Name: quantification of hypopigmentation activity in vitro
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00
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इस काम को कृषि, खाद्य, और ग्रामीण मामलों के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित, एग्री-बायोइंडस्ट्री टेक्नोलॉजी डेवलपमेंट प्रोग्राम के माध्यम से खाद्य, कृषि, और वानिकी (आईपीईटी) में प्रौद्योगिकी के लिए कोरिया के योजना और मूल्यांकन संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था (mafra ) (116159-02-2-WT011) और स्कूल ऑफ लाइफ साइंसेज और बायोटेक्नोलॉजी फॉर BK21 प्लस, कोरिया यूनिवर्सिटी.

1. मध्यम, यौगिकों, और अभिकर्मकों की तैयारी
<ol><li>B16F10 विकास पूर्ण माध्यम तैयार करें । 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (कीट) के साथ dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (dmem) पूरक ।<ol>
<li>पूर्ण म?...

<ol>
	<li>Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+controlling+the+migration+of+melanocytes+and+melanoma+cells.">Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin.">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).</li><li>Galvan, I., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+chemistry+and+the+ecology+of+stress.">Melanin chemistry and the ecology of stress.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).</li><li>Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+whitening+cosmetics:+Feedback+and+challenges+in+the+development+of+natural+skin+lighteners.">Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners.</a> Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).</li><li>Cooksey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+indirect+formation+of+the+catecholic+intermediate+substrate+responsible+for+the+autoactivation+kinetics+of+tyrosinase.">Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).</li><li>Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+identify+inhibitors+of+melanin+biosynthesis+via+the+quality+control+of+tyrosinase.">Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).</li><li>Gillbro, J. M., Olsson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanogenesis+and+mechanisms+of+skin-lightening+agents+-+existing+and+new+approaches.">The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches.</a> International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).</li><li>Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+in+the+study+of+human+skin+melanocytes.">Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes.</a> Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Momilactione+B+inhibits+protein+kinase+A+signaling+and+reduces+tyrosinase-related+proteins+1+and+2+expression+in+melanocytes.">Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes.</a> Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibitions+of+lemon+balm+(Melissa+officinalis)+ethanolic+extract+on+melanogenesis+in+B16-F1+murine+melanocytes:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+its+gene+expression.">Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression.</a> Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-Coumaric+acid+inhibition+of+CREB+phosphorylation+reduces+cellular+melanogenesis.">p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis.</a> European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibition+of+&#947;-oryzanol+on+cellular+melanogenesis:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+reduction+of+melanogenic+gene+expression+by+a+protein+kinase+a-dependent+mechanism.">Dual inhibition of &#947;-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism.</a> Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).</li><li>Choi, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+isoflavone+puerarin+and+its+glycosides+on+melanogenesis+in+B16+melanocytes.">Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes.</a> European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).</li><li>Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+reduces+cellular+melanin+content+via+suppression+of+microphthalmia-associated+transcription+factor+in+B16-F1+murine+melanocytes.">Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes.</a> Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).</li><li>Overwijk, W. W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B16+as+a+mouse+model+for+human+melanoma.">B16 as a mouse model for human melanoma.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+protocol+for+assessing+regulators+of+pigmentation.">A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation.</a> Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).</li><li>D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+melanogenesis.">Signaling pathways in melanogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).</li><li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage:+interactions+between+KIT+and+MITF.">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).</li><li>Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-MSH+and+melanogenesis+in+normal+human+adult+melanocytes.">&#945;-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).</li><li>Hu, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+evaluation+of+melanin+content+and+production+of+pigment+cells+in+vitro.">Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).</li><li>Carriel, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+histochemical+method+for+a+simultaneous+staining+of+melanin+and+collagen+fibers.">A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).</li></ol>

हम परीक्षण यौगिकों की हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया सुसंस्कृत melanocytes का उपयोग । प्रतिनिधि परिणाम आरब्यूटिन, एक टायरोसिनेस अवरोध करनेवाला के हाइपोपाइमेंटे?...

मेलिनाइन शरीर विज्ञान, विकृति विज्ञान, और त्वचा, आंखों सहित कई अंगों के विष विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और मस्तिष्क1। मेल्जिन के प्रमुख कार्य फोटो स्क्रीनिंग और जैव रासायनिक प्रभाव हैं । मेलिनाइन प्रकाश की छोटी तरंग दैर्ध्य में वृद्धि की अवशोषण दर के साथ के पास अवरक्त और दृश्य प्रकाश के साथ ही पराबैंगनी (यूवी) विकिरण, अवशोषित; इस प्रकार, मेलिनो दृश्य प्रकाश या यूवी विकिरण2के कारण नुकसान से ऊतकों की रक्षा करता है । मेमेलाइन एक एंटीऑक्सीडेंट है और धातुओं और अन्य विषाक्त रसायनों के लिए एक समानता है; इसलिए, यह ऑक्सीडेटिव और रासायनिक तनाव से ऊतकों की रक्षा कर सकते हैं3. हालांकि, मेमेलाइन के अत्यधिक उत्पादन त्वचा संबंधी मुद्दों का कारण बनता है ।
त्वचा और आईरिस में मेलाइन की मात्रा और गुणवत्ता आईरिस और त्वचा के रंग का सबसे महत्वपूर्ण निर्धारक हैं । व्यक्तियों अलग त्वचा रंग वरीयताओं हो सकता है; कुछ पक्ष tanned त्वचा, जबकि अंय हल्का त्वचा रंग एहसान । इन उपभोक्ता प्रोफाइल पर निर्भर करता है, हाइपोपाइमेंटेशन सौंदर्य प्रसाधन के लिए इष्ट त्वचा4रंग के लिए व्यक्तिगत बाजार को संतुष्ट विकसित किया गया है । तदनुसार, हाइपोपाइमेंटेशन और विरोधी melanogenic गतिविधि के अध्ययन दोनों वैज्ञानिक और व्यावहारिक रूप से महत्वपूर्ण हैं ।
मेलेनोजेनेसिस melanogenesis में एंजाइमेटिक और सहज रासायनिक प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से मेलेनजिन जैवसंश्लेषण की जटिल प्रक्रिया है । एक मेलानोसाइट से घिरा हुआ है लगभग ३६ केराटिनोसाइट्स और melanocyte मेलैनिन संश्लेषण कारखानों कि पड़ोसी keratinocytes के लिए अपने उत्पाद को वितरित कर रहे हैं । त्वचा में, मेलैनाइन का उत्पादन किया जाता है और मेलानोसाइट्स के मेलैनोसोमल डिब्बे में संग्रहित किया जाता है, जिसे डेंडराइटीज के माध्यम से एपिडर्मिस में पड़ोसी केराटिनोसाइट्स तक पहुँचाया जाता है ।
एल tyrosine मेलेनोजेनेसिस के लिए प्रारंभिक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है और एंजाइम टायरोसिनेस दो लगातार प्रतिक्रियाओं कि कन्वर्ट एल-tyrosine में 3, 4-dihydroxyphenylalanine (डोपा) और फिर dopaquinone में. ये प्रतिक्रियाएं मेलेनोजेनेसिस5,6में दर-सीमित कदम हैं । तदनुसार, हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि पहले सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि का आकलन सीधे द्वारा मापा जा सकता है. ऐसा करने के लिए, टायरोसिनेस युक्त मेलानोसाइट अर्क डोपा के साथ incubated कर रहे हैं और dopaquinone नमूनों में उत्पादित ४७५ एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा मापा जा सकता है. मूल्यों नमूनों की प्रोटीन सांद्रता द्वारा सामान्यीकृत कर रहे हैं, और नियंत्रण के साथ तुलना में कम dopaquinone गठन में हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि परिणाम के साथ पदार्थों.
दूसरे, हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि सुसंस्कृत मेलानोसाइट्स में मेलेनिइन को मापने के द्वारा सीधे मात्रा निर्धारित जा सकता है । परीक्षण सामग्री के साथ कोशिकाओं के इलाज के बाद, मेलेनिइन क्षारीय शर्तों के तहत निकाला जाता है और मेलेनिइन सामग्री ४०० एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा मात्रा में मात्रा निर्धारित है । एक हाइपोपाइमेंटेशन एजेंट नियंत्रण7से कम मेलिनीन सामग्री में परिणाम होगा ।
अंत में, हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि fontana द्वारा मात्रा निर्धारित जा सकता है-masson मेलेनिनो धुंधला और बाद में छवि विश्लेषण । fontana में-masson धुंधला, मेलिनीन granules एक दिखाई काले धातु राज्य के लिए अमोनिया-चांदी नाइट्रेट को कम करने और सूक्ष्म छवियों में कोशिकाओं के काले क्षेत्रों मेलिनीन की मात्रा का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
एक हाइपोपाइमेंटेशन एजेंट आमतौर पर इन तीन तरीकों के साथ सुसंगत और तुलनीय परिणाम देता है, जो पुष्टि करता है कि पदार्थ की गतिविधि मान्य है. वैकल्पिक रूप से, यह हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि की जांच करने के लिए एक परीक्षण पदार्थ के जवाब में मेलेनोजेनेसिस में प्रमुख जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति को मापने के लिए उपयोगी हो सकता है । टायरोसिनेस के अलावा टायरोसिनेस से संबंधित प्रोटीन (टीआरपी-1) और डोपाक्रोम टऑटोमेरेज (टीआरपी-2) मेलानोजेनेसिस8में क्रिटिकल एंजाइम हैं । प्रतिलेखन कारक माइक्रोथैल्मिया-एसोसिएटेड ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (mitf) मेलेनोजेनेसिस में एक मास्टर नियामक है और इसके जीन/प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर या एक प्रवर्तक गतिविधि परख को भी हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbutin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>#10960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Yakuri Pure Chemicals</td>
			<td>#16223</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold chloride</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>AHG0226</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Samchun chemical</td>
			<td>H0255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bio basic Canada Inc.</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#60218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duksan pure chemicals</td>
			<td>#81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100121</td>
			<td>Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#2163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Union Carbide</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosinase from mushroom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3824</td>
			<td>25 KU</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of hypopigmentation activity in vitro

इस अध्ययन में विट्रो में हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि के परिमाणन के लिए प्रयोगशाला तरीके प्रस्तुत करता है. मेलोनिइन, मेलानोसाइट्स में प्रमुख वर्णक, कई सेलुलर और पर्यावरणीय कारकों के जवाब में संश्लेषित है । मेलेनाइन पराबैंगनी क्षति से त्वचा कोशिकाओं की रक्षा करता है, लेकिन यह भी biophysical और जैव रासायनिक कार्य किया है । मेलानोसाइट्स में मेलानिइन के अत्यधिक उत्पादन या संचय के कारण त्वचा संबंधी समस्याएं हो सकती हैं, जैसे कि freckles, काले धब्बे, झाई, और moles । इसलिए, हाइपोपिग्मेंटेशन एजेंटों के साथ मेलेनोजेनेसिस का नियंत्रण नैदानिक या कॉस्मेटिक जरूरतों वाले व्यक्तियों में महत्वपूर्ण है । मेलेनाइन मुख्य रूप से मेलानोसाइट्स के मेलानोसोम में एक जटिल जैव रासायनिक प्रक्रिया में संश्लेषित किया जाता है, जिसे मेलाजनन कहा जाता है, जो बाह्य और आंतरिक कारकों जैसे हार्मोन, सूजन, उम्र और पराबैंगनी प्रकाश एक्सपोजर से प्रभावित होता है । हम तीन तरीकों का वर्णन करने के लिए रसायन या मेलानोसाइट्स में प्राकृतिक पदार्थों की हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि का निर्धारण: 1 की माप) सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि और 2) मेलिनटिन सामग्री, और 3) धुंधला और बढ़ाता सेलुलर मेलिनेटिन छवि के साथ विश्लेषण.
मेलेनोजेनेसिस में, टायरोसिनेस दर सीमित कदम है कि एल-tyrosine में धर्मांतरित 3, 4-dihydroxyphenylalanine (एल-डोपा) और फिर dopaquinone में catalyzes. इसलिए, टायरोसिनेस के निषेध एक प्राथमिक हाइपोपाइमेंटेशन तंत्र है. संवर्धित मेलानोसाइट्स में, टायरोसिनेस गतिविधि को एक सब्सट्रेट के रूप में एल-डोपा जोड़कर और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा dopaquinone उत्पादन को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित जा सकता है । मेलानोजेनेसिस भी मेलेनाइन सामग्री बढ़ाता द्वारा मापा जा सकता है । मेलाइन युक्त सेलुलर अंश naoh के साथ निकाला जाता है और मेलेनिइन स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिकली मात्रा निर्धारित है. अंत में, मेलेनिनो सामग्री मेलेनिन के fontana-मस्सन धुंधला के बाद छवि विश्लेषण द्वारा मात्रा निर्धारित जा सकता है । हालांकि इन विट्रो assays में परिणाम हमेशा मानव त्वचा में reproduced नहीं किया जा सकता है, इन तरीकों को व्यापक रूप से melanogenesis अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है, विशेष रूप से प्रारंभिक कदम के रूप में संभावित हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि की पहचान । इन पद्धतियों का उपयोग मेलानोसाइट गतिविधि, विकास और विभेद का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है । तीन विभिंन तरीकों के साथ लगातार परिणाम प्रभाव की वैधता सुनिश्चित करते हैं ।

आरबूतिण के हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि के लिए प्रतिनिधि परिणाम, एक विरोधी melanogenic यौगिक, B16F10 melanocytes में नीचे दिखाए गए हैं । चित्रा 1a से पता चलता है कि आरब्यूटिन ने वाहन-उपचारित नियंत्रण के...

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Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

हम विट्रो में रसायनों के हाइपोपाइमेंटेशन गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए तीन प्रयोगात्मक तरीकों का वर्णन: 1 का परिमाणन) सेलुलर टायरोसिनेस गतिविधि और 2) मेलेनाइन सामग्री, और 3) मेलेनिनो के सेलुलर मेलेनिन धुंधला और छवि विश्लेषण द्वारा माप.

विट्रो में हाइपोपिग्मेंटेशन गतिविधि का प्रमाणन

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

यह विधि एंटी-मेलानॉजेनिक गतिविधियों के साथ कार्यात्मक सौंदर्य प्रसाधन और त्वचा एजेंट के विकास में सहायक हो सकती है। यह प्रदर्शन करने के लिए है और परिणाम जल्दी से प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, यह विधि शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकती है, जो प्रभावों या यौगिकों की पहचान या जांच करना चाहते हैं या एंटीमेलानोजेनिक या प्रोमेलानोजेनिक गतिविधियों की जांच करना चाहते हैं।Tyrosinase गतिविधि को मापने के लिए एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए पूरा माध्यम में एक 24 अच्छी तरह से थाली एकाग्रता के प्रति अच्छी तरह से पांच गुना 10 पर B16-F10 Melanicides बोने से शुरू करते हैं । अगले दिन, प्रत्येक कुएं में सुपरनिटेंट को नए सिरे से तैयार परीक्षण यौगिक और अवरोधक नियंत्रण या नकारात्मक नियंत्रण के साथ पूरक करने के साथ बदलें और प्लेट को एक और 72 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस करें। उपचार के अंत में कुओं को दो बार ठंडे पीबीएस के 300 माइक्रोलीटर के साथ अच्छी तरह से कुल्ला किया और प्लेट को बर्फ पर रखें।इसके बाद पांच मिनट के बाद सेल लाइसेट्स को इकट्ठा करने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से लाइसिस बफर के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें। परिणामी सेल कण निलंबन को व्यक्तिगत 1.5 मिलीलीटर माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। और इंटरसेलुलर टायरोसीन्स को छोड़ने के लिए बर्फ पर 14, 500 आरपीएम पर दो सेकंड के लिए तीन बार lysates को समरूप करें।अपकेंद्रित्र द्वारा सेल मलबे को गोली दें और बर्फ पर अलग-अलग 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूबों में सुपरनेटेंट स्थानांतरित करें। एक स्पष्ट 96 अच्छी तरह से पॉलीस्टीरिन माइक्रो प्लेट के व्यक्तिगत कुओं के लिए प्रत्येक सुपरनेटेंट के 70 माइक्रोलीटर आवंटित करें और सुपरनेट के प्रत्येक कुएं में टायरोसिन सब्सट्रेट समाधान के 140 माइक्रोलीटर जोड़ें। अच्छी सामग्री मिश्रण करने के लिए कोमल थाली मिलाते हुए।इसके बाद दो घंटे तक थाली को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। और एक माइक्रोप्लेट रीडर पर 475 नैनोमीटर पर टायरोसिनेज गतिविधि को मापें। शोधित कोशिकाओं के lysate को एकत्र करने के बाद कोशिकाओं की मेलेनिन सामग्री को मापने के लिए।सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा lysates ले लीजिए और नए ट्यूबों के लिए supernatants स्थानांतरित। 60 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे इनक्यूबेशन के लिए प्रत्येक गोली में एक सामान्य सोडियम हाइड्रोक्साइड के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें। भंग सेल निलंबन के अपकेंद्रित्र के बाद।फिर सुपरनेटैंट के 200 माइक्रोलीटर को 96 अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें। और एक माइक्रोप्लेट रीडर पर मेलेनिन सामग्री को 400 नैनोमीटर तरंगदैर्ध्य पर मापें। फोंटाना-मैसन स्टेनिंग के लिए, इलाज कोशिकाओं को ठंडे पीबीएस के 300 माइक्रोलीटर के साथ दो बार धोएं और चार डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए 10% फॉर्मेलिन के 200 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।आसुत पानी के साथ मोटी कोशिकाओं कुल्ला और प्रत्येक अच्छी तरह से 58 डिग्री सेल्सियस अमोनियाकल चांदी काम समाधान के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन या जब तक कोशिकाओं को रंग में पीले भूरे रंग हो जाते हैं । आसुत पानी के साथ दाग कोशिकाओं कुल्ला कमरे के तापमान पर ०.१% सोने क्लोराइड में दो मिनट इनक्यूबेशन के बाद ।आसुत पानी के साथ सोने के क्लोराइड उपचारित कोशिकाओं कुल्ला और कोशिकाओं के लिए सोडियम थिओसल्फेट समाधान के २०० माइक्रोलीटर जोड़ें । दो मिनट के बाद कोशिकाओं को फिर से कुल्ला। और पांच मिनट के लिए अच्छी तरह से परमाणु तेजी से लाल प्रति के २०० माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं लेबल ।फिर एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे इमेजिंग से पहले नल के पानी के साथ दाग कोशिकाओं को धोएं। दहलीज विश्लेषण के लिए, इमेज जे में छवियों को खोलें और छवि, समायोजित और रंग सीमा का चयन करें। फोंटाना मैसन के साथ दाग वाले क्षेत्र को मापने के लिए चमक पैरामीटर बार को शून्य पर सेट करें और चमक को उस बिंदु पर समायोजित करें जिस पर सभी काले या भूरे रंग की दाग कोशिकाओं को शामिल किया गया है।कणों का विश्लेषण और विश्लेषण करें और विश्लेषण कणों की खिड़की में सारांश बॉक्स की जांच करें तो परिणामों का सारांश प्राप्त करने और डेटा को स्प्रेडशीट में कॉपी करने और पेस्ट करने के लिए ठीक क्लिक करें। आर्बुटिन उपचार नियंत्रण वाहन उपचारित कोशिकाओं की तुलना में सेलुलर टायरोसाइने गतिविधि को काफी दबा देता है। इसी तरह आर्बुटिन के साथ उत्तेजित कोशिकाओं की मेलेनिन सामग्री नियंत्रण की तुलना में काफी कम हो जाती है।यद्यपि कोशिकाएं उपचार समूहों के बीच रूपात्मक रूप से समान होती हैं, लेकिन अर्बुतिन नियंत्रण उपचारित कोशिकाओं की तुलना में काले वर्णक के क्षेत्र को कम कर देती है। यह विधि हमारे यौगिक पुस्तकालय का उपयोग करसंस्जी स्क्रीनिंग गतिविधियों के लिए उपयोगी हैं। सैकड़ों से अधिक नमूनों की जल्दी जांच की जानी है ।इसके अलावा इस विधि का उपयोग मेलानोजेनेसिस से जुड़े तंत्र की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है। बायोएक्टिव उम्मीदवारों के यौगिकों की पहचान के बाद, जैविक तंत्र या वाणिज्यिक अनुप्रयोगों के अध्ययन के लिए उनकी गवाही के लिए।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

के पीएच निर्भर गतिविधि का पता लगाने<em&gt; कोलाई</em&gt; निगरानी HdeB<em&gt; इन विट्रो</em&gt; और<em&gt; Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

ठहराव की बहुतायत और चार्ज करने के स्तर के हस्तांतरण RNAs में ई कोलाई

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Ribosome profiling द्वारा नवोदित खमीर में अनुवाद के जीनोम चौड़ा ठहराव

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

मानचित्रण चयापचय: निगरानी स्तनपान डिहाइड्रोजनेज गतिविधि सीधे ऊतक में

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

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एक इन विट्रो परख tRNA-Isopentenyl ट्रांस्फ़्रेज़ गतिविधि का पता लगाने के लिए

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

अंशांकन-मुक्त इन विट्रो ठहराव में प्रोटीन होमो-oligomerization का उपयोग कर वाणिज्यिक इंस्ट्रूमेंटेशन और नि: शुल्क, खुला स्रोत चमक विश्लेषण सॉफ्टवेयर

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

से मस्तिष्क Homogenate में Phospholipase सी गतिविधि का पता लगाने से मधुप

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

इन विट्रो Ubicuitination और न्यूक्लिओसोमल हिस्टोन्स के Deubiquitination परख

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...