Name: quantification of hypopigmentation activity in vitro
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

Эта работа была поддержана Кореи институт планирования и оценки технологии в продовольствия, сельского и лесного хозяйства (IPET) через программу развития технологии Agri-биоиндустрии, финансируемая министерством сельского хозяйства, продовольствия и сельских дел (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) и школа наук о жизни и биотехнологии для BK21 плюс, Университет Кореи.

1. Подготовка среднего, соединений и реагенты
<ol><li>Подготовка полного среднего роста B16F10. Дополнение Дульбекко изменение средних орла (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% пенициллина/стрептомицина (ПЕШТ).<ol>
<li>Чтобы сделать 500 мл полного среднего, смешайте 445 мл среды Дульбекко изм...

<ol>
	<li>Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+controlling+the+migration+of+melanocytes+and+melanoma+cells.">Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin.">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).</li><li>Galvan, I., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+chemistry+and+the+ecology+of+stress.">Melanin chemistry and the ecology of stress.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).</li><li>Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+whitening+cosmetics:+Feedback+and+challenges+in+the+development+of+natural+skin+lighteners.">Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners.</a> Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).</li><li>Cooksey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+indirect+formation+of+the+catecholic+intermediate+substrate+responsible+for+the+autoactivation+kinetics+of+tyrosinase.">Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).</li><li>Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+identify+inhibitors+of+melanin+biosynthesis+via+the+quality+control+of+tyrosinase.">Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).</li><li>Gillbro, J. M., Olsson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanogenesis+and+mechanisms+of+skin-lightening+agents+-+existing+and+new+approaches.">The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches.</a> International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).</li><li>Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+in+the+study+of+human+skin+melanocytes.">Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes.</a> Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Momilactione+B+inhibits+protein+kinase+A+signaling+and+reduces+tyrosinase-related+proteins+1+and+2+expression+in+melanocytes.">Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes.</a> Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibitions+of+lemon+balm+(Melissa+officinalis)+ethanolic+extract+on+melanogenesis+in+B16-F1+murine+melanocytes:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+its+gene+expression.">Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression.</a> Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-Coumaric+acid+inhibition+of+CREB+phosphorylation+reduces+cellular+melanogenesis.">p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis.</a> European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibition+of+&#947;-oryzanol+on+cellular+melanogenesis:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+reduction+of+melanogenic+gene+expression+by+a+protein+kinase+a-dependent+mechanism.">Dual inhibition of &#947;-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism.</a> Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).</li><li>Choi, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+isoflavone+puerarin+and+its+glycosides+on+melanogenesis+in+B16+melanocytes.">Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes.</a> European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).</li><li>Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+reduces+cellular+melanin+content+via+suppression+of+microphthalmia-associated+transcription+factor+in+B16-F1+murine+melanocytes.">Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes.</a> Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).</li><li>Overwijk, W. W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B16+as+a+mouse+model+for+human+melanoma.">B16 as a mouse model for human melanoma.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+protocol+for+assessing+regulators+of+pigmentation.">A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation.</a> Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).</li><li>D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+melanogenesis.">Signaling pathways in melanogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).</li><li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage:+interactions+between+KIT+and+MITF.">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).</li><li>Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-MSH+and+melanogenesis+in+normal+human+adult+melanocytes.">&#945;-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).</li><li>Hu, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+evaluation+of+melanin+content+and+production+of+pigment+cells+in+vitro.">Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).</li><li>Carriel, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+histochemical+method+for+a+simultaneous+staining+of+melanin+and+collagen+fibers.">A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).</li></ol>

Мы представили протоколы для оценки гипопигментация активности тестирования соединений с помощью искусственного меланоцитов. Представитель результаты показали гипопигментация эффект арбутин, ингибитор тирозиназы, который препятствует тирозиназы активности и сотовых содержание м?...

Melanin играет решающую роль в физиологии, патологии и токсикологии ряда органов, включая кожу, глаза и мозг1. Основные функции меланина, Фото скрининг и биохимические эффекты. Меланин поглощает инфракрасный и видимый свет, а также ультрафиолетового (УФ) излучения, с показателями увеличения поглощения при более коротких длинах волн света; Таким образом меланин защищает ткани от повреждения, вызванные видимого света или ультрафиолетового излучения2. Меланин является антиоксидантом и обладает сродством для металлов и других токсичных химических веществ; Таким образом он может защитить тканей от окислительного и химического стресса3. Однако чрезмерное производство меланина вызывает Дерматологические проблемы.
Количество и качество меланина в коже и радужки являются наиболее важными факторами, определяющими цвет радужной оболочки и кожу. Люди могут иметь разные кожи цветовые предпочтения; Некоторые пользу загорелой кожи, в то время как другие выступают светлее цвета кожи. В зависимости от этих профилей потребителя гипопигментация косметики были разработаны для удовлетворения индивидуальных рынков для благоприятствования кожи цвета4. Соответственно исследования гипопигментация и анти melanogenic деятельности являются важными научно и практически.
Меланогенеза — сложный процесс биосинтеза меланина через ряд ферментных и спонтанное химических реакций в меланоциты. Один меланоцит окружена примерно 36 кератиноцитов и меланоцитов являются заводы синтез меланина, которые распространяют их продукт для соседних кератиноцитов. В коже меланин производятся и хранятся в melanosomal отсеке меланоцитов транспортируется в соседних кератиноцитов эпидермиса через дендритов.
L-тирозин служит первоначальный субстрат для меланогенеза и фермента тирозиназы катализирует два последовательных реакций, которые преобразуют L-тирозин в 3,4-Диоксифенилаланин (ДОПЫ), а затем в допаквинон. Эти реакции являются тариф ограничивая шаг в меланогенеза5,6. Соответственно деятельность гипопигментация сначала может измеряться путем оценки активности клеточных тирозиназы непосредственно. Чтобы сделать это, экстракты меланоцитов, содержащие тирозиназы инкубируют с ДОПЫ и допаквинон производится на образцах может измеряться методом спектрофотометрии на 475 Нм. Значения нормализованы по концентрации белка образцов и веществ с гипопигментация результат деятельности в формировании меньше допаквинон, по сравнению с контролем.
Во-вторых гипопигментация активность может быть определена количественно измеряя меланина в культивированный меланоцитов непосредственно. После обработки клеток с испытательным материалом, меланин добывается в щелочных условиях и содержание меланина количественно методом спектрофотометрии на 400 Нм. Агент гипопигментация приведет к более низким содержанием меланина, чем элементы управления7.
Наконец гипопигментация активность может быть квантифицировано фонтана-Masson меланина окрашивание и последующего анализа. В Fontana-Masson окрашивание, гранулы меланина уменьшить аммиака Серебряный нитрат видимое состояние черный металлик и черные области ячеек в микроскопических изображений представляют количество меланина.
Гипопигментация агент обычно дает результаты, последовательной и сопоставимой с помощью этих трех методов, которая подтверждает, что действие вещества является допустимым. Кроме того это может быть полезно для измерения выражение ключевых генов и белков в меланогенеза в ответ на тест вещество для изучения активности гипопигментация. Помимо тирозиназы важнейших ферментов в меланогенеза8являются Тирозиназа связанных белков (ГТО-1) и dopachrome tautomerase (ГТО-2). Транскрипционный фактор фактор транскрипции микрофтальмия связанные (MITF) является основной регулятор меланогенеза и количественная оценка ее уровни выражения гена/белков или промоутера деятельности пробирного также может использоваться для оценки деятельности гипопигментация.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbutin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>#10960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Yakuri Pure Chemicals</td>
			<td>#16223</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold chloride</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>AHG0226</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Samchun chemical</td>
			<td>H0255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bio basic Canada Inc.</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#60218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duksan pure chemicals</td>
			<td>#81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100121</td>
			<td>Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#2163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Union Carbide</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosinase from mushroom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3824</td>
			<td>25 KU</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of hypopigmentation activity in vitro

Это исследование представляет лабораторных методов для количественной оценки гипопигментация активность в лабораторных условиях. Меланин, основных пигмента в меланоцитов, синтезируется в ответ на несколько клеточных и экологических факторов. Меланин защищает клетки кожи от ультрафиолетового повреждения, но также биофизических и биохимических функций. Чрезмерное производство или накопление меланина в меланоцитов может вызвать дерматологических проблем, таких как веснушки, темные пятна, меланодермия и родинки. Таким образом у людей с клинической или косметических потребностями важен контроль меланогенеза с гипопигментация агентов. Меланин главным образом синтезируется в меланосомы меланоцитов в сложный биохимический процесс, называемый меланогенеза, которая находится под влиянием внешние и внутренние факторы, такие как гормоны, воспаление, возраст и ультрафиолетовых лучей. Мы опишем три метода для определения активности гипопигментация химических веществ или природных веществ в меланоциты: Измерение 1) сотовых тирозиназы активности и содержание меланина 2) и 3) пятная и количественного определения сотовой меланина с изображением анализ.
В меланогенеза тирозиназы катализирует тариф ограничивая шаг, который преобразует L-тирозин в 3,4-Диоксифенилаланин (л-дофа) и затем в допаквинон. Таким образом ингибирования тирозиназы — это основной гипопигментация механизм. В культивированный меланоцитов активность тирозиназы может быть определена количественно, добавляя l-допы как субстрат и измерения допаквинон производства методом спектрофотометрии. Меланогенеза может также измеряться путем количественной оценки содержание меланина. Меланин содержащих сотовой фракция добывается с NaOH и меланина количественно спектрофотометрически. Наконец может быть определена количественно содержание меланина, путем анализа изображений после фонтана-Masson пятнать меланина. Хотя результаты этих анализов в лабораторных условиях не всегда могут быть воспроизведены в коже человека, эти методы широко используются в меланогенеза исследований, особенно в качестве первого шага для выявления потенциальных гипопигментация активности. Эти методы могут также использоваться для оценки активности меланоцитов, роста и дифференцировки. Согласованные результаты с тремя различными методами обеспечения достоверности эффектов.

Представитель результаты деятельности гипопигментация арбутин, анти melanogenic соединения, в B16F10, меланоцитов приведены ниже. Рисунок 1A показывает, что арбутин значительно подавлена деятельность клеточных тирозиназы, по сравнению с элементом управления,...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Мы опишем три экспериментальные методы для оценки деятельности гипопигментация химических веществ в пробирке: количественная оценка деятельности и 2) меланина содержание 1) сотовых тирозиназы и 3) измерение меланина сотовой меланина окрашивание и изображения анализа.

Количественная оценка деятельности гипопигментация в пробирке

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Этот метод может быть полезен в развитии функциональной косметики и кожных средств с антимеланогенной деятельностью. Это там, чтобы выполнить и результат может быть получен быстро. Кроме того, этот метод может быть полезен для исследователей, которые хотят определить или исследовать эффекты или соединения или исследовать антимеланогенную или промеланогенную деятельность.Измерение активности тирозиназы начинается с посева меланицидов B16-F10 в пять раз от 10 до четвертых клеток на колодец 24 хорошо концентрации пластины в полной среде в течение 24 часов в инкубаторе клеточной культуры. На следующий день замените супернатант в каждом хорошо с DMEM дополнен свежеприготовленным тестовым соединением и ингибитор контроля или отрицательного контроля и вернуть пластину в инкубатор еще на 72 часа. В конце обработки промыть скважины два раза с 300 микролитров холодного pbs на колодец и поместить пластину на лед.Затем добавьте 300 микролитров буфера лиза к каждому хорошо с помощью сотового скребка для сбора лизайтов ячейки через пять минут. Перенесите полученные суспензии частиц клеток в отдельные микро-центрифуги на 1,5 миллилитровые трубки. И гомогенизировать лизаты три раза в течение двух секунд при 14500 об/мин на льду, чтобы освободить межклеточный тирозиназы.Пеллет клеточного мусора путем центрифугации и передачи супернатантов в отдельных 1,5 миллилитров центрифуги труб на льду. Выделите 70 микролитров каждого супернатанта на отдельные скважины ясной 96 скважины полистирола микро пластины и добавить 140 микролитров тирозиназы субстрат решение каждой скважины супернатанта. Встряхивание пластины нежный, чтобы смешать содержимое хорошо.Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. И измерить активность тирозиназы на 475 нанометров на микроплатформенной считыватель. Измерить содержание меланина в клетках после сбора лизата обработанных клеток, как это было продемонстрировано.Соберите лизаты путем центрифугации и перенесите супернатанты в новые трубки. Добавьте 300 микролитров одного нормального гидроксида натрия к каждой грануле в течение одного часа инкубации при 60 градусах по Цельсию. За этим следует центрифугация растворенных клеточных суспензий.Затем перенесите 200 микролитров супернатантов на каждый колодец из 96 хорошо пластины. И измерить содержание меланина на микропластине читателя на 400 нанометров длине волны. Для Фонтана-Массон Стейнс, мыть обработанные клетки два раза с 300 микролитров холодного pbs и исправить клетки с 200 микролитров 10%формалин в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию.Промыть толстые клетки дистиллированной водой и добавить 200 микролитров от 58 до 68 градусов по Цельсию аммиачных серебра рабочий раствор для каждой хорошо. В течение одного часа инкубации при 37 градусах по Цельсию или до тех пор, пока клетки не станут желто-коричневого цвета. Промыть окрашенные клетки дистиллированной водой с последующим двухминутным инкубацией в 0,1%золото хлорида при комнатной температуре.Промыть клетки хлорида золота дистиллированной водой и добавить 200 микролитров раствора тиосульфата натрия в клетки. Через две минуты снова промыть клетки. И этикетки клеток с 200 микролитров ядерного быстрого красного на колодец в течение пяти минут.Затем мыть окрашенные клетки с водопроводной водой перед изображением под световым микроскопом. Для анализа порога откройте изображения на изображении J и выберите изображение, отрегулируйте и цветовый порог. Для измерения площади, окрашенной Fontana Masson, установите планку параметра яркости до нуля и отрегулируйте яркость до точки, в которую включены все черные или коричневые окрашенные ячейки.Выберите анализ и анализ частиц и проверьте поле суммы в окне Analyze Particles, затем нажмите кнопку «Хорошо», чтобы получить резюме результатов и скопировать и вставить данные в электронную таблицу. Лечение Арбутина значительно подавляет активность клеточной тирозиназы по сравнению с клетками, обработанными транспортным средством. Аналогичным образом содержание меланина в клетках, стимулируемых Арбутином, значительно снижается по сравнению с контролем.Хотя клетки морфологически похожи между группами лечения, Арбутин уменьшает площадь черного пигмента по сравнению с контрольными обработанными клетками. Этот метод полезен для скрининга деятельности с помощью нашей библиотеки соединения. Есть более сотни образцов, которые должны быть проверены быстро.Кроме того, этот метод также может быть использован для исследования механизма, связанного с меланогенезом. После того, как биологически активные кандидаты соединения были определены, для их показания к изучению биологических механизмов или коммерческого применения.

quantification-of-hypopigmentation-activity-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

Обнаружение рН-зависимой активности<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Сопровождающий HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; и<em&gt; В Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

Количественная оценка изобилие и зарядки уровней передачи РНК в Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Сопоставление метаболизма: Мониторинг активности лактатдегидрогеназы непосредственно в ткани

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

In Vitro Assay для обнаружения деятельности трансферазы tRNA изопентенил

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of physiological processes. Mitochondrial dysfunction is a primary cause of a number of metabolic and neurodegenerative diseases. Intact mitochondria are critical for their proper functioning. The enzyme citrate synthase is localized in the mitochondrial matrix and thus can be used as a quantitative enzyme marker of intact mitochondrial mass. Given that many molecules and pathways that have important functions in mitochondria are highly conserved between humans and Drosophila, and that an array of powerful genetic tools are available in Drosophila, Drosophila serves as a good model system for studying mitochondrial function. Here, we present a protocol for fast and simple measurement of citrate synthase activity in tissue homogenate from adult flies without isolating mitochondria. This protocol is also suitable for measuring citrate synthase activity in larvae, cultured cells, and mammalian tissues.

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

We present a protocol for a colorimetric assay of citrate synthase activity for quantification of intact mitochondrial mass in Drosophila tissue homogenates.

Колориметрический анализ цитратсинстого действия в Drosophila Меланогастер

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids are conserved lipid mediators that regulate multiple biological processes in a variety of organisms. In C. elegans, 2-AG has been found to possess different roles, including modulation of dauer formation and cholesterol metabolism. This report describes a method to overcome the difficulties associated with the costs and stability of deuterated standards required for 2-AG quantification. The procedure for the synthesis of the standard is simple and can be performed in any laboratory, without the need for organic synthesis expertise or special equipment. In addition, a modification of Folch&#39;s method to extract the deuterated standard from C. elegans culture is described. Finally, a quantitative and analytic method to detect 2-AG using the stable isotopically labeled analog 1-AG-d5 is described, which provides reliable results in a fast-chromatographic run. The procedure is useful for studying the multiple roles of 2-AG in C. elegans while also being applicable to other studies of metabolites in different organisms.

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work describes a robust and straightforward method to detect and quantify the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegans. An analytical deuterated standard us prepared and used for the quantification of 2-AG by isotopic dilution and liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS).

Синтез пониженного стандарта для количественной оценки 2-Arachidonoylglycerol в Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

Количественная оценка динамики взаимодействия белков с использованием мультиплексного со-иммунопрециации

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

Количественная оценка коэнзима А в клетках и тканях

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения мтДНК

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

В центре внимания автора: Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения митохондриальной ДНК на основе изображений  

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения митохондриальной ДНК на основе изображений

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...