Name: quantification of hypopigmentation activity in vitro
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קוריאה המכון של תכנון והערכה עבור טכנולוגיית מזון, חקלאות, יערנות (IPET) באמצעות תוכנית פיתוח טכנולוגיה Agri-Bioindustry, ממומן על ידי משרד החקלאות, המזון, לענייני כפרי (MAFRA ) (116159-02-2-WT011), בית הספר למדעי החיים וביוטכנולוגיה BK21 פלוס, אוניברסיטת קוריאה.

1. הכנת בינוני, תרכובות, ריאגנטים
<ol><li>להכין B16F10 מדיום מלאה של הגידול. תוספת של Dulbecco ששינה בינוני הנשר (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (המזיק).<ol>
<li>כדי להפוך את 500 מ"ל של מדיום מלאה, מערבבים 445 מ הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) 50 מ של FBS, 5 מ של המזיק בבקבוק זכוכית מעוקר 1 ליטר. ל...

<ol>
	<li>Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+controlling+the+migration+of+melanocytes+and+melanoma+cells.">Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin.">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).</li><li>Galvan, I., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+chemistry+and+the+ecology+of+stress.">Melanin chemistry and the ecology of stress.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).</li><li>Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+whitening+cosmetics:+Feedback+and+challenges+in+the+development+of+natural+skin+lighteners.">Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners.</a> Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).</li><li>Cooksey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+indirect+formation+of+the+catecholic+intermediate+substrate+responsible+for+the+autoactivation+kinetics+of+tyrosinase.">Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).</li><li>Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+identify+inhibitors+of+melanin+biosynthesis+via+the+quality+control+of+tyrosinase.">Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).</li><li>Gillbro, J. M., Olsson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanogenesis+and+mechanisms+of+skin-lightening+agents+-+existing+and+new+approaches.">The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches.</a> International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).</li><li>Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+in+the+study+of+human+skin+melanocytes.">Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes.</a> Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Momilactione+B+inhibits+protein+kinase+A+signaling+and+reduces+tyrosinase-related+proteins+1+and+2+expression+in+melanocytes.">Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes.</a> Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibitions+of+lemon+balm+(Melissa+officinalis)+ethanolic+extract+on+melanogenesis+in+B16-F1+murine+melanocytes:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+its+gene+expression.">Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression.</a> Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-Coumaric+acid+inhibition+of+CREB+phosphorylation+reduces+cellular+melanogenesis.">p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis.</a> European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibition+of+&#947;-oryzanol+on+cellular+melanogenesis:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+reduction+of+melanogenic+gene+expression+by+a+protein+kinase+a-dependent+mechanism.">Dual inhibition of &#947;-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism.</a> Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).</li><li>Choi, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+isoflavone+puerarin+and+its+glycosides+on+melanogenesis+in+B16+melanocytes.">Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes.</a> European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).</li><li>Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+reduces+cellular+melanin+content+via+suppression+of+microphthalmia-associated+transcription+factor+in+B16-F1+murine+melanocytes.">Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes.</a> Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).</li><li>Overwijk, W. W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B16+as+a+mouse+model+for+human+melanoma.">B16 as a mouse model for human melanoma.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+protocol+for+assessing+regulators+of+pigmentation.">A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation.</a> Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).</li><li>D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+melanogenesis.">Signaling pathways in melanogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).</li><li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage:+interactions+between+KIT+and+MITF.">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).</li><li>Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-MSH+and+melanogenesis+in+normal+human+adult+melanocytes.">&#945;-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).</li><li>Hu, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+evaluation+of+melanin+content+and+production+of+pigment+cells+in+vitro.">Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).</li><li>Carriel, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+histochemical+method+for+a+simultaneous+staining+of+melanin+and+collagen+fibers.">A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).</li></ol>

הצגנו פרוטוקולים להערכת הפעילות היפופיגמנטציה של תרכובות בדיקת שימוש בתרבית מלנוציטים. התוצאות נציג הראו את השפעת היפופיגמנטציה יערות, מעכב tyrosinase זה עכבות פעילות tyrosinase ותוכן מלנין הסלולר. שיטות אלה נמצאים בשימוש נרחב במחקר פעילות אנטי-melanogenic. באמצעות מבחני האלה, גם בהצלחה זיהינו מספר תר?...

מלנין תפקיד קריטי, פיזיולוגיה, פתולוגיה, טוקסיקולוגיה של מספר איברים לרבות עור, עיניים, המוח1. התפקידים העיקריים של מלנין תופעות צילום-הקרנה וביוכימי. המלנין סופג אור אינפרא אדום ונראה לעין, כמו גם קרינת אולטרה סגול (UV), עם קליטה מוגברת ממחירים באורכי גל קצרים יותר של אור; לפיכך, מלנין מגן על רקמות מן הנזק שנגרם על ידי האור הנראה או קרינת UV2. מלנין הוא נוגד חמצון, יש זיקה מתכות וכימיקלים רעילים אחרים; לכן, זה באפשרותך להגן על רקמות סטרס חמצוני וכימיים3. עם זאת, ייצור יתר של המלנין גורם בעיות עור.
ובאיכות של מלנין בעור, איריס הן גורמים החשובים ביותר של הצבע של איריס, העור. אנשים אולי יש העדפות צבע עור שונים; כמה טובה לעור שזוף, בעוד אחרים לטובת עור בצבעים בהירים יותר. בהתאם פרופילים אלה הצרכן, מוצרי קוסמטיקה היפופיגמנטציה פותחו כדי לספק שווקים נפרדים עבור העור המועדף צבעים4. בהתאם לכך, מחקרים של היפופיגמנטציה ופעילות אנטי-melanogenic חשובים הן מבחינה מדעית והן מבחינה מעשית.
Melanogenesis הוא תהליך מורכב של מלנין ביוסינטזה דרך סדרה של תגובות כימיות אנזימטי ספונטנית של מלנוציטים. מלנוציט אחד מוקף כ 36 keratinocytes, melanocytes הם המפעלים סינתזת המלנין להפיץ את המוצר שלהם כדי keratinocytes שכנות. העור, המלנין מיוצר ומאוחסן בתא melanosomal של מלנוציטים מועבר keratinocytes שכנות בתוך האפידרמיס ויה דנדריטים.
L-טירוזין משמשת מצע ראשוני עבור melanogenesis ו- tyrosinase את האנזים מזרז שתי תגובות רצופות להמיר L-טירוזין לתוך 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) ולאחר מכן לתוך dopaquinone. תגובות אלו הן הצעד הגבלת קצב ב-5,melanogenesis6. בהתאם לכך, פעילות היפופיגמנטציה קודם נמדד על ידי הערכת הפעילות התאית tyrosinase ישירות. כדי לעשות זאת, תמציות מלנוציט המכיל tyrosinase מודגרת עם DOPA ולא dopaquinone המיוצר הדגימות נמדד על ידי ספקטרופוטומטר-475 ננומטר. הערכים הם מנורמל על ידי ריכוז חלבון של דגימות, וכן חומרים מהתוצאה פעילות היפופיגמנטציה תפקידים במערך dopaquinone פחות בהשוואה עם פקדים.
שנית, ניתן לכמת פעילות היפופיגמנטציה על ידי מדידת מלנין בעור מלנוציטים בתרבית ישירות. לאחר מטפלים תאים עם החומר במבחן, מלנין מופק בתנאים אלקליין, התוכן מלנין הוא לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר 400 nm. סוכן היפופיגמנטציה תגרום תוכן מלנין נמוכה יותר מאשר הפקדים7.
לבסוף, ניתן לכמת את הפעילות היפופיגמנטציה על ידי פונטנה-מאסון מלנין מכתים וניתוח תמונות עוקבות. פונטנה-מאסון מכתים, גרגרי המלנין להפחית חנקת אמוניה-הכסף למצב מתכתי שחור גלויה, שחור באזורים של תאים בתמונות מיקרוסקופיים מייצגים את כמות המלנין.
סוכן היפופיגמנטציה בדרך כלל נותן תוצאות דומות בקנה אחד עם שלוש שיטות אלה, שמאשר כי הפעילות של החומר הוא חוקי. לחלופין, זה עשוי להיות שימושי למדוד את הביטוי של גנים מרכזיים, חלבונים ב- melanogenesis בתגובה חומר המבחן לבחון פעילות היפופיגמנטציה. בנוסף tyrosinase, חלבונים הקשורים tyrosinase (TRP-1) dopachrome tautomerase (TRP-2) הם קריטיים לאנזימים melanogenesis8. גורם שעתוק microphthalmia-הקשורים פקטור שעתוק (MITF) הוא הרגולטור הראשי melanogenesis, כימות של רמות ביטוי גנים/חלבון שלה או assay פעילות יזם יכול לשמש גם כדי להעריך את פעילות היפופיגמנטציה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbutin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>#10960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Yakuri Pure Chemicals</td>
			<td>#16223</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold chloride</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>AHG0226</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Samchun chemical</td>
			<td>H0255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bio basic Canada Inc.</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#60218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duksan pure chemicals</td>
			<td>#81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100121</td>
			<td>Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#2163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Union Carbide</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosinase from mushroom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3824</td>
			<td>25 KU</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of hypopigmentation activity in vitro

מחקר זה מציג שיטות מעבדה כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה. מלנין, הפיגמנט העיקרי של מלנוציטים, הוא מסונתז בתגובה מספר גורמים הסלולר וסביבתיים. המלנין מגן על תאי העור מפני נזק אולטרה, אך יש גם פונקציות biophysical הביוכימי. ייצור יתר או הצטברות של מלנין בעור מלנוציטים עלול לגרום לבעיות עור, כגון, כתמים כהים, melasma, שומות ונמשים. לכן, השליטה של melanogenesis עם סוכנים היפופיגמנטציה חשוב אצל אנשים בעלי צרכים רפואיים או קוסמטיים. מלנין הוא מסונתז בעיקר melanosomes של מלנוציטים תהליך ביוכימי מורכב שנקרא melanogenesis, אשר מושפע חיצוני, פנימי גורמים, כגון הורמונים, דלקות, גיל חשיפה אור אולטרה סגול. אנו מתארים שלוש שיטות כדי לקבוע את הפעילות היפופיגמנטציה של כימיקלים או חומרים טבעיים בתוך המלנוציטים: מדידה של פעילות הסלולר 1) tyrosinase ו 2) מלנין תוכן, ו 3) צביעת וכימות מלנין הסלולר עם תמונה ניתוח.
ב- melanogenesis, tyrosinase מזרז את הצעד הגבלת קצב הממירה L-טירוזין לתוך 3,4-dihydroxyphenylalanine (בסדר גמור) ולאחר מכן לתוך dopaquinone. לכן, עיכוב של tyrosinase הוא מנגנון היפופיגמנטציה תפקידים ראשיים. ב מלנוציטים תרבותי, ניתן לכמת פעילות tyrosinase על-ידי הוספת בסדר גמור כמו מצע ומדידת dopaquinone הייצור על ידי ספקטרופוטומטר. Melanogenesis גם נמדד על ידי לכימות התוכן מלנין. השבר תאי המלנין המכילים מופק עם NaOH, מלנין הוא לכמת spectrophotometrically. לבסוף, ניתן לכמת את התוכן מלנין מאת ניתוח תמונות בעקבות פונטנה-מאסון מכתים של מלנין. למרות התוצאות של מבחני במבחנה אלה לא תמיד לשכפל בעור האדם, שיטות אלה נמצאים בשימוש נרחב במחקר melanogenesis, במיוחד כשלב ראשוני לזיהוי פעילות היפופיגמנטציה פוטנציאליים. שיטות אלה יכולים לשמש גם כדי להעריך את פעילות מלנוציט צמיחה, בידול. תוצאות עקביות עם שלוש שיטות שונות לוודא את החוקיות של האפקטים.

נציג תוצאות הפעילות היפופיגמנטציה של יערות, anti-melanogenic במתחם, ב- B16F10 מלנוציטים מוצגים להלן. איור 1A מציג שאת יערות באופן משמעותי לדכא את הפעילות התאית tyrosinase לעומת הפקד שטופלו הרכב. באופן דומה, התוכן המלנין בתאי מגורה עם יערות פחתו משמעותית בהשוואה עם הפקדים (...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

אנו מתארים שלוש שיטות להערכת הפעילות היפופיגמנטציה של כימיקלים במבחנה: כימות של פעילות tyrosinase 1) סלולר ותוכן 2) מלנין, או 3) מידה של מלנין מאת צביעת תאי המלנין וניתוח התמונה.

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

שיטה זו עשויה להיות מועילה בפיתוח של קוסמטיקה פונקציונלית סוכן העור עם פעילויות אנטי מלנוגנית. זה שם כדי לבצע את התוצאה ניתן להשיג במהירות. בנוסף, שיטה זו עשויה להיות שימושית עבור חוקרים, שרוצים לזהות או לחקור את ההשפעות או את התרכובות או לחקור את הפעילות antimelanogenic או promelanogenic.כדי למדוד את פעילות טירוזינאז להתחיל על ידי זריעת B16-F10 מלניקים בחמש פעמים 10 לתאים הרביעי ל הבאר של ריכוז צלחת 24 גם במדיום מלא במשך 24 שעות באינקובטור תרבות התא. למחרת, להחליף את supernatant בכל באר עם DMEM בתוספת תרכובת בדיקה מוכנה טרי שליטה מעכב או שליטה שלילית ולהחזיר את הצלחת לחממה עוד 72 שעות. בסוף הטיפול שוטפים את בארות פעמיים עם 300 microliters של pbs קר לגם ולה מניחים את הצלחת על קרח.הבא להוסיף 300 microliters של מאגר תזה לכל באר באמצעות מגרד תאים כדי לאסוף את התא lysates לאחר חמש דקות. העבר את המתלים חלקיק התא וכתוצאה מכך בודדים 1.5 צינורות מיקרו צנטריפוגה מיליליטר. ולהומוגניזציה lysates שלוש פעמים במשך שתי שניות ב 14, 500 סל"ד על קרח כדי לשחרר את טירוזינאז intercellular.גלולה פסולת התא על ידי צנטריפוגה ולהעביר את supernatants לצינורות צנטריפוגה בודדים 1.5 מיליליטר על קרח. להקצות 70 microliters של כל על טבעי בארות בודדות של ברור 96 צלחת מיקרו פוליסטירן היטב ולהוסיף 140 microliters של פתרון מצע טירוזינאז לכל באר של על טבעי. מנענעים את הצלחת בעדינות כדי לערבב את תכולת הבאר.ואז לה הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. ולמדוד לפעילות טירוזינאז ב 475 ננומטר על קורא מיקרופלסטיק. כדי למדוד את תוכן המלנין של התאים לאחר איסוף lysate של התאים המטופלים כפי שהוכח.לאסוף את lysates על ידי צנטריפוגה ולהעביר את supernatants לצינורות חדשים. מוסיפים 300 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסידי רגיל אחד לכל גלולה למשך שעה אחת של דגירה ב-60 מעלות צלזיוס. ואחריו צנטריפוגה של השעיות התא מומס.ואז להעביר 200 microliters של supernatants לכל באר של צלחת 96 היטב. ולמדוד את תכולת המלנין על קורא מיקרופלסטיק באורך גל של 400 ננומטר. עבור פונטנה-מאסון כתמים, לשטוף את התאים שטופלו פעמיים עם 300 microliters של pbs קר לתקן את התאים עם 200 microliters של 10% פורמלין במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.שוטפים את התאים העבים במים מזוקקים ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של 58 עד 68 מעלות צלזיוס אמוניקלי כסף פתרון עבודה לכל באר. במשך שעה אחת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס או עד התאים הופכים צהוב חום בצבע. שוטפים את התאים המוכתמים במים מזוקקים ואחריהם דגירה של שתי דקות בכלוריד זהב 0.1% בטמפרטורת החדר.לשטוף את התאים המטופלים כלוריד זהב עם מים מזוקקים ולהוסיף 200 microliters של פתרון thiosulfate נתרן לתאים. לאחר שתי דקות לשטוף את התאים שוב. ולתייג את התאים עם 200 מיקרוליטרים של אדום גרעיני מהיר לכל באר במשך חמש דקות.לאחר מכן לשטוף את התאים מוכתמים עם מי ברז לפני הדמיה תחת מיקרוסקופ אור. לניתוח סף, פתחו את התמונות בתמונה J ובחרו תמונה, התאמה ותסף צבע. כדי למדוד את האזור המוכתם בפונטנה מאסון, הגדר את סרגל הפרמטרים של הבהירות לאפס והתאם את הבהירות לנקודה שבה נכללים כל התאים המוכתמים בשחור או חום.בחר נתח ונתח חלקיקים וסמן את התיבה מסכם בחלון נתח חלקיקים ולאחר מכן לחץ על אישור כדי לקבל סיכום של התוצאות ולהעתיק ולהדביק את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני. טיפול Arbutin מדכא באופן משמעותי פעילות טירוזינאז הסלולר לעומת תאים מטופלים ברכב בקרה. באופן דומה התוכן מלנין של תאים מגורה עם Arbutin מצטמצם באופן משמעותי בהשוואה לפקדים.למרות התאים דומים מורפולוגית בין קבוצות טיפול, Arbutin מקטין את האזור של פיגמנט שחור לעומת התאים המטופלים שליטה. שיטה זו שימושית להקרנת פעילויות באמצעות הספרייה המורכבת שלנו. יש יותר ממאות דגימות להיבדק במהירות.יתר על כן שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור את המנגנון מעורבים מלנוגנזה. לאחר שזוהו תרכובות המועמדים הביו-אקטיביים, בעדותם לחקר מנגנונים ביולוגיים או יישומים מסחריים.

quantification-of-hypopigmentation-activity-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

מיפוי החומרים: פיקוח על פעילות לקטט דהידרוגנאז ישירות בתוך הרקמה

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of physiological processes. Mitochondrial dysfunction is a primary cause of a number of metabolic and neurodegenerative diseases. Intact mitochondria are critical for their proper functioning. The enzyme citrate synthase is localized in the mitochondrial matrix and thus can be used as a quantitative enzyme marker of intact mitochondrial mass. Given that many molecules and pathways that have important functions in mitochondria are highly conserved between humans and Drosophila, and that an array of powerful genetic tools are available in Drosophila, Drosophila serves as a good model system for studying mitochondrial function. Here, we present a protocol for fast and simple measurement of citrate synthase activity in tissue homogenate from adult flies without isolating mitochondria. This protocol is also suitable for measuring citrate synthase activity in larvae, cultured cells, and mammalian tissues.

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

We present a protocol for a colorimetric assay of citrate synthase activity for quantification of intact mitochondrial mass in Drosophila tissue homogenates.

מטריקה שיטת הצביעה של פעילות ציטראט סינתאז בדרוזופילה מלאנוסטר

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids are conserved lipid mediators that regulate multiple biological processes in a variety of organisms. In C. elegans, 2-AG has been found to possess different roles, including modulation of dauer formation and cholesterol metabolism. This report describes a method to overcome the difficulties associated with the costs and stability of deuterated standards required for 2-AG quantification. The procedure for the synthesis of the standard is simple and can be performed in any laboratory, without the need for organic synthesis expertise or special equipment. In addition, a modification of Folch&#39;s method to extract the deuterated standard from C. elegans culture is described. Finally, a quantitative and analytic method to detect 2-AG using the stable isotopically labeled analog 1-AG-d5 is described, which provides reliable results in a fast-chromatographic run. The procedure is useful for studying the multiple roles of 2-AG in C. elegans while also being applicable to other studies of metabolites in different organisms.

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work describes a robust and straightforward method to detect and quantify the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegans. An analytical deuterated standard us prepared and used for the quantification of 2-AG by isotopic dilution and liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS).

סינתזה של תקן שניוני לקוונפיקציה של 2-ארכידליגליליצרול באוקנאבאבדיטיס

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

כימות בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

מחבר זרקור: כימות מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי  

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

כימות מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...