Name: quantification of hypopigmentation activity in vitro
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Coreia de planejamento e avaliação de tecnologia em alimentos, agricultura e silvicultura (IPET) através do programa de desenvolvimento de tecnologia agro-Bioindustry, financiado pelo Ministério da agricultura, alimentação e Assuntos rurais (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) e escola de Ciências da vida e biotecnologia para BK21 PLUS, Universidade de Coreia.

1. preparação de reagentes, compostos e médio
<ol><li>Prepare B16F10 meio completo de crescimento. Suplemento Dulbecco modificado médio da águia (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina (PEST).<ol>
<li>Para fazer 500 mL de meio completo, misture 445 mL do meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) com 50 mL de FBS e 5 mL de pragas em um frasco de vidro esterilizado de 1 L. Após a mistura suavemente, filtrar o meio através de um filtro de garrafa-top 0,2 µm para um novo frasco ...

<ol>
	<li>Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+controlling+the+migration+of+melanocytes+and+melanoma+cells.">Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin.">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).</li><li>Galvan, I., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+chemistry+and+the+ecology+of+stress.">Melanin chemistry and the ecology of stress.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).</li><li>Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+whitening+cosmetics:+Feedback+and+challenges+in+the+development+of+natural+skin+lighteners.">Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners.</a> Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).</li><li>Cooksey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+indirect+formation+of+the+catecholic+intermediate+substrate+responsible+for+the+autoactivation+kinetics+of+tyrosinase.">Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).</li><li>Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+identify+inhibitors+of+melanin+biosynthesis+via+the+quality+control+of+tyrosinase.">Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).</li><li>Gillbro, J. M., Olsson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanogenesis+and+mechanisms+of+skin-lightening+agents+-+existing+and+new+approaches.">The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches.</a> International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).</li><li>Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+in+the+study+of+human+skin+melanocytes.">Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes.</a> Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Momilactione+B+inhibits+protein+kinase+A+signaling+and+reduces+tyrosinase-related+proteins+1+and+2+expression+in+melanocytes.">Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes.</a> Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibitions+of+lemon+balm+(Melissa+officinalis)+ethanolic+extract+on+melanogenesis+in+B16-F1+murine+melanocytes:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+its+gene+expression.">Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression.</a> Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-Coumaric+acid+inhibition+of+CREB+phosphorylation+reduces+cellular+melanogenesis.">p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis.</a> European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibition+of+&#947;-oryzanol+on+cellular+melanogenesis:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+reduction+of+melanogenic+gene+expression+by+a+protein+kinase+a-dependent+mechanism.">Dual inhibition of &#947;-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism.</a> Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).</li><li>Choi, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+isoflavone+puerarin+and+its+glycosides+on+melanogenesis+in+B16+melanocytes.">Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes.</a> European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).</li><li>Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+reduces+cellular+melanin+content+via+suppression+of+microphthalmia-associated+transcription+factor+in+B16-F1+murine+melanocytes.">Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes.</a> Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).</li><li>Overwijk, W. W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B16+as+a+mouse+model+for+human+melanoma.">B16 as a mouse model for human melanoma.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+protocol+for+assessing+regulators+of+pigmentation.">A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation.</a> Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).</li><li>D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+melanogenesis.">Signaling pathways in melanogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).</li><li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage:+interactions+between+KIT+and+MITF.">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).</li><li>Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-MSH+and+melanogenesis+in+normal+human+adult+melanocytes.">&#945;-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).</li><li>Hu, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+evaluation+of+melanin+content+and+production+of+pigment+cells+in+vitro.">Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).</li><li>Carriel, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+histochemical+method+for+a+simultaneous+staining+of+melanin+and+collagen+fibers.">A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).</li></ol>

Apresentamos os protocolos para avaliar a atividade de hipopigmentação de compostos de teste usando melanócitos cultivados. Os resultados representativos mostraram o efeito de hipopigmentação de arbutin, um inibidor da tirosinase que inibiu o conteúdo de melanina de celular e atividade de tirosinase. Estes métodos são amplamente utilizados na investigação de actividade antifato. Usando estes ensaios, nós identificamos também com êxito vários compostos bioativos que possuem efeitos inibitórios melanogênese...

A melanina desempenha um papel crítico na fisiologia, patologia e toxicologia de vários órgãos, incluindo a pele, olhos e cérebro1. As principais funções de melanina são efeitos foto-triagem e bioquímicos. A melanina absorve a luz infravermelha e visível, bem como a radiação ultravioleta (UV), com taxas de aumento de absorção em comprimentos de onda mais curtos de luz; assim, a melanina protege tecidos dos danos causados pela luz visível ou UV radiação2. A melanina é um antioxidante e tem uma afinidade com metais e outros produtos químicos tóxicos; Portanto, pode proteger os tecidos de estresse oxidativo e químicas3. No entanto, a produção excessiva de melanina provoca problemas dermatológicos.
A quantidade e a qualidade de melanina na pele e íris são os mais importantes determinantes da cor da íris e da pele. Os indivíduos podem ter preferências de cor de pele diferente; alguns favorecem uma pele bronzeada, enquanto outros favorecem a cores de pele mais claras. Dependendo desses perfis de consumidor, hipopigmentação cosméticos foram desenvolvidos para satisfazer cada um dos mercados para pele favorecido cores4. Da mesma forma, estudos de atividade hipopigmentação e antifato são importantes, tanto cientificamente como na prática.
Melanogênese é o processo complexo de biossíntese de melanina através de uma série de reações químicas enzimáticas e espontâneas em melanócitos. Um melanócito é cercado por aproximadamente 36 queratinócitos e melanócitos são as fábricas de síntese de melanina que distribuem seus produtos para os queratinócitos vizinhos. Na pele, a melanina produzida e armazenada no compartimento de partir dos melanócitos é transportada para queratinócitos vizinhos nos epiderme através de dendritos.
L-tirosina serve como substrato inicial para a melanogênese e a tirosinase enzima catalisa duas reações consecutivas que convertem a L-tirosina em 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) e depois em dopaquinone. Estas reações são o passo limitante na melanogênese5,6. Por conseguinte, hipopigmentação atividade primeiro pode ser medida avaliando a atividade de tirosinase celular diretamente. Para fazer isso, melanócito extratos contendo tirosinase são incubados com DOPA e o dopaquinone produzido nas amostras pode ser medido por espectrofotometria em 475 nm. Os valores são normalizados pelas concentrações de proteína das amostras e substâncias com resultado de atividade hipopigmentação em menos formação de dopaquinone em comparação com controles.
Em segundo lugar, atividade hipopigmentação pode ser quantificada através da medição de melanina nos melanócitos cultivados diretamente. Após tratamento de células com o material de teste, a melanina é extraída sob condições alcalinas e o conteúdo de melanina é quantificado por espectrofotometria em 400 nm. Um agente de hipopigmentação resultará em um menor conteúdo de melanina que os controles7.
Finalmente, a atividade de hipopigmentação pode ser quantificada pela coloração de Fontana-Masson melanina e análise de imagens subsequentes. Na coloração de Fontana-Masson, grânulos de melanina reduzem nitrato de amônia-prata para um estado visível de preto metálico e as áreas pretas de células em imagens microscópicas representam a quantidade de melanina.
Um agente de hipopigmentação geralmente dá resultados consistentes e comparáveis com estes três métodos, que confirma que a atividade da substância é válida. Alternativamente, pode ser útil medir a expressão de genes-chave e proteínas na melanogênese em resposta a uma substância de teste para examinar a atividade hipopigmentação. Além de tirosinase, proteínas relacionadas a tirosinase (TRP-1) e dopachrome dopachrome (TRP-2) são enzimas essenciais na melanogênese8. O fator de transcrição microphthalmia-associado do fator de transcrição (MITF) é um mestre regulador na melanogênese e quantificação dos seus níveis de expressão de gene/proteína ou um ensaio de atividade do promotor também pode ser usado para avaliar a atividade de hipopigmentação.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbutin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>#10960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Yakuri Pure Chemicals</td>
			<td>#16223</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold chloride</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>AHG0226</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Samchun chemical</td>
			<td>H0255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bio basic Canada Inc.</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#60218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duksan pure chemicals</td>
			<td>#81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100121</td>
			<td>Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#2163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Union Carbide</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosinase from mushroom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3824</td>
			<td>25 KU</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of hypopigmentation activity in vitro

Este estudo apresenta métodos de laboratório para a quantificação de hipopigmentação atividade in vitro. Melanina, o pigmento principal em melanócitos, é sintetizada em resposta a múltiplos fatores celulares e ambientais. A melanina protege as células da pele de dano ultravioleta, mas também tem funções biofísicas e bioquímicas. Produção excessiva ou acúmulo de melanina nos melanócitos pode causar problemas dermatológicos, como sardas, manchas, melasma e moles. Portanto, o controle da melanogênese com hipopigmentação agentes é importante em indivíduos com necessidades clínicas ou cosméticos. Melanina é sintetizada principalmente nas melanossomas dos melanócitos em um complexo processo bioquímico chamado melanogênese, que é influenciado por extrínsecos e fatores intrínsecos, como hormônios, inflamação, idade e exposição à luz ultravioleta. Nós descrevemos três métodos para determinar a atividade de hipopigmentação de produtos químicos ou substâncias naturais em melanócitos: medição da atividade de tirosinase 1) celular e conteúdo de melanina 2) e 3) coloração e quantificação celular melanina com imagem análise.
Na melanogênese, tirosinase catalisa a etapa limitante que converte a L-tirosina em 3,4-dihidroxifenilalanina (l-dopa) e depois em dopaquinone. Portanto, a inibição da tirosinase é um mecanismo primário hipopigmentação. Em melanócitos cultivados, atividade de tirosinase pode ser quantificada pela adição de l-dopa como substrato e produção de dopaquinone de medição por espectrofotometria. Melanogênese também pode ser medido através da quantificação do conteúdo de melanina. A fração celular contendo melanina é extraída com NaOH e melanina é quantificada espectrofotometricamente. Finalmente, o conteúdo de melanina pode ser quantificado por análise de imagem após coloração de Fontana-Masson de melanina. Embora os resultados desses ensaios in vitro não podem sempre ser reproduzidos na pele humana, estes métodos são amplamente utilizados na pesquisa da melanogênese, especialmente como o passo inicial para identificar potenciais hipopigmentação atividade. Esses métodos também podem ser usados para avaliar a atividade dos melanócitos, crescimento e diferenciação. Resultados consistentes com os três diferentes métodos garantir a validade dos efeitos.

Resultados representativos para a atividade de hipopigmentação de arbutin, um antifato composto, em B16F10 melanócitos são mostrados abaixo. A figura 1A mostra que o arbutin suprimida significativamente a atividade de tirosinase celular comparada com o controle do veículo-tratados. Da mesma forma, o conteúdo de melanina de células estimuladas com arbutin foi significativamente reduzido em comparação com os controles (figura 1B</s...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Nós descrevemos três métodos experimentais para avaliar a atividade de hipopigmentação de produtos químicos em vitro: quantificação do conteúdo de atividade e 2) melanina tirosinase 1) celular e 3) medição de melanina por celular melanina mancha e análise de imagem.

Quantificação de hipopigmentação atividade In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Este método pode ser útil no desenvolvimento de cosméticos funcionais e agente de pele com atividades anti-melanógenas. Está lá para realizar e o resultado pode ser obtido rapidamente. Além disso, esse método pode ser útil para pesquisadores, que querem identificar ou investigar os efeitos ou os compostos ou investigar as atividades anti-melanoma ou promelanogênicas.Para medir a atividade tyrosinase comece semeando Melanicidas B16-F10 a cinco vezes 10 para as quatro células por poço de uma concentração de placa de 24 poços em meio completo por 24 horas em uma incubadora de cultura celular. No dia seguinte, substitua o supernaente em cada poço por DMEM complementado com composto de teste recém-preparado e controle inibidor ou um controle negativo e devolva a placa à incubadora por mais 72 horas. No final do tratamento enxágue os poços duas vezes com 300 microliters de pbs frios por poço e coloque a placa no gelo.Em seguida, adicione 300 microliters de tampão de lise a cada poço usando um raspador de células para coletar os lises celulares após cinco minutos. Transfira as suspensões de partículas celulares resultantes para tubos individuais de microcentrífugo de 1,5 mililitro. E homogeneize os lises três vezes por dois segundos a 14,500 rpm no gelo para liberar o Tyrosinase intercelular.Pellule os detritos celulares por centrifugação e transfira os supernantes para tubos individuais de centrífugas de 1,5 mililitro no gelo. Aloque 70 microlitros de cada supernaente para poços individuais de uma micro placa de poliestireno clara de 96 poços e adicione 140 microlitros de solução de substrato de Tyrosinase a cada poço de supernascer. Agitando a placa suavemente para misturar o conteúdo do poço.Em seguida, incubar a placa a 37 graus celsius por duas horas. E meça a atividade tyrosinase em 475 nanômetros em um leitor de microplato. Para medir o teor de melanina das células após a coleta do lysate das células tratadas como demonstrado.Colete os lises por centrifugação e transfira os supernantes para novos tubos. Adicione 300 microliters de um hidróxido de sódio normal a cada pelota para uma incubação de uma hora a 60 graus Celsius. Seguido pela centrifugação das suspensões de células dissolvidas.Em seguida, transfira 200 microliters dos supernantes para cada poço de uma placa de 96 poços. E meça o conteúdo da melanina em um leitor de microplaca a um comprimento de onda de 400 nanômetros. Para fontana-masson Staining, lave as células tratadas duas vezes com 300 microliters de pbs frios e fixe as células com 200 microliters de 10% formalina por uma hora a quatro graus Celsius.Enxágüe as células grossas com água destilada e adicione 200 microlitros de 58 a 68 graus celsius solução de trabalho de prata ammoniacal para cada poço. Para uma hora de incubação a 37 graus Celsius ou até que as células se tornem amarelas-marrons na cor. Enxágüe as células manchadas com água destilada seguida de incubação de dois minutos em cloreto de ouro de 0,1% à temperatura ambiente.Enxágüe as células tratadas com cloreto de ouro com água destilada e adicione 200 microliters de solução de tiossulfato de sódio às células. Depois de dois minutos enxágue as células novamente. E rotular as células com 200 microliters de vermelho nuclear rápido por poço por cinco minutos.Em seguida, lave as células manchadas com água da torneira antes de imaginar sob um microscópio leve. Para análise de limiar, abra as imagens na imagem J e selecione imagem, ajuste e Limite de cores. Para medir a área manchada com Fontana Masson, ajuste a barra do parâmetro de brilho a zero e ajuste o brilho ao ponto em que todas as células manchadas pretas ou marrons estão incluídas.Selecione Analisar e analisar partículas e verificar a caixa de resumo na janela Analisar partículas e clique bem para obter um resumo dos resultados e copie e cole os dados em uma planilha. O tratamento com arbutina suprime significativamente a atividade de Tyrosinase celular em comparação com as células tratadas com veículos de controle. Da mesma forma, o teor de melanina das células estimuladas com Arbutin é significativamente reduzido em comparação com os controles.Embora as células sejam morfologicamente semelhantes entre os grupos de tratamento, a arbutina diminui a área do pigmento negro em comparação com as células tratadas de controle. Este método é útil para a triagem de atividades usando nossa biblioteca composta. Há mais de centenas de amostras para serem testadas rapidamente.Além disso, este método também pode ser usado para investigar o mecanismo que envolve a melanogênese. Após a identificação dos compostos de candidatos bioativos, para seu testemunho do estudo de mecanismos biológicos ou aplicações comerciais.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Bioquímica

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantificação de abundância e carregamento níveis de RNAs de transferência em Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Metabolismo de mapeamento: Monitorar a atividade de lactato desidrogenase diretamente no tecido

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Um ensaio In Vitro para detectar a atividade de Transferase de tRNA-isopentenilo

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Deteção da fosfolipase C atividade no cérebro Homogenate da abelha

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ensaios de Ubiquitinação e Deubiquitinação in vitro de histonas Nucleossomal

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...