Name: quantification of hypopigmentation activity in vitro
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Korea Institute i planeringen och utvärderingen för teknik i livsmedel, jordbruk och skogsbruk (IPET) genom programmet Agri-bioindustri teknik utveckling, finansierade av ministeriet för jordbruk, livsmedel och landsbygdens frågor (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) och skolan av biovetenskap och bioteknik för BK21 PLUS, Korea University.

1. beredning av Medium, föreningar och reagenser
<ol><li>Förbered B16F10 komplett odlingsmedium. Tillägg Dulbecco's modified örnens medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin (SKADEDJUR).<ol>
<li>För att göra 500 mL komplett medium, blanda 445 mL Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) med 50 mL FBS och 5 mL av PEST i en steriliserad 1 L glasflaska. Efter blandning försiktigt, filtrera medium genom ett 0,2 µm flaska-top filter till en ny steriliserad glasflaska och sedan ...

<ol>
	<li>Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+controlling+the+migration+of+melanocytes+and+melanoma+cells.">Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).</li><li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin.">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).</li><li>Galvan, I., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanin+chemistry+and+the+ecology+of+stress.">Melanin chemistry and the ecology of stress.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).</li><li>Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+whitening+cosmetics:+Feedback+and+challenges+in+the+development+of+natural+skin+lighteners.">Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners.</a> Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).</li><li>Cooksey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+indirect+formation+of+the+catecholic+intermediate+substrate+responsible+for+the+autoactivation+kinetics+of+tyrosinase.">Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).</li><li>Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+identify+inhibitors+of+melanin+biosynthesis+via+the+quality+control+of+tyrosinase.">Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).</li><li>Gillbro, J. M., Olsson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanogenesis+and+mechanisms+of+skin-lightening+agents+-+existing+and+new+approaches.">The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches.</a> International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).</li><li>Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+in+the+study+of+human+skin+melanocytes.">Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes.</a> Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Momilactione+B+inhibits+protein+kinase+A+signaling+and+reduces+tyrosinase-related+proteins+1+and+2+expression+in+melanocytes.">Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes.</a> Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibitions+of+lemon+balm+(Melissa+officinalis)+ethanolic+extract+on+melanogenesis+in+B16-F1+murine+melanocytes:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+its+gene+expression.">Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression.</a> Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-Coumaric+acid+inhibition+of+CREB+phosphorylation+reduces+cellular+melanogenesis.">p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis.</a> European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).</li><li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+inhibition+of+&#947;-oryzanol+on+cellular+melanogenesis:+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+reduction+of+melanogenic+gene+expression+by+a+protein+kinase+a-dependent+mechanism.">Dual inhibition of &#947;-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism.</a> Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).</li><li>Choi, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+isoflavone+puerarin+and+its+glycosides+on+melanogenesis+in+B16+melanocytes.">Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes.</a> European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).</li><li>Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Betaine+reduces+cellular+melanin+content+via+suppression+of+microphthalmia-associated+transcription+factor+in+B16-F1+murine+melanocytes.">Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes.</a> Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).</li><li>Overwijk, W. W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B16+as+a+mouse+model+for+human+melanoma.">B16 as a mouse model for human melanoma.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+protocol+for+assessing+regulators+of+pigmentation.">A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation.</a> Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).</li><li>D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+melanogenesis.">Signaling pathways in melanogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).</li><li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage:+interactions+between+KIT+and+MITF.">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).</li><li>Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-MSH+and+melanogenesis+in+normal+human+adult+melanocytes.">&#945;-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).</li><li>Hu, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+evaluation+of+melanin+content+and+production+of+pigment+cells+in+vitro.">Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).</li><li>Carriel, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+histochemical+method+for+a+simultaneous+staining+of+melanin+and+collagen+fibers.">A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).</li></ol>

Vi presenterade protokoll för att utvärdera aktiviteten hypopigmentering av test föreningar använder odlade melanocyter. De representativa resultat visade hypopigmentering effekten av arbutin, en tyrosinas-hämmare som hämmade tyrosinase aktivitet och cellulära melanin-halt. Dessa metoder används i anti-melanogenic aktivitet forskning. Med dessa testmetoder, vi har också framgångsrikt identifierat flera bioaktiva föreningar som har melanogenes hämmande effekter på B16F10 celler tidigare decennium<sup class="x...

Melanin spelar en avgörande roll i fysiologi, patologi och toxikologin hos flera organ inklusive hud, ögon och hjärna1. De viktigaste funktionerna av melanin är foto-screening och biokemiska effekter. Melanin absorberar infrarött och synliga ljus samt ultraviolett (UV) strålning, ökad absorption priser på kortare våglängder av ljus; Således, melanin skyddar vävnader från skador orsakade av synligt ljus eller UV strålning2. Melanin är en antioxidant och har en affinitet för metaller och andra giftiga kemikalier; Därför kan det skydda vävnader från oxidativ och kemisk stress3. Men orsakar överproduktion av melanin dermatologiska problem.
Kvantitet och kvalitet av melanin i huden och iris är de viktigaste faktorerna för färgen på iris och huden. Individer kan ha olika hud färg preferenser; några gynnar solbrun hud, medan andra föredrar ljusare hudfärger. Beroende på dessa konsumenten profiler, har hypopigmentering kosmetika utvecklats för att tillgodose enskilda marknader för gynnade hud färger4. Studier av hypopigmentering och anti-melanogenic aktivitet är därför viktiga både vetenskapligt och praktiskt.
Melanogenes är den komplexa processen att melanin biosyntes genom en serie enzymatiska och spontana kemiska reaktioner i melanocyterna. En melanocyte omges av cirka 36 keratinocyter och melanocyter är de fabriker av melanin-syntesen som distribuerar sin produkt till närliggande keratinocyter. I huden transporteras melanin produceras och lagras i melanosomal facket av melanocyter till närliggande keratinocyter i epidermis via dendriter.
L-tyrosin serverar ursprungliga substratet för melanogenes och enzymet tyrosinase katalyserar två på varandra följande reaktioner att omvandla L-tyrosin i 3,4-dihydroxifenylalanin (DOPA) och sedan in i dopaquinone. Dessa reaktioner är det hastighetsbegränsande steget i melanogenes5,6. Hypopigmentering aktivitet kan följaktligen först mätas genom att bedöma cellulära tyrosinase aktivitet direkt. Till gör så, melanocyte extrakt som innehåller tyrosinas inkuberas med DOPA och den dopaquinone som produceras i proverna kan mätas genom spektrofotometri på 475 nm. Värdena är normaliserade av protein koncentrationerna av prover och ämnen med hypopigmentering aktivitet resulterar i mindre dopaquinone bildning jämfört med kontroller.
För det andra, hypopigmentering aktivitet kan kvantifieras genom mätning melanin i odlade melanocyter direkt. Efter behandling av celler med testämnet, melanin utvinns under alkaliska förhållanden och melanin innehållet kvantifieras i spektrofotometri vid 400 nm. En hypopigmentering agent kommer att resultera i en lägre melanin-halt än kontroller7.
Slutligen kan aktiviteten hypopigmentering kvantifieras av Fontana-Masson melanin färgning och efterföljande bildanalys. I Fontana-Masson färgning, melanin granulat minska ammoniak-silvernitrat till en synlig svart metalliskt tillstånd och svarta områden av celler i mikroskopiska bilder representerar mängden melanin.
En hypopigmentering agent ger oftast konsekventa och jämförbara resultat med dessa tre metoder, vilket bekräftar att aktiviteten som substansen är giltig. Alternativt kan det vara bra att mäta uttrycket av viktiga gener och proteiner i melanogenes som svar på en testsubstans att undersöka hypopigmentering aktivitet. Utöver tyrosinase är tyrosinas-relaterade proteiner (TRP-1) och dopachrome tautomerase (TRP-2) kritiska enzymer i melanogenes8. De transkription faktorn mikroftalmi-associerade transkriptionsfaktor (MITF) är en mästare regulator i melanogenes och kvantifiering av dess gen/proteinnivåer med uttryck eller en arrangören aktivitet assay kan också användas för att bedöma hypopigmentering aktivitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbutin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>#10960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Yakuri Pure Chemicals</td>
			<td>#16223</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold chloride</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>AHG0226</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Samchun chemical</td>
			<td>H0255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bio basic Canada Inc.</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#60218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Duksan pure chemicals</td>
			<td>#81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear fast red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100121</td>
			<td>Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>#3817-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td>
			<td>Duksan Pure Chemicals</td>
			<td>#2163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Bio Basic Canada</td>
			<td>TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Union Carbide</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosinase from mushroom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3824</td>
			<td>25 KU</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of hypopigmentation activity in vitro

Denna studie presenterar laborativa metoder för kvantifiering av hypopigmentering aktivitet in vitro. Melanin, stora pigmentet i melanocyterna, syntetiseras som svar på flera cellulära och miljömässiga faktorer. Melanin skyddar hudcellerna från ultraviolett skador, men har också biofysiska och biokemiska funktioner. Överdriven produktion eller ackumulering av melanin i melanocyter kan orsaka dermatologiska problem, såsom fräknar, pigmentfläckar, melasma och mullvadar. Kontroll av melanogenes med hypopigmentering agenter är därför viktigt hos individer med kliniska eller kosmetiska behov. Melanin bildas främst i melanosomer av melanocyterna i en komplicerad biokemisk process som kallas melanogenes, som påverkas av extrinsic och inneboende faktorer, såsom hormoner, inflammation, ålder och ultraviolett ljus exponering. Vi beskriver tre metoder för att bestämma aktiviteten hypopigmentering av kemikalier eller naturliga ämnen i melanocyterna: mätning av 1) cellulär tyrosinase aktivitet och 2) melanin innehåll och 3) färgning och kvantifiera cellulära melanin med bild analys.
I melanogenes katalyserar tyrosinas det hastighetsbegränsande steget som konverterar L-tyrosin i 3,4-dihydroxifenylalanin (L-DOPA) och sedan till dopaquinone. Hämning av tyrosinas är därför en primär hypopigmentering mekanism. I odlade melanocyter, kan tyrosinase aktivitet kvantifieras genom att lägga till L-DOPA som substrat och mäta dopaquinone produktion av spektrofotometri. Melanogenes kan även mätas genom kvantifiering av melanin-halt. Andelen som innehåller melanin cellulära extraheras med NaOH och melanin är kvantifierade spektrofotometriskt. Slutligen kan den melanin-halten kvantifieras av bildanalys efter Fontana-Masson färgning av melanin. Även om resultaten av dessa in vitro-testmetoder inte får alltid återges i mänsklig hud, används dessa metoder allmänt i melanogenes forskning, särskilt som det första steget att identifiera potentiella hypopigmentering aktivitet. Dessa metoder kan också användas för att bedöma melanocyte aktivitet, tillväxt och differentiering. Konsekventa resultat med de tre olika metoderna försäkrar om validiteten på effekterna.

Representativa resultat för aktiviteten hypopigmentering av arbutin, en anti-melanogenic förening, i B16F10 melanocyter visas nedan. Figur 1A visar det arbutin signifikant suppression av cellulära tyrosinase aktiviteten jämfört med kontrollen behandlade. Likaså minskade den melanin-halten i celler stimuleras med arbutin signifikant jämfört med kontroller (figur 1B). Mikroskopiska bilder av celler som färgas med Fontana-M...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro at JoVE.com

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Vi beskriver tre experimentella metoder för att utvärdera aktiviteten hypopigmentering av kemikalier in vitro-: kvantifiering av 1) cellulär tyrosinase aktivitet och 2) melanin innehåll och (3) mätning av melanin genom cellulär melanin färgning och bild analys.

Kvantifiering av hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Denna metod kan vara till hjälp i utvecklingen av funktionell kosmetika och hud agent med anti-melanogenic verksamhet. Det är där för att utföra och resultatet kan erhållas snabbt. Dessutom kan denna metod vara användbar för forskare, som vill identifiera eller undersöka effekterna eller föreningarna eller undersöka de antimelanogenic eller promelanogenic aktiviteter.Att mäta till Tyrosinas aktivitet börja genom sådd B16-F10 Melanicides på en fem gånger 10 till den fjärde celler per brunn av en 24 väl plåt koncentration i komplett medium i 24 timmar i en cellkultur inkubator. Nästa dag, byt ut supernatanten i varje brunn med DMEM kompletterat med nyberedda testförening och inhibitorkontroll eller en negativ kontroll och återsända plattan till inkubatorn i ytterligare 72 timmar. I slutet av behandlingen skölj brunnarna två gånger med 300 mikroliter av kall pbs per brunn och placera plattan på is.Nästa lägga till 300 mikroliter av lysbuffert till varje brunn med hjälp av en cell skrapa för att samla cellen lysates efter fem minuter. Överför de resulterande cellpartikelupphängningar till enskilda 1,5 milliliter mikro-centrifugrör. Och homogenisera lysaterna tre gånger i två sekunder vid 14, 500 rpm på is för att frigöra den intercellulära Tyrosinasen.Pellet cellskräpet genom centrifugering och överför supernatanterna till enskilda 1,5 milliliter centrifugrör på is. Fördela 70 mikroliter av varje supernatant till enskilda brunnar av en klar 96 väl polystyren mikroplatta och tillsätt 140 mikroliter av Tyrosinase substratlösning till varje brunn av supernatant. Skakar plattan skonsamt för att blanda brunnsinnehållet.Sedan inkubera plattan vid 37 grader varmt i två timmar. Och mäta till Tyrosinas aktivitet vid 475 nanometer på en mikroplatt läsare. Att mäta melaninhalten i cellerna efter att ha samlat lysate av de behandlade cellerna som visat.Samla ihop lysaterna genom centrifugering och för över supernatanterna till nya rör. Tillsätt 300 mikroliter av en normal natriumhydroxid till varje pellet för en timmes inkubation vid 60 grader Celsius. Följt av centrifugeringen av de upplösta cellupphängningar.Överför sedan 200 mikroliter av supernatanterna till varje brunn av en 96 brunnsplatta. Och mäta melanin innehållet på en mikroplatt läsare på en 400 nanometer våglängd. För Fontana-Masson Färgning, tvätta de behandlade cellerna två gånger med 300 mikroliter av kall pbs och fixa cellerna med 200 mikroliter av 10%formalin i en timme vid fyra grader Celsius.Skölj de tjocka cellerna med destillerat vatten och tillsätt 200 mikroliter på 58 till 68 grader celsius Ammoniak silver arbetslösning till varje brunn. För en timmes inkubation vid 37 grader Celsius eller tills cellerna blir gulbruna i färg. Skölj de färgade cellerna med destillerat vatten följt av två minuters inkubation i 0,1%guldklorid vid rumstemperatur.Skölj de guldkloridbehandlade cellerna med destillerat vatten och tillsätt 200 mikroliter av natriumtiosulfatlösning till cellerna. Efter två minuter skölj cellerna igen. Och märka cellerna med 200 mikroliter av nukleära snabbt rött per brunn i fem minuter.Tvätta sedan de färgade cellerna med kranvatten före avbildning under ett ljusmikroskop. För tröskelanalys öppnar du bilderna i bild J och väljer bild, justera och Färgtröskel. Att mäta området färgas med Fontana Masson ställa in ljusstyrka parametern bar till noll och justera ljusstyrkan till den punkt där alla de svarta eller bruna färgade cellerna ingår.Välj Analysera och analysera partiklar och markera summarize rutan i analysera partiklar fönstret klicka sedan på okej för att få en sammanfattning av resultaten och kopiera och klistra in data i ett kalkylblad. Arbutin behandling dämpar signifikant cellulär Tyrosinas aktivitet jämfört med kontroll fordonet behandlade celler. Likaså melanin innehållet av celler stimuleras med Arbutin minskas avsevärt jämfört med kontrollerna.Även om cellerna är morfologiskt lika mellan behandlingsgrupper, minskar Arbutin området av svart pigment jämfört med den kontroll behandlade celler. Denna metod är användbara för aktiviteter screening med hjälp av vår sammansatta bibliotek. Det finns över hundratals prover som ska testas snabbt.Dessutom denna metod kan också användas för att undersöka mekanismen som involverar melanogenesis. Efter de bioaktiva kandidaterna föreningar har identifierats, för deras vittnesmål till studiet av biologiska mekanismer eller kommersiella tillämpningar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detektering av den pH-beroende aktivitet för<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; och<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantifiering av överflödet och laddning nivåer av överföring RNAs i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide kvantifiering av översättning i spirande jäst av Ribosomen profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Kartläggning Metabolism: Övervakning av laktatdehydrogenas aktivitet direkt i vävnad

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

En In Vitro Assay att upptäcka tRNA-Isopentenyl transferas aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-gratis In Vitro kvantifiering av Protein Homo-oligomerisering använder kommersiella instrumentering och fri, öppen källkod ljusstyrka analys programvara

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Påvisande av fosfolipas C aktivitet i hjärnan Homogenatet från honungsbiet

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro Ubiquitination och Deubiquitination assays av Nukleosomala Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...