Name: quantification of hypopigmentation activity in vitro
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00
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Questo lavoro è stato supportato dalla Korea Institute of Planning e valutazione per la tecnologia in cibo, agricoltura e silvicoltura (IPET) attraverso il programma di sviluppo della tecnologia Agri-Bioindustry, finanziato dalla Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) e scuola di Scienze della vita e della biotecnologia per BK21 PLUS, Università della Corea.

1. preparazione del Medium, composti e reagenti
<ol><li>Preparare mezzo completo di sviluppo di B16F10. Supplemento Dulbecco per volta mezzo di Eagle (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina (PEST).<ol>
<li>Per fare 500 mL di terreno completo, mix 445 mL di mezzo di Eagle di Dulbecco modificato (DMEM) con 50 mL di FBS e 5 mL di PEST in una bottiglia di vetro sterilizzati 1 L. Dopo aver mescolato delicatamente, filtrare il mezzo attraverso un filtro di parte superiore della bottiglia da...

<ol>
	<li>Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+controlling+the+migration+of+melanocytes+and+melanoma+cells.">Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Momilactione+B+inhibits+protein+kinase+A+signaling+and+reduces+tyrosinase-related+proteins+1+and+2+expression+in+melanocytes.">Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes.</a> Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibitions+of+lemon+balm+(Melissa+officinalis)+ethanolic+extract+on+melanogenesis+in+B16-F1+murine+melanocytes:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+its+gene+expression.">Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression.</a> Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-Coumaric+acid+inhibition+of+CREB+phosphorylation+reduces+cellular+melanogenesis.">p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis.</a> European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibition+of+&#947;-oryzanol+on+cellular+melanogenesis:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+reduction+of+melanogenic+gene+expression+by+a+protein+kinase+a-dependent+mechanism.">Dual inhibition of &#947;-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism.</a> Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).</li><li>Choi, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+isoflavone+puerarin+and+its+glycosides+on+melanogenesis+in+B16+melanocytes.">Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes.</a> European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).</li><li>Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+reduces+cellular+melanin+content+via+suppression+of+microphthalmia-associated+transcription+factor+in+B16-F1+murine+melanocytes.">Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes.</a> Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).</li><li>Overwijk, W. W., Restifo, N. 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P., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-MSH+and+melanogenesis+in+normal+human+adult+melanocytes.">&#945;-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).</li><li>Hu, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+evaluation+of+melanin+content+and+production+of+pigment+cells+in+vitro.">Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).</li><li>Carriel, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+histochemical+method+for+a+simultaneous+staining+of+melanin+and+collagen+fibers.">A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).</li></ol>

Abbiamo presentato i protocolli per la valutazione dell'attività di ipopigmentazione dei composti di prova utilizzando melanociti coltivati. I risultati rappresentativi hanno mostrato l'effetto di ipopigmentazione dell'arbutina, un inibitore della tirosinasi che ha inibito il contenuto di melanina di attività e cellulare di tirosinasi. Questi metodi sono ampiamente usati nella ricerca di attività anti-melanogenic. Usando queste analisi, abbiamo identificato anche con successo parecchi composti bioattivi che hanno mela...

Melanina svolge un ruolo critico nella fisiologia, patologia e tossicologia di diversi organi tra cui la pelle, occhi e cervello1. Le principali funzioni di melanina sono effetti foto-screening e biochimici. Melanina assorbe la luce visibile e vicino infrarosso, così come la radiazione ultravioletta (UV), con tassi di assorbimento aumentato a lunghezze d'onda più corta della luce; così, melanina protegge i tessuti dai danni causati dalla luce visibile o UV radiazione2. Melanina è un antiossidante e ha un'affinità per metalli e altre sostanze chimiche tossiche; di conseguenza, può proteggere tessuti dallo stress ossidativo e chimica3. Tuttavia, l'eccessiva produzione di melanina provoca problemi dermatologici.
La quantità e qualità di melanina nella pelle e iris sono le determinanti più importanti del colore dell'iride e della pelle. Gli individui possono avere preferenze di colore di pelle differente; alcuni favoriscono la pelle abbronzata, mentre altri preferiscono colori più chiari di pelle. A seconda di questi profili di consumo, ipopigmentazione cosmetici sono stati sviluppati per soddisfare i singoli mercati per pelle favorito colori4. Di conseguenza, gli studi di attività, l'ipopigmentazione e anti-melanogenic sono importanti sia scientificamente e praticamente.
Melanogenesi sono il processo di biosintesi di melanina attraverso una serie di reazioni chimiche spontanee e non enzimatici nei melanociti. Un Melanocita è circondato da circa 36 cheratinociti e melanociti sono le fabbriche di sintesi di melanina che distribuiscono il loro prodotto ai keratinocytes vicini. In pelle, la melanina prodotta e memorizzati nel vano melanosomal dei melanociti è trasportata ai keratinocytes vicini nell'epidermide tramite dendriti.
L-tirosina serve come il substrato iniziale per melanogenesi e l'enzima tirosinasi catalizza due reazioni consecutive che convertono L-tirosina in 3,4-diidrossifenilalanina (DOPA) e poi in Dopachinone. Queste reazioni sono la tappa limitante nella melanogenesi5,6. Di conseguenza, ipopigmentazione attività prima può essere misurata valutando attività tirosinasica cellulare direttamente. Per farlo, gli estratti di melanociti contenente tirosinasi sono incubati con DOPA e il dopachinone prodotta nei campioni può essere misurata mediante spettrofotometria a 475 nm. I valori sono normalizzati dalle concentrazioni di proteine dei campioni e delle sostanze con risultato di attività di hypopigmentation in meno formazione dopachinone rispetto ai comandi.
In secondo luogo, ipopigmentazione attività può essere quantificato misurando la melanina in melanociti coltivati direttamente. Dopo trattando le cellule con il materiale di prova, la melanina viene estratto in condizioni alcaline e il contenuto di melanina è quantificato mediante spettrofotometria a 400 nm. Un agente di ipopigmentazione si tradurrà in un minor contenuto di melanina che la controlli7.
Infine, l'attività di ipopigmentazione può essere quantificata dalla Fontana-Masson melanina macchiatura e analisi delle immagini successive. Nella macchiatura di Fontana-Masson, granuli di melanina riducono il nitrato di ammoniaca-argento allo stato metallico nero visibile e le zone nere delle cellule in immagini microscopiche rappresentano la quantità di melanina.
Un agente di hypopigmentation dà solitamente risultati coerenti e comparabili con questi tre metodi, che conferma che l'attività della sostanza è valido. In alternativa, può essere utile misurare l'espressione di geni chiave e proteine nella melanogenesi in risposta alla sostanza in esame per esaminare l'attività di ipopigmentazione. Oltre alla tirosinasi, proteine tirosinasi (TRP-1) e tautomerase del dopachrome (TRP-2) sono enzimi critici nella melanogenesi8. Il fattore di trascrizione microftalmia-collegata di fattore di trascrizione (MITF) è un regolatore matrice nella melanogenesi e quantificazione dei suoi livelli di espressione di proteina/del gene o un'analisi di attività del promotore è utilizzabile anche per valutare l'attività di ipopigmentazione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbutin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>#10960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Yakuri Pure Chemicals</td>
			<td>#16223</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold chloride</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>AHG0226</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Samchun chemical</td>
			<td>H0255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bio basic Canada Inc.</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#60218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duksan pure chemicals</td>
			<td>#81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100121</td>
			<td>Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#2163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Union Carbide</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosinase from mushroom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3824</td>
			<td>25 KU</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of hypopigmentation activity in vitro

Questo studio presenta metodi di laboratorio per la quantificazione di hypopigmentation attività in vitro. Melanina, il pigmento più importante nei melanociti, è sintetizzata in risposta a più fattori cellulari e ambientali. Melanina protegge le cellule della pelle da danno ultravioletto, ma ha anche funzioni biochimiche e biofisiche. Eccessiva produzione o accumulo di melanina nei melanociti possa causare problemi dermatologici, come lentiggini, macchie scure, melasma e talpe. Di conseguenza, il controllo della melanogenesi con agenti di ipopigmentazione è importante in individui con esigenze cliniche o cosmetici. Melanina è sintetizzata principalmente nei melanosomi dei melanocytes in un complesso processo biochimico chiamato melanogenesi, che sono influenzata dalla estrinseca e fattori intrinseci, quali ormoni, l'infiammazione, l'età e l'esposizione alla luce ultravioletta. Descriviamo tre metodi per determinare l'attività di ipopigmentazione dei prodotti chimici o sostanze naturali nei melanociti: misura della attività della tirosinasi 1) cellulare e contenuto 2) della melanina e melanina cellulare 3) colorazione e quantificare con immagine analisi.
Nella melanogenesi, tirosinasi catalizza la tappa limitante che converte L-tirosina in 3,4-diidrossifenilalanina (l-dopa) e poi in Dopachinone. Di conseguenza, l'inibizione della tirosinasi è un meccanismo primario hypopigmentation. In melanociti coltivati, attività della tirosinasi può essere quantificato l'aggiunta di l-dopa come substrato e misurando dopachinone produzione mediante spettrofotometria. Melanogenesi possono anche essere misurata da quantificare il contenuto di melanina. La frazione cellulare melanina-contenenti è estratta con NaOH e melanina è misurata spettrofotometricamente. Infine, il contenuto di melanina può essere quantificato mediante analisi d'immagine seguendo Fontana-Masson colorazione della melanina. Anche se i risultati di queste analisi in vitro non possono essere sempre riprodotto in pelle umana, questi metodi sono ampiamente utilizzati nella ricerca di melanogenesi, soprattutto come il passo iniziale per identificare potenziali attività di ipopigmentazione. Questi metodi possono essere utilizzati anche per valutare l'attività dei melanociti, la crescita e la differenziazione. Risultati coerenti con i tre diversi metodi garantiscono la validità degli effetti.

Risultati rappresentativi per l'attività di ipopigmentazione dell'arbutina, un anti-melanogenetico compound, in B16F10 melanociti sono riportati di seguito. Figura 1A Mostra che quel arbutina ha soppresso significativamente l'attività della tirosinasi cellulare rispetto al controllo veicolo-trattati. Allo stesso modo, il contenuto di melanina delle cellule stimolate con arbutin è stata ridotta significativamente rispetto ai comandi (Fi...

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Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Descriviamo tre metodi sperimentali per la valutazione dell'attività di hypopigmentation di sostanze chimiche in vitro: quantificazione del contenuto di attività e melanina 2) 1) cellulare tirosinasi e 3) misurazione della melanina di melanina cellulare colorazione e analisi delle immagini.

Quantificazione di Hypopigmentation attività In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Questo metodo può essere utile nello sviluppo di cosmetici funzionali e agente cutaneo con attività anti-melanogeniche. È lì per funzionare e il risultato può essere ottenuto rapidamente. Inoltre, questo metodo può essere utile per i ricercatori, che vogliono identificare o indagare gli effetti o i composti o indagare le attività antimelanogene o promelanogeniche.Per misurare l'attività della tirosinasi iniziare seminando melanicidi B16-F10 a cinque volte 10 alla quarta cella per pozzo di una concentrazione di 24 piastre di pozzo in mezzo completo per 24 ore in un incubatore di coltura cellulare. Il giorno successivo, sostituire il supernatante in ogni pozzo con DMEM integrato con un composto di prova e un controllo inibitore appena preparati o un controllo negativo e restituire la piastra all'incubatore per altre 72 ore. Al termine del trattamento sciacquare i pozzi due volte con 300 microlitri di pb freddi per pozzo e posizionare la piastra sul ghiaccio.Aggiungere quindi 300 microlitri di tampone di lisi a ciascun pozzo utilizzando un raschietto cellulare per raccogliere i liscivi cellulari dopo cinque minuti. Trasferire le sospensioni di particelle cellulari risultanti su singoli tubi di micro-centrifuga da 1,5 millilitri. E omogeneizzare i lisati tre volte per due secondi a 14.500 giri/min sul ghiaccio per rilasciare la tirosinasi intercellulare.Pellettare i detriti cellulari mediante centrifugazione e trasferire i supernatanti su singoli tubi di centrifuga da 1,5 millilitri sul ghiaccio. Assegnare 70 microlitri di ogni supernatante a singoli pozzi di una micro piastra di polistirolo chiara da 96 polietilene e aggiungere 140 microlitri di soluzione di substrato tirosinasi ad ogni pozzo di supernatante. Scuotendo delicatamente la piastra per mescolare il contenuto del pozzo.Quindi incubare il piatto a 37 gradi Celsius per due ore. E misurare l'attività della tirosinasi a 475 nanometri su un lettore di micropiastrine. Misurare il contenuto di melanina delle cellule dopo aver raccolto il lysate delle cellule trattate come dimostrato.Raccogliere i lisati mediante centrifugazione e trasferire i supernatanti su nuovi tubi. Aggiungere 300 microlitri di un normale idrossido di sodio a ciascun pellet per un'incubazione di un'ora a 60 gradi Celsius. Seguito dalla centrifugazione delle sospensioni cellulari disciolte.Quindi trasferire 200 microlitri dei supernatanti in ogni pozzo di una piastra di 96 pozza. E misurare il contenuto di melanina su un lettore di micropiastrine a una lunghezza d'onda di 400 nanometri. Per fontana-masson colorazione, lavare le cellule trattate due volte con 300 microlitri di pb freddi e fissare le cellule con 200 microlitri del 10% di formalina per un'ora a quattro gradi Celsius.Risciacquare le cellule spesse con acqua distillata e aggiungere 200 microlitri da 58 a 68 gradi Celsius soluzione di lavoro in argento ammoniacale ad ogni pozzo. Per un'ora di incubazione a 37 gradi Celsius o fino a quando le cellule diventano di colore giallo-marrone. Risciacquare le celle macchiate con acqua distillata seguita da un'incubazione di due minuti in cloruro d'oro allo 0,1% a temperatura ambiente.Risciacquare le cellule trattate con cloruro d'oro con acqua distillata e aggiungere alle cellule 200 microlitri di soluzione di tiosalfato di sodio. Dopo due minuti sciacquare di nuovo le cellule. Ed etichettare le cellule con 200 microlitri di rosso veloce nucleare per pozzo per cinque minuti.Quindi lavare le celle macchiate con acqua del rubinetto prima di eseguire l'imaging al microscopio leggero. Per l'analisi della soglia, aprite le immagini nell'immagine J e selezionate l'immagine, regolate e la soglia di colore. Per misurare l'area macchiata con Fontana Masson impostare la barra dei parametri di luminosità su zero e regolare la luminosità nel punto in cui sono incluse tutte le celle macchiate nere o marroni.Selezionare Analizza e analizza particelle e selezionare la casella riepiloga nella finestra Analizza particelle, quindi fare clic su OK per ottenere un riepilogo dei risultati e copiare e incollare i dati in un foglio di calcolo. Il trattamento con arbutina sopprime significativamente l'attività della tirosinasi cellulare rispetto alle cellule trattate con veicoli di controllo. Allo stesso modo il contenuto di melanina delle cellule stimolate con Arbutin è significativamente ridotto rispetto ai controlli.Sebbene le cellule siano morfologicamente simili tra i gruppi di trattamento, Arbutin diminuisce l'area del pigmento nero rispetto alle cellule trattate di controllo. Questo metodo è utile per lo screening delle attività utilizzando la nostra libreria composta. Ci sono oltre centinaia di campioni da testare rapidamente.Inoltre questo metodo può anche essere utilizzato per indagare il meccanismo che coinvolge la melanogenesi. Dopo che i candidati bioattivi sono stati identificati i composti, per la loro testimonianza dello studio dei meccanismi biologici o delle applicazioni commerciali.

quantification-of-hypopigmentation-activity-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

Rilevamento del pH-dipendente attività di<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

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Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

Quantificazione di abbondanza e ricarica i livelli di RNA di trasferimento in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Metabolismo di mappatura: Monitoraggio dell'attività della deidrogenasi del lattato direttamente nel tessuto

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Un test In Vitro per rilevare attività di tRNA-Isopentenyl Transferase

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

Privo di calibrazione In Vitro quantificazione delle proteine omo-oligomerizzazione utilizzando Strumentazione commerciale e libero, Open Source Software di analisi di luminosità

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of physiological processes. Mitochondrial dysfunction is a primary cause of a number of metabolic and neurodegenerative diseases. Intact mitochondria are critical for their proper functioning. The enzyme citrate synthase is localized in the mitochondrial matrix and thus can be used as a quantitative enzyme marker of intact mitochondrial mass. Given that many molecules and pathways that have important functions in mitochondria are highly conserved between humans and Drosophila, and that an array of powerful genetic tools are available in Drosophila, Drosophila serves as a good model system for studying mitochondrial function. Here, we present a protocol for fast and simple measurement of citrate synthase activity in tissue homogenate from adult flies without isolating mitochondria. This protocol is also suitable for measuring citrate synthase activity in larvae, cultured cells, and mammalian tissues.

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

We present a protocol for a colorimetric assay of citrate synthase activity for quantification of intact mitochondrial mass in Drosophila tissue homogenates.

Un saggio colorimetrico dell'attività Citrate Synthase in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids are conserved lipid mediators that regulate multiple biological processes in a variety of organisms. In C. elegans, 2-AG has been found to possess different roles, including modulation of dauer formation and cholesterol metabolism. This report describes a method to overcome the difficulties associated with the costs and stability of deuterated standards required for 2-AG quantification. The procedure for the synthesis of the standard is simple and can be performed in any laboratory, without the need for organic synthesis expertise or special equipment. In addition, a modification of Folch&#39;s method to extract the deuterated standard from C. elegans culture is described. Finally, a quantitative and analytic method to detect 2-AG using the stable isotopically labeled analog 1-AG-d5 is described, which provides reliable results in a fast-chromatographic run. The procedure is useful for studying the multiple roles of 2-AG in C. elegans while also being applicable to other studies of metabolites in different organisms.

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work describes a robust and straightforward method to detect and quantify the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegans. An analytical deuterated standard us prepared and used for the quantification of 2-AG by isotopic dilution and liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS).

Sintesi di uno standard deuterato per la quantificazione di 2-Arachidonoylglycerol a Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

Quantificazione delle dinamiche della rete di interazione proteica mediante co-immunoprecipitazioni multiplexate

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

Quantificazione del Coenzevia A nelle cellule e nei tessuti

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Quantificazione ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

Autore in primo piano: Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale  

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...