Name: quantification of hypopigmentation activity in vitro
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00
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Diese Arbeit wurde vom Korea Institute of Planning und Bewertung für Technologie in der Ernährung, Landwirtschaft und Forstwirtschaft (IPET) durch das Agri-Bioindustrie Technology Development Program, finanziert von der Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (MAFRA unterstützt. ) (116159-02-2-WT011) und Hochschule für Life Sciences und Biotechnologie für BK21 PLUS, Korea University.

1. Vorbereitung von Mediums, Verbindungen und Reagenzien
<ol><li>B16F10 komplette Wachstumsmedium vorzubereiten. Ergänzung Dulbecco geändert Adlers Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (PEST).<ol>
<li>Um 500 mL des kompletten Medium zu machen, mischen Sie 445 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 50 mL der FBS und 5 mL von PEST in eine sterilisierte Glasflasche 1 L. Nach dem Mischen sanft, Filtern Sie das Medium durch einen 0,2 µm Flaschenverschluss Filter, u...

<ol>
	<li>Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+controlling+the+migration+of+melanocytes+and+melanoma+cells.">Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. 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Wir präsentierten Protokolle für die Bewertung der Hypopigmentation Aktivität der Testverbindungen mit kultivierten Melanozyten. Die repräsentativen Ergebnisse zeigten die Hypopigmentation Wirkung von Arbutin, ein Tyrosinase-Inhibitoren, die Tyrosinase-Aktivität und zellulären Melanin Inhalt gehemmt. Diese Methoden sind in der Anti-Melanogenic Aktivität Forschung verbreitet. Mit diesen Tests, haben wir auch erfolgreich identifiziert mehrere bioaktive Substanzen, die Melanogenese hemmende Effekte auf B16F10 Zellen ...

Melanin spielt eine entscheidende Rolle in der Physiologie, Pathologie und Toxikologie mehrere Organe einschließlich der Haut, Augen und Gehirn1. Hauptfunktionen von Melanin sind Foto-Screening und biochemischen Wirkungen. Melanin absorbiert Nah-Infrarot- und sichtbares Licht sowie Ultraviolett (UV) Strahlung, mit erhöhten Absorptionsraten bei kürzeren Wellenlängen des Lichts; Melanin schützt somit vor Schäden durch sichtbares Licht oder UV Strahlung2Gewebe. Melanin ist ein Antioxidans und hat eine Affinität für Metalle und andere giftigen Chemikalien; Daher kann es Gewebe vor oxidativen und chemischen Stress3schützen. Allerdings verursacht die übermäßige Produktion von Melanin dermatologische Probleme.
Die Quantität und Qualität von Melanin in der Haut und Iris sind die wichtigsten Determinanten der Farbe der Iris und der Haut. Menschen können unterschiedlicher Hautfarbe Farbvorlieben haben; Einige bevorzugen gebräunten Haut, während andere hellere Hautfarben bevorzugen. Abhängig von diesen Verbraucherprofile entwickelten Hypopigmentierung Kosmetik Einzelmärkte für bevorzugte Haut Farben4zu befriedigen. Dementsprechend sind Studien der Hypopigmentation und Anti-Melanogenic Tätigkeit wichtig, sowohl wissenschaftlich als auch praktisch.
Melanogenese ist der komplexe Prozess der Melanin Biosynthese durch eine Reihe von enzymatischen und spontane chemische Reaktionen in Melanozyten. Eine Melanozyten ist umgeben von ca. 36 Keratinozyten und Melanozyten sind die Melanin-Synthese-Fabriken, die ihr Produkt zu benachbarten Keratinozyten verteilen. In der Haut wird das Melanin produziert und gespeichert in der Melanosomal Fach der Melanozyten zu benachbarten Keratinozyten in die Epidermis über Dendriten transportiert.
L-Tyrosin dient als das ursprüngliche Substrat für Melanogenese und das Enzym Tyrosinase zwei aufeinander folgende Reaktionen katalysiert, die L-Tyrosin in 3,4-Dihydroxyphenylalanine (DOPA) und dann in Dopaquinone umwandeln. Diese Reaktionen sind die Bandbreitenbegrenzung Schritt Melanogenese5,6. Dementsprechend kann Hypopigmentierung Aktivität zuerst durch Beurteilung zellulärer Tyrosinase-Aktivität direkt gemessen werden. Hierzu sind Melanozyten Extrakte mit Tyrosinase mit DOPA inkubiert und die Dopaquinone produziert in den Proben gemessen werden, durch Spektralphotometrie auf 475 nm. Die Werte werden durch die Proteinkonzentrationen der Proben und Stoffe mit Hypopigmentierung Aktivität führen zu weniger Dopaquinone Bildung im Vergleich zu Kontrollen normalisiert.
Zweitens kann Hypopigmentierung Aktivität durch Messung von Melanin in kultivierten Melanozyten direkt quantifiziert werden. Nach der Behandlung der Zellen mit dem Testmaterial, Melanin unter alkalischen Bedingungen gewonnen wird und der Melanin Inhalt wird quantifiziert durch Spektralphotometrie bei 400 nm. Ein Hypopigmentierung Agent führt zu einem niedrigeren Gehalt an Melanin als die Kontrollen-7.
Schließlich kann die Hypopigmentation Aktivität mit Fontana-Masson Melanin Färbung und anschließende Bildanalyse quantifiziert werden. In der Fontana-Masson Färbung, Melanin Granulat Ammoniak-Silbernitrat auf einen sichtbaren schwarzen metallischen Zustand reduzieren und die schwarzen Bereiche von Zellen in mikroskopische Aufnahmen repräsentieren die Menge an Melanin.
Ein Hypopigmentierung Agent gibt in der Regel einheitliche und vergleichbare Ergebnisse mit diesen drei Methoden, die bestätigt, dass die Aktivität des Stoffes gültig ist. Alternativ kann es nützlich, um den Ausdruck von wichtigen Genen und Proteinen in Melanogenese in Beantwortung einer Prüfsubstanz Hypopigmentierung Aktivität untersuchen zu messen sein. Wichtige Enzyme in Melanogenese8sind neben Tyrosinase Tyrosinase-related Proteine (TRP-1) und Dopachrome Tautomerase (TRP-2). Die Transkription Faktor Mikrophthalmie-assoziierter Transkriptionsfaktor (MITF) ist ein master Regulator Melanogenese und Quantifizierung von seiner gen/Proteingehalte Ausdruck oder ein Promotor-Aktivität-Assay kann auch zur Hypopigmentierung Tätigkeit zu beurteilen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbutin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>#10960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Yakuri Pure Chemicals</td>
			<td>#16223</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold chloride</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>AHG0226</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Samchun chemical</td>
			<td>H0255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bio basic Canada Inc.</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#60218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duksan pure chemicals</td>
			<td>#81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100121</td>
			<td>Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#2163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Union Carbide</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosinase from mushroom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3824</td>
			<td>25 KU</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of hypopigmentation activity in vitro

Diese Studie stellt Labormethoden für die Quantifizierung von Hypopigmentierung Aktivität in vitro. Melanin, das große Pigment in Melanozyten, wird als Reaktion auf mehrere zelluläre und umweltbedingten Faktoren synthetisiert. Melanin schützt die Hautzellen vor UV-Schäden, aber auch biophysikalische und biochemische Funktionen hat. Übermäßige Produktion oder Ansammlung von Melanin in den Melanozyten kann dazu führen, dass dermatologische Problemen, wie z. B. Muttermale, Sommersprossen, Pigmentflecken und Melasma. Daher ist die Kontrolle der Melanogenese mit Hypopigmentierung Agenten wichtig bei Patienten mit klinischen oder kosmetische Bedürfnisse. Melanin wird in erster Linie in den Melanosomen Melanozyten in einen komplexen biochemischen Prozess namens Melanogenese, welche von der Erwartungshaltung extrinsischen und intrinsischen Faktoren wie Hormone, Entzündungen, Alter und UV-Licht Exposition synthetisiert. Wir beschreiben drei Methoden zur Bestimmung der Hypopigmentation Aktivität von chemischen oder natürlichen Substanzen in Melanozyten: Messung von (1) zellulären Tyrosinase-Aktivität und Melanin (2) Inhalt und (3) Färbung und Quantifizierung zellulären Melanin mit Bild Analyse.
In Melanogenese katalysiert Tyrosinase die Bandbreitenbegrenzung Schritt, der L-Tyrosin in 3,4-Dihydroxyphenylalanine (l-Dopa) und dann in Dopaquinone umwandelt. Daher ist die Hemmung der Tyrosinase eine primäre Hypopigmentierung Mechanismus. In kultivierten Melanozyten kann Tyrosinase-Aktivität durch Hinzufügen von l-Dopa als Substrat und Messung Dopaquinone Produktion durch Spektralphotometrie quantifiziert werden. Melanogenese kann auch durch Quantifizierung des Melanin Inhalts gemessen werden. Der Melanin-haltigen zelluläre Anteil wird mit NaOH extrahiert und Melanin wird spektrophotometrisch quantifiziert. Zu guter Letzt kann der Melanin Inhalt durch die Bildanalyse nach Fontana-Masson Färbung von Melanin quantifiziert werden. Obwohl die Ergebnisse dieser in-vitro-Untersuchungen nicht immer in der menschlichen Haut reproduziert werden können, sind diese Methoden vor allem als erster Schritt um potenzielle Hypopigmentierung Aktivitäten zu erkennen in der Melanogenese Forschung, verbreitet. Diese Methoden können auch zur Aktivität der Melanozyten, Wachstum und Differenzierung zu bewerten. Die Gültigkeit der Effekte gewährleisten konsistente Ergebnisse mit drei verschiedenen Methoden.

Repräsentative Ergebnisse für die Hypopigmentation Aktivität von Arbutin, ein Anti-Melanogenic compound in B16F10 Melanozyten sind unten dargestellt. Abbildung 1A zeigt, dass Arbutin deutlich unterdrückt die zelluläre Tyrosinase-Aktivität im Vergleich mit dem Fahrzeug behandelt. In ähnlicher Weise wurde der Melanin Inhalt von Zellen stimuliert mit Arbutin deutlich im Vergleich mit den Reglern (Abbildung 1 b) reduziert. Mik...

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Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Wir beschreiben drei experimentelle Methoden zur Bewertung der Hypopigmentation Aktivität von Chemikalien, die in-vitro-: Quantifizierung der 1) zellulären Tyrosinase-Aktivität und Melanin (2) Inhalt und (3) Messung von Melanin durch zelluläre Melanin Färbung und Bildanalyse.

Quantifizierung der Hypopigmentation Aktivität In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Diese Methode kann bei der Entwicklung von funktionellen Kosmetika und Hautwirkstoffen mit antimelanogenen Aktivitäten hilfreich sein. Es ist da zu performen und das Ergebnis kann schnell erhalten werden. Darüber hinaus kann diese Methode für Forscher nützlich sein, die die Wirkungen oder die Verbindungen identifizieren oder untersuchen oder die antimelanogene oder promelanogene Aktivitäten untersuchen möchten.Zur Messung der Tyrosinase-Aktivität beginnen mit der Aussaat von B16-F10 Melaniziden bei einer fünfmal 10 bis vierten Zelle pro Bohrkörper einer 24-Well-Platten-Konzentration in komplettem Medium für 24 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Tag den Überstand in jedem Brunnen durch DMEM, ergänzt durch frisch zubereitete Testverbindung und Inhibitorkontrolle oder eine Negativkontrolle, und geben Sie die Platte für weitere 72 Stunden an den Inkubator zurück. Am Ende der Behandlung spülen Sie die Brunnen zweimal mit 300 Mikroliterkalten pbs pro Brunnen ab und legen Sie die Platte auf Eis.Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter Lysepuffer zu jedem Brunnen mit einem Zellschaber hinzu, um die Zelllysate nach fünf Minuten zu sammeln. Übertragen Sie die resultierenden Zellpartikelsuspensionen auf einzelne 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren. Und homogenisieren Sie die Lysate dreimal für zwei Sekunden bei 14 500 Rpm auf Eis, um die interzelluläre Tyrosinase freizusetzen.Pellet die Zellablagerungen durch Zentrifugation und übertragen Sie die Überschärzeichen auf einzelne 1,5 Milliliter Zentrifugenrohre auf Eis. Weisen Sie 70 Mikroliter jedes Überstandes einzelnen Brunnen einer klaren 96 Well Polystyrol-Mikroplatte zu und fügen Sie 140 Mikroliter Tyrosinase Substratlösung zu jedem Brunnen des Überstandes. Schütteln Sie die Platte sanft, um den Brunneninhalt zu mischen.Dann bebrüten die Platte bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Und messen Sie die Tyrosinase-Aktivität bei 475 Nanometern auf einem Mikroplattenleser. Um den Melaningehalt der Zellen nach dem Sammeln des Lysats der behandelten Zellen wie nachgewiesen zu messen.Sammeln Sie die Lysate durch Zentrifugation und übertragen Sie die Überstande in neue Schläuche. Fügen Sie 300 Mikroliter eines normalen Natriumhydroxids zu jedem Pellet für eine eine Stunde Inkubation bei 60 Grad Celsius hinzu. Gefolgt von der Zentrifugation der gelösten Zellsuspensionen.Dann 200 Mikroliter der Überräube auf jeden Brunnen einer 96-Well-Platte übertragen. Und messen Sie den Melaningehalt auf einem Mikroplattenleser bei einer Wellenlänge von 400 Nanometern. Für Fontana-Masson Staining, waschen Sie die behandelten Zellen zweimal mit 300 Mikroliter kalten pbs und fixieren Sie die Zellen mit 200 Mikroliter von 10%formalin für eine Stunde bei vier Grad Celsius.Spülen Sie die dicken Zellen mit destilliertem Wasser und fügen Sie 200 Mikroliter von 58 bis 68 Grad Celsius Ammoniak silber Arbeitslösung zu jedem Brunnen. Für eine Stunde Inkubation bei 37 Grad Celsius oder bis die Zellen gelbbraun werden. Spülen Sie die gebeizten Zellen mit destilliertem Wasser, gefolgt von einer zweiminütigen Inkubation in 0,1% Goldchlorid bei Raumtemperatur.Spülen Sie die mit Goldchlorid behandelten Zellen mit destilliertem Wasser und fügen Sie den Zellen 200 Mikroliter Natriumthiosulfatlösung hinzu. Nach zwei Minuten spülen Sie die Zellen wieder ab. Und beschriften Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern Kernschnellrot pro Brunnen für fünf Minuten.Dann waschen Sie die gefärbten Zellen mit Leitungswasser, bevor Sie unter einem Lichtmikroskop bildgeben. Öffnen Sie für die Schwellenwertanalyse die Bilder in Bild J, und wählen Sie Bild, Anpassen und Farbschwellenwert aus. Um den mit Fontana Masson befleckten Bereich zu messen, stellen Sie die Helligkeitsparameterleiste auf Null ein und passen Sie die Helligkeit an den Punkt an, an dem alle schwarzen oder braun enrbierten Zellen enthalten sind.Wählen Sie Partikel analysieren und analysieren aus, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Im Fenster Partikel analysieren, und klicken Sie dann auf "OKAY", um eine Zusammenfassung der Ergebnisse zu erhalten und die Daten in eine Kalkulationstabelle zu kopieren und einzufügen. Die Arbutin-Behandlung unterdrückt die zelluläre Tyrosinase-Aktivität signifikant im Vergleich zu kontrollfahrzeugbehandelten Zellen. In ähnlicher Weise ist der Melaningehalt von Zellen, die mit Arbutin stimuliert werden, im Vergleich zu den Kontrollen signifikant reduziert.Obwohl die Zellen zwischen den Behandlungsgruppen morphologisch ähnlich sind, verringert Arbutin den Bereich des schwarzen Pigments im Vergleich zu den kontrollbehandelten Zellen. Diese Methode ist nützlich für Aktivitäten Screening mit unserer zusammengesetzten Bibliothek. Es gibt über Hunderte von Proben, die schnell getestet werden müssen.Darüber hinaus kann diese Methode auch verwendet werden, um den Mechanismus mit Melanogenese zu untersuchen. Nachdem die bioaktiven Kandidaten Verbindungen identifiziert wurden, für ihr Zeugnis für die Untersuchung der biologischen Mechanismen oder kommerzielle Anwendungen.

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In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...