Name: quantification of hypopigmentation activity in vitro
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קוריאה המכון של תכנון והערכה עבור טכנולוגיית מזון, חקלאות, יערנות (IPET) באמצעות תוכנית פיתוח טכנולוגיה Agri-Bioindustry, ממומן על ידי משרד החקלאות, המזון, לענייני כפרי (MAFRA ) (116159-02-2-WT011), בית הספר למדעי החיים וביוטכנולוגיה BK21 פלוס, אוניברסיטת קוריאה.

1. הכנת בינוני, תרכובות, ריאגנטים
<ol><li>להכין B16F10 מדיום מלאה של הגידול. תוספת של Dulbecco ששינה בינוני הנשר (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (המזיק).<ol>
<li>כדי להפוך את 500 מ"ל של מדיום מלאה, מערבבים 445 מ הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) 50 מ של FBS, 5 מ של המזיק בבקבוק זכוכית מעוקר 1 ליטר. ל...

<ol>
	<li>Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+controlling+the+migration+of+melanocytes+and+melanoma+cells.">Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin.">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).</li><li>Galvan, I., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+chemistry+and+the+ecology+of+stress.">Melanin chemistry and the ecology of stress.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).</li><li>Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+whitening+cosmetics:+Feedback+and+challenges+in+the+development+of+natural+skin+lighteners.">Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners.</a> Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).</li><li>Cooksey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+indirect+formation+of+the+catecholic+intermediate+substrate+responsible+for+the+autoactivation+kinetics+of+tyrosinase.">Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).</li><li>Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+identify+inhibitors+of+melanin+biosynthesis+via+the+quality+control+of+tyrosinase.">Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).</li><li>Gillbro, J. M., Olsson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanogenesis+and+mechanisms+of+skin-lightening+agents+-+existing+and+new+approaches.">The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches.</a> International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).</li><li>Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+in+the+study+of+human+skin+melanocytes.">Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes.</a> Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Momilactione+B+inhibits+protein+kinase+A+signaling+and+reduces+tyrosinase-related+proteins+1+and+2+expression+in+melanocytes.">Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes.</a> Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibitions+of+lemon+balm+(Melissa+officinalis)+ethanolic+extract+on+melanogenesis+in+B16-F1+murine+melanocytes:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+its+gene+expression.">Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression.</a> Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-Coumaric+acid+inhibition+of+CREB+phosphorylation+reduces+cellular+melanogenesis.">p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis.</a> European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibition+of+&#947;-oryzanol+on+cellular+melanogenesis:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+reduction+of+melanogenic+gene+expression+by+a+protein+kinase+a-dependent+mechanism.">Dual inhibition of &#947;-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism.</a> Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).</li><li>Choi, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+isoflavone+puerarin+and+its+glycosides+on+melanogenesis+in+B16+melanocytes.">Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes.</a> European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).</li><li>Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+reduces+cellular+melanin+content+via+suppression+of+microphthalmia-associated+transcription+factor+in+B16-F1+murine+melanocytes.">Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes.</a> Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).</li><li>Overwijk, W. W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B16+as+a+mouse+model+for+human+melanoma.">B16 as a mouse model for human melanoma.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+protocol+for+assessing+regulators+of+pigmentation.">A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation.</a> Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).</li><li>D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+melanogenesis.">Signaling pathways in melanogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).</li><li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage:+interactions+between+KIT+and+MITF.">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).</li><li>Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-MSH+and+melanogenesis+in+normal+human+adult+melanocytes.">&#945;-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).</li><li>Hu, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+evaluation+of+melanin+content+and+production+of+pigment+cells+in+vitro.">Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).</li><li>Carriel, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+histochemical+method+for+a+simultaneous+staining+of+melanin+and+collagen+fibers.">A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).</li></ol>

הצגנו פרוטוקולים להערכת הפעילות היפופיגמנטציה של תרכובות בדיקת שימוש בתרבית מלנוציטים. התוצאות נציג הראו את השפעת היפופיגמנטציה יערות, מעכב tyrosinase זה עכבות פעילות tyrosinase ותוכן מלנין הסלולר. שיטות אלה נמצאים בשימוש נרחב במחקר פעילות אנטי-melanogenic. באמצעות מבחני האלה, גם בהצלחה זיהינו מספר תר?...

מלנין תפקיד קריטי, פיזיולוגיה, פתולוגיה, טוקסיקולוגיה של מספר איברים לרבות עור, עיניים, המוח1. התפקידים העיקריים של מלנין תופעות צילום-הקרנה וביוכימי. המלנין סופג אור אינפרא אדום ונראה לעין, כמו גם קרינת אולטרה סגול (UV), עם קליטה מוגברת ממחירים באורכי גל קצרים יותר של אור; לפיכך, מלנין מגן על רקמות מן הנזק שנגרם על ידי האור הנראה או קרינת UV2. מלנין הוא נוגד חמצון, יש זיקה מתכות וכימיקלים רעילים אחרים; לכן, זה באפשרותך להגן על רקמות סטרס חמצוני וכימיים3. עם זאת, ייצור יתר של המלנין גורם בעיות עור.
ובאיכות של מלנין בעור, איריס הן גורמים החשובים ביותר של הצבע של איריס, העור. אנשים אולי יש העדפות צבע עור שונים; כמה טובה לעור שזוף, בעוד אחרים לטובת עור בצבעים בהירים יותר. בהתאם פרופילים אלה הצרכן, מוצרי קוסמטיקה היפופיגמנטציה פותחו כדי לספק שווקים נפרדים עבור העור המועדף צבעים4. בהתאם לכך, מחקרים של היפופיגמנטציה ופעילות אנטי-melanogenic חשובים הן מבחינה מדעית והן מבחינה מעשית.
Melanogenesis הוא תהליך מורכב של מלנין ביוסינטזה דרך סדרה של תגובות כימיות אנזימטי ספונטנית של מלנוציטים. מלנוציט אחד מוקף כ 36 keratinocytes, melanocytes הם המפעלים סינתזת המלנין להפיץ את המוצר שלהם כדי keratinocytes שכנות. העור, המלנין מיוצר ומאוחסן בתא melanosomal של מלנוציטים מועבר keratinocytes שכנות בתוך האפידרמיס ויה דנדריטים.
L-טירוזין משמשת מצע ראשוני עבור melanogenesis ו- tyrosinase את האנזים מזרז שתי תגובות רצופות להמיר L-טירוזין לתוך 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) ולאחר מכן לתוך dopaquinone. תגובות אלו הן הצעד הגבלת קצב ב-5,melanogenesis6. בהתאם לכך, פעילות היפופיגמנטציה קודם נמדד על ידי הערכת הפעילות התאית tyrosinase ישירות. כדי לעשות זאת, תמציות מלנוציט המכיל tyrosinase מודגרת עם DOPA ולא dopaquinone המיוצר הדגימות נמדד על ידי ספקטרופוטומטר-475 ננומטר. הערכים הם מנורמל על ידי ריכוז חלבון של דגימות, וכן חומרים מהתוצאה פעילות היפופיגמנטציה תפקידים במערך dopaquinone פחות בהשוואה עם פקדים.
שנית, ניתן לכמת פעילות היפופיגמנטציה על ידי מדידת מלנין בעור מלנוציטים בתרבית ישירות. לאחר מטפלים תאים עם החומר במבחן, מלנין מופק בתנאים אלקליין, התוכן מלנין הוא לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר 400 nm. סוכן היפופיגמנטציה תגרום תוכן מלנין נמוכה יותר מאשר הפקדים7.
לבסוף, ניתן לכמת את הפעילות היפופיגמנטציה על ידי פונטנה-מאסון מלנין מכתים וניתוח תמונות עוקבות. פונטנה-מאסון מכתים, גרגרי המלנין להפחית חנקת אמוניה-הכסף למצב מתכתי שחור גלויה, שחור באזורים של תאים בתמונות מיקרוסקופיים מייצגים את כמות המלנין.
סוכן היפופיגמנטציה בדרך כלל נותן תוצאות דומות בקנה אחד עם שלוש שיטות אלה, שמאשר כי הפעילות של החומר הוא חוקי. לחלופין, זה עשוי להיות שימושי למדוד את הביטוי של גנים מרכזיים, חלבונים ב- melanogenesis בתגובה חומר המבחן לבחון פעילות היפופיגמנטציה. בנוסף tyrosinase, חלבונים הקשורים tyrosinase (TRP-1) dopachrome tautomerase (TRP-2) הם קריטיים לאנזימים melanogenesis8. גורם שעתוק microphthalmia-הקשורים פקטור שעתוק (MITF) הוא הרגולטור הראשי melanogenesis, כימות של רמות ביטוי גנים/חלבון שלה או assay פעילות יזם יכול לשמש גם כדי להעריך את פעילות היפופיגמנטציה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbutin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>#10960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Yakuri Pure Chemicals</td>
			<td>#16223</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold chloride</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>AHG0226</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Samchun chemical</td>
			<td>H0255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bio basic Canada Inc.</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#60218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duksan pure chemicals</td>
			<td>#81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100121</td>
			<td>Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#2163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Union Carbide</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosinase from mushroom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3824</td>
			<td>25 KU</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of hypopigmentation activity in vitro

מחקר זה מציג שיטות מעבדה כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה. מלנין, הפיגמנט העיקרי של מלנוציטים, הוא מסונתז בתגובה מספר גורמים הסלולר וסביבתיים. המלנין מגן על תאי העור מפני נזק אולטרה, אך יש גם פונקציות biophysical הביוכימי. ייצור יתר או הצטברות של מלנין בעור מלנוציטים עלול לגרום לבעיות עור, כגון, כתמים כהים, melasma, שומות ונמשים. לכן, השליטה של melanogenesis עם סוכנים היפופיגמנטציה חשוב אצל אנשים בעלי צרכים רפואיים או קוסמטיים. מלנין הוא מסונתז בעיקר melanosomes של מלנוציטים תהליך ביוכימי מורכב שנקרא melanogenesis, אשר מושפע חיצוני, פנימי גורמים, כגון הורמונים, דלקות, גיל חשיפה אור אולטרה סגול. אנו מתארים שלוש שיטות כדי לקבוע את הפעילות היפופיגמנטציה של כימיקלים או חומרים טבעיים בתוך המלנוציטים: מדידה של פעילות הסלולר 1) tyrosinase ו 2) מלנין תוכן, ו 3) צביעת וכימות מלנין הסלולר עם תמונה ניתוח.
ב- melanogenesis, tyrosinase מזרז את הצעד הגבלת קצב הממירה L-טירוזין לתוך 3,4-dihydroxyphenylalanine (בסדר גמור) ולאחר מכן לתוך dopaquinone. לכן, עיכוב של tyrosinase הוא מנגנון היפופיגמנטציה תפקידים ראשיים. ב מלנוציטים תרבותי, ניתן לכמת פעילות tyrosinase על-ידי הוספת בסדר גמור כמו מצע ומדידת dopaquinone הייצור על ידי ספקטרופוטומטר. Melanogenesis גם נמדד על ידי לכימות התוכן מלנין. השבר תאי המלנין המכילים מופק עם NaOH, מלנין הוא לכמת spectrophotometrically. לבסוף, ניתן לכמת את התוכן מלנין מאת ניתוח תמונות בעקבות פונטנה-מאסון מכתים של מלנין. למרות התוצאות של מבחני במבחנה אלה לא תמיד לשכפל בעור האדם, שיטות אלה נמצאים בשימוש נרחב במחקר melanogenesis, במיוחד כשלב ראשוני לזיהוי פעילות היפופיגמנטציה פוטנציאליים. שיטות אלה יכולים לשמש גם כדי להעריך את פעילות מלנוציט צמיחה, בידול. תוצאות עקביות עם שלוש שיטות שונות לוודא את החוקיות של האפקטים.

נציג תוצאות הפעילות היפופיגמנטציה של יערות, anti-melanogenic במתחם, ב- B16F10 מלנוציטים מוצגים להלן. איור 1A מציג שאת יערות באופן משמעותי לדכא את הפעילות התאית tyrosinase לעומת הפקד שטופלו הרכב. באופן דומה, התוכן המלנין בתאי מגורה עם יערות פחתו משמעותית בהשוואה עם הפקדים (...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

אנו מתארים שלוש שיטות להערכת הפעילות היפופיגמנטציה של כימיקלים במבחנה: כימות של פעילות tyrosinase 1) סלולר ותוכן 2) מלנין, או 3) מידה של מלנין מאת צביעת תאי המלנין וניתוח התמונה.

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

שיטה זו עשויה להיות מועילה בפיתוח של קוסמטיקה פונקציונלית סוכן העור עם פעילויות אנטי מלנוגנית. זה שם כדי לבצע את התוצאה ניתן להשיג במהירות. בנוסף, שיטה זו עשויה להיות שימושית עבור חוקרים, שרוצים לזהות או לחקור את ההשפעות או את התרכובות או לחקור את הפעילות antimelanogenic או promelanogenic.כדי למדוד את פעילות טירוזינאז להתחיל על ידי זריעת B16-F10 מלניקים בחמש פעמים 10 לתאים הרביעי ל הבאר של ריכוז צלחת 24 גם במדיום מלא במשך 24 שעות באינקובטור תרבות התא. למחרת, להחליף את supernatant בכל באר עם DMEM בתוספת תרכובת בדיקה מוכנה טרי שליטה מעכב או שליטה שלילית ולהחזיר את הצלחת לחממה עוד 72 שעות. בסוף הטיפול שוטפים את בארות פעמיים עם 300 microliters של pbs קר לגם ולה מניחים את הצלחת על קרח.הבא להוסיף 300 microliters של מאגר תזה לכל באר באמצעות מגרד תאים כדי לאסוף את התא lysates לאחר חמש דקות. העבר את המתלים חלקיק התא וכתוצאה מכך בודדים 1.5 צינורות מיקרו צנטריפוגה מיליליטר. ולהומוגניזציה lysates שלוש פעמים במשך שתי שניות ב 14, 500 סל"ד על קרח כדי לשחרר את טירוזינאז intercellular.גלולה פסולת התא על ידי צנטריפוגה ולהעביר את supernatants לצינורות צנטריפוגה בודדים 1.5 מיליליטר על קרח. להקצות 70 microliters של כל על טבעי בארות בודדות של ברור 96 צלחת מיקרו פוליסטירן היטב ולהוסיף 140 microliters של פתרון מצע טירוזינאז לכל באר של על טבעי. מנענעים את הצלחת בעדינות כדי לערבב את תכולת הבאר.ואז לה הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. ולמדוד לפעילות טירוזינאז ב 475 ננומטר על קורא מיקרופלסטיק. כדי למדוד את תוכן המלנין של התאים לאחר איסוף lysate של התאים המטופלים כפי שהוכח.לאסוף את lysates על ידי צנטריפוגה ולהעביר את supernatants לצינורות חדשים. מוסיפים 300 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסידי רגיל אחד לכל גלולה למשך שעה אחת של דגירה ב-60 מעלות צלזיוס. ואחריו צנטריפוגה של השעיות התא מומס.ואז להעביר 200 microliters של supernatants לכל באר של צלחת 96 היטב. ולמדוד את תכולת המלנין על קורא מיקרופלסטיק באורך גל של 400 ננומטר. עבור פונטנה-מאסון כתמים, לשטוף את התאים שטופלו פעמיים עם 300 microliters של pbs קר לתקן את התאים עם 200 microliters של 10% פורמלין במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.שוטפים את התאים העבים במים מזוקקים ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של 58 עד 68 מעלות צלזיוס אמוניקלי כסף פתרון עבודה לכל באר. במשך שעה אחת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס או עד התאים הופכים צהוב חום בצבע. שוטפים את התאים המוכתמים במים מזוקקים ואחריהם דגירה של שתי דקות בכלוריד זהב 0.1% בטמפרטורת החדר.לשטוף את התאים המטופלים כלוריד זהב עם מים מזוקקים ולהוסיף 200 microliters של פתרון thiosulfate נתרן לתאים. לאחר שתי דקות לשטוף את התאים שוב. ולתייג את התאים עם 200 מיקרוליטרים של אדום גרעיני מהיר לכל באר במשך חמש דקות.לאחר מכן לשטוף את התאים מוכתמים עם מי ברז לפני הדמיה תחת מיקרוסקופ אור. לניתוח סף, פתחו את התמונות בתמונה J ובחרו תמונה, התאמה ותסף צבע. כדי למדוד את האזור המוכתם בפונטנה מאסון, הגדר את סרגל הפרמטרים של הבהירות לאפס והתאם את הבהירות לנקודה שבה נכללים כל התאים המוכתמים בשחור או חום.בחר נתח ונתח חלקיקים וסמן את התיבה מסכם בחלון נתח חלקיקים ולאחר מכן לחץ על אישור כדי לקבל סיכום של התוצאות ולהעתיק ולהדביק את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני. טיפול Arbutin מדכא באופן משמעותי פעילות טירוזינאז הסלולר לעומת תאים מטופלים ברכב בקרה. באופן דומה התוכן מלנין של תאים מגורה עם Arbutin מצטמצם באופן משמעותי בהשוואה לפקדים.למרות התאים דומים מורפולוגית בין קבוצות טיפול, Arbutin מקטין את האזור של פיגמנט שחור לעומת התאים המטופלים שליטה. שיטה זו שימושית להקרנת פעילויות באמצעות הספרייה המורכבת שלנו. יש יותר ממאות דגימות להיבדק במהירות.יתר על כן שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור את המנגנון מעורבים מלנוגנזה. לאחר שזוהו תרכובות המועמדים הביו-אקטיביים, בעדותם לחקר מנגנונים ביולוגיים או יישומים מסחריים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

מיפוי החומרים: פיקוח על פעילות לקטט דהידרוגנאז ישירות בתוך הרקמה

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

זיהוי של Phospholipase C פעילות Homogenate המוח של דבורת הדבש

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

מטריקה שיטת הצביעה של פעילות ציטראט סינתאז בדרוזופילה מלאנוסטר

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...