et ajouter 200 microlitres de solution de thiosulfate de sodium aux cellules. Après deux minutes, rincer à nouveau les cellules. Et étiquetez les cellules avec 200 microlitres de rouge rapide nucléaire par puits pendant cinq minutes.Lavez ensuite les cellules tachées avec de l’eau du robinet avant de l’imagerie au microscope léger. Pour l’analyse des seuils, ouvrez les images dans l’image J et sélectionnez l’image, ajustez et seuil de couleur. Pour mesurer la zone tachée de Fontana Masson, réglez la barre de paramètres de luminosité à zéro et ajustez la luminosité au point où tous les cellules tachées noires ou brunes sont incluses.Sélectionnez Analyser et analyser les particules et cochez la case résumée dans la fenêtre Analyser les particules, puis cliquez bien pour obtenir un résumé des résultats et copier et coller les données dans une feuille de calcul. Le traitement d’Arbutin supprime de manière significative l’activité cellulaire de Tyrosinase comparée aux cellules traitées de véhicule de contrôle. De même, la teneur en mélanine des cellules stimulées par l’arbutine est considérablement réduite par rapport aux témoins.Bien que les cellules soient morphologiquement similaires entre les groupes de traitement, arbutin diminue la zone de pigment noir par rapport aux cellules traitées de contrôle. Cette méthode est utile pour le dépistage des activités à l’aide de notre bibliothèque composée. Il y a plus de centaines d’échantillons à tester rapidement.En outre, cette méthode peut également être utilisée pour étudier le mécanisme impliquant la mélanogenèse. Après que les composés candidats bioactifs ont été identifiés, pour leur témoignage à l’étude des mécanismes biologiques ou des applications commerciales.

quantification-of-hypopigmentation-activity-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

Détection de l&#39;activité dépendant du pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In vitro</em&gt; et<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Recherche

Biochimie

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

Quantification de l’abondance et la recharge des niveaux d’ARN de transfert chez Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Métabolisme de cartographie : Surveiller l’activité de la Lactate déshydrogénase directement dans le tissu

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Un test In Vitro pour détecter l’activité ARNt-isopentényl transférase

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

Exempt de calibration In Vitro la Quantification des protéines Homo-oligomérisation à l’aide d’instruments commerciaux et Open Source gratuit, logiciel d’analyse de luminosité

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of physiological processes. Mitochondrial dysfunction is a primary cause of a number of metabolic and neurodegenerative diseases. Intact mitochondria are critical for their proper functioning. The enzyme citrate synthase is localized in the mitochondrial matrix and thus can be used as a quantitative enzyme marker of intact mitochondrial mass. Given that many molecules and pathways that have important functions in mitochondria are highly conserved between humans and Drosophila, and that an array of powerful genetic tools are available in Drosophila, Drosophila serves as a good model system for studying mitochondrial function. Here, we present a protocol for fast and simple measurement of citrate synthase activity in tissue homogenate from adult flies without isolating mitochondria. This protocol is also suitable for measuring citrate synthase activity in larvae, cultured cells, and mammalian tissues.

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

We present a protocol for a colorimetric assay of citrate synthase activity for quantification of intact mitochondrial mass in Drosophila tissue homogenates.

Une description colorimétrique de l'activité de Synthase Citrate dans Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids are conserved lipid mediators that regulate multiple biological processes in a variety of organisms. In C. elegans, 2-AG has been found to possess different roles, including modulation of dauer formation and cholesterol metabolism. This report describes a method to overcome the difficulties associated with the costs and stability of deuterated standards required for 2-AG quantification. The procedure for the synthesis of the standard is simple and can be performed in any laboratory, without the need for organic synthesis expertise or special equipment. In addition, a modification of Folch&#39;s method to extract the deuterated standard from C. elegans culture is described. Finally, a quantitative and analytic method to detect 2-AG using the stable isotopically labeled analog 1-AG-d5 is described, which provides reliable results in a fast-chromatographic run. The procedure is useful for studying the multiple roles of 2-AG in C. elegans while also being applicable to other studies of metabolites in different organisms.

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work describes a robust and straightforward method to detect and quantify the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegans. An analytical deuterated standard us prepared and used for the quantification of 2-AG by isotopic dilution and liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS).

Synthèse d'une norme deuterated pour la quantification de 2-Arachidonoylglycerol à Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

Quantification de la dynamique du réseau d'interaction des protéines à l'aide de la co-immunoprécipitation multiplexée

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

Quantification de la coenzyme A dans les cellules et les tissus

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Quantification à haut débit de la synthèse et de la distribution de l’ADNmt

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

Pleins feux sur l’auteur : Quantification à haut débit de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial  

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

Quantification à haut débit basée sur l’image de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...