Name: an in vitro approach to photodynamic therapy
Uploaded: 2018-08-17T14:00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy at JoVE.com

Forfatterne har ingen anerkendelser.

1. forberedelse af celler
<ol><li>Plade 20.000 celler i 2 mL af næringssubstratet i hver brønd med en 6-godt plade ved hjælp af steril teknik i en biosikkerhed kabinet.</li>
	<li>Placer 6-godt plader i en fugtig inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 24 timer til at tillade celler til at overholde plader.</li>
</ol>2. forberedelse af Photosensitizer til behandling af celler
<ol><li>Forberede 0,5, 1 og 2 mM 5-ALA løsninger i dyrkningsmediet. Hvis føtal bovint serum (FBS) er en ingrediens af næringssubstratet, forberede og behandle celler med 5-ALA i dyrkningsmediet løsning med 0,1% FBS for inkubationer. 11 , 12 i dette tilfælde SCC-13 celler ikke kræver FBS, så 5-ALA blev tilføjet direkte til keratinocytter serumfrit medium suppleret med bovin hypofyse ekstrakt og epidermal vækstfaktor.</li>
	<li>Opsug næringssubstratet og cellerne vaskes med mindst 2 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS).</li>
	<li>Opsug PBS og tilsættes 2 mL 0, 0.5, 1 eller 2 mM 5-ALA løsninger i separate plader eller brønde.</li>
	<li>Inkuber celler med 0, 0.5, 1 eller 2 mM 5-ALA på et 36-37 ° C varme blok i 30 min. beskytte celler fra lys eksponering under inkubation ved hjælp af aluminiumsfolie.</li>
	<li>Opsug de 0, 0,5, 1 og 2 mM 5-ALA løsninger og cellerne vaskes med 2 mL PBS.</li>
	<li>Opsug PBS og der tilsættes 2 mL af næringssubstratet for blå lys bestråling.</li>
</ol>3. blåt lys lysbehandling
<ol><li>Inden bestråling af cellerne, tænde den blå lys enhed (f.eks., lysdiode, fluorescerende eller halogenlys) og køre for en cyklus (1.000 s) til at varme op for enheden. Det blå lys enhed bør have en output boelgelaengden 417 +/-5 nm. Tillader enheden at køre for en cyklus før behandlinger sikrer, at den blå lys bølgelængde og irradians er konsekvent i hele photoactivation fasen.</li>
	<li>Bruge et fotometer for at måle irradians på cellens overflade. Det blå lys indstråling på cellens overflade bør være 10 mW/cm2. Afstanden mellem lyset og cellerne kan skal justeres for at opnå en irradians 10 mW/cm2 afhængigt af intensiteten af lyskilden.</li>
	<li>Placer 0, 0,5, 1 og 2 mM ALA behandlingsgrupper på en sort overflade under den blå lyskilde. Bestråle cellerne med blåt lys til 1.000 s (16 min og 40 s) for en total fluens 10 J/cm2. Efter blue light photoactivation er cellerne klar til analyse.</li>
</ol>4. indsamling og farvning
<ol><li>Forberede flow buffer ifølge producenten retningslinjer (Se Tabel af materialer).</li>
	<li>Opsug næringssubstratet og vask celler med 2 mL PBS.</li>
	<li>Der tilsættes 1 mL 0,25% trypsin-EDTA og tillader cellerne at løsrive i ca 3-5 min. Cellerne kan undersøges under mikroskop at bekræfte celle detachement.</li>
	<li>Der tilsættes 1 mL af næringssubstratet (eller PBS) med 10% føtal bovint serum til at deaktivere trypsin.</li>
	<li>Indsamle cellesuspension til mærket 5 mL flow rør.</li>
	<li>Spin 5 mL flow røret i en centrifuge på 201 x g i 5 min. aspirat løsning uden at fjerne celle pellet.</li>
	<li>Tilføje 200 µL af flow buffer med konjugeret annexin V antistof (1 µL af annexin v per 39 µL af flow buffer) til hver prøve.</li>
	<li>Resuspend celler og anbringes i inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 20 min til at tillade annexin V bindende.</li>
	<li>Tilføje 3 µL af 7-AAD til hver prøve. Inkuber i 5 min ved stuetemperatur.</li>
</ol>5. strømmen Cytometric analyse
<ol><li>Følg strømmen forskellige producent retningslinjer for set-up (Se Tabel af materialer).</li>
	<li>Indsamle og analysere prøver med flowcytometri. 13
</li>
	<li>Udføre statistisk sammenligning af behandling og kontrolgrupper ved hjælp af variansanalyse (ANOVA)14. Sammenlign middel til behandlingsgrupper at middelværdien af kontrollen med en Dunnett test for post hoc analyser.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Morton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Dermatology+Forum+guidelines+on+topical+photodynamic+therapy.">European Dermatology Forum guidelines on topical photodynamic therapy.</a> European Journal of Dermatology. 25 (4), 296-311 (2015).</li><li>Ozog, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy:+A+clinical+consensus+guide.">Photodynamic therapy: A clinical consensus guide.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. 42 (7), 804-827 (2016).</li><li>Abrahamse, H., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+photosensitizers+for+photodynamic+therapy.">New photosensitizers for photodynamic therapy.</a> Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).</li><li>Josefsen, L. B., Boyle, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+and+the+development+of+metal-based+photosensitisers.">Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers.</a> Metal-Based Drugs. 2008, 276109 (2008).</li><li>Ohgari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+involved+in+&#948;-aminolevulinic+acid+(ALA)-induced+photosensitivity+of+tumor+cells:+Relation+of+ferrochelatase+and+uptake+of+ALA+to+the+accumulation+of+protoporphyrin.">Mechanisms involved in &#948;-aminolevulinic acid (ALA)-induced photosensitivity of tumor cells: Relation of ferrochelatase and uptake of ALA to the accumulation of protoporphyrin.</a> Biochemical pharmacology. 71 (1-2), 42-49 (2005).</li><li>Kessel, D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+photodamage+and+PDT-induced+apoptosis.">Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 42 (2), 89-95 (1998).</li><li>Goldberg, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+in+skin+rejuvenation.">Photodynamic therapy in skin rejuvenation.</a> Clinics in Dermatology. 26 (6), 608-613 (2008).</li><li>Sakamoto, F. H., Lopes, J. D., Anderson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+for+acne+vulgaris:+A+critical+review+from+basics+to+clinical+practice:+Part+I.+Acne+vulgaris:+When+and+why+consider+photodynamic+therapy.">Photodynamic therapy for acne vulgaris: A critical review from basics to clinical practice: Part I. Acne vulgaris: When and why consider photodynamic therapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 63 (2), 183-193 (2010).</li><li>Boen, M., Brownell, J., Patel, P., Tsoukas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photodynamic+therapy+in+acne:+An+evidence-based+review.">The role of photodynamic therapy in acne: An evidence-based review.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (3), 311-321 (2017).</li><li>Allison, R. R., Moghissi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncologic+photodynamic+therapy:+Clinical+strategies+that+modulate+mechanisms+of+action.">Oncologic photodynamic therapy: Clinical strategies that modulate mechanisms of action.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 10 (4), 331-341 (2013).</li><li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+ultra+short+photodynamic+therapy:+heating+fibroblasts+during+sub-30-minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+increases+photodynamic+therapy-induced+cell+death.">Thermal ultra short photodynamic therapy: heating fibroblasts during sub-30-minute incubation of 5-aminolevulinic acid increases photodynamic therapy-induced cell death.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. , (2017).</li><li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+ultra+short+sub-30+minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+vitro.">Efficacy of ultra short sub-30 minute incubation of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy in vitro.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 49 (6), 592-598 (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology.+Annexin+V+and+Propidium+Iodide+Labeling.">Cell Biology. Annexin V and Propidium Iodide Labeling.</a> JoVE. , (2018).</li><li>Mamalis, A., Koo, E., Sckisel, G., Siegel, D., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+impact+of+thermal+aminolaevulinic+acid+photodynamic+therapy+on+apoptosis+and+reactive+oxygen+species+generation+in+human+dermal+fibroblasts.">Temperature-dependent impact of thermal aminolaevulinic acid photodynamic therapy on apoptosis and reactive oxygen species generation in human dermal fibroblasts.</a> British Journal of Dermatology. 175 (3), 512-519 (2016).</li><li>Gilaberte, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+intrinsic+factors+involved+in+the+resistance+of+squamous+cell+carcinoma+to+photodynamic+therapy.">Cellular intrinsic factors involved in the resistance of squamous cell carcinoma to photodynamic therapy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 134 (9), 2428-2437 (2014).</li><li>Yoon, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanophotosensitizers+engineered+to+generate+a+tunable+mix+of+reactive+oxygen+species,+for+optimizing+photodynamic+therapy,+using+a+microfluidic+device.">Nanophotosensitizers engineered to generate a tunable mix of reactive oxygen species, for optimizing photodynamic therapy, using a microfluidic device.</a> Chemistry of Materials. 26 (4), 1592-1600 (2014).</li><li>Chen, Y. -. C., Lou, X., Zhang, Z., Ingram, P., Yoon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cancer+cell+sphere+formation+for+characterizing+the+efficacy+of+photo+dynamic+therapy+in+3D+cell+cultures.">High-throughput cancer cell sphere formation for characterizing the efficacy of photo dynamic therapy in 3D cell cultures.</a> Scientific Reports. 5, 12175 (2015).</li><li>Campos, C., Inada, N., Kurachi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+PDT+on+breast+cancer+spheroids.">Low-dose PDT on breast cancer spheroids.</a> Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy XXVII. , (2018).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+temperature+on+5-aminolevulinic+acid-based+photodynamic+reaction+in+keratinocytes+in+vitro.">The influence of temperature on 5-aminolevulinic acid-based photodynamic reaction in keratinocytes in vitro.</a> Photodermatology, Photoimmunology &amp; Photomedicine. 26 (2), 83-88 (2010).</li><li>Juzeniene, A., Juzenas, P., Kaalhus, O., Iani, V., Moan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+Accumulation+of+protoporphyrin+IX+after+topical+application+of+5-aminolevulinic+acid+and+its+methylester+and+hexylester+derivatives+in+normal+mouse+skin.">Temperature effect on Accumulation of protoporphyrin IX after topical application of 5-aminolevulinic acid and its methylester and hexylester derivatives in normal mouse skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 452-456 (2002).</li><li>Novak, B., Heesen, L., Schary, N., Lubbert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+different+illumination+parameters+on+protoporphyrin+IX+induced+cell+death+in+squamous+cell+carcinoma+cells.">The influence of different illumination parameters on protoporphyrin IX induced cell death in squamous cell carcinoma cells.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 385-392 (2018).</li></ol>

DUSA/Sun Pharmaceutical leveret 5-ALA og BLU-U lys enhed. Dette håndskrift blev støttet af Dr. Jagdeos resterende midler. Oplysningerne repræsenterer ikke synspunkter US Department of veterananliggender eller de Forenede Staters regering.

Der var en betydelig stigning i SCC-13 apoptose efter 30 min inkubationer 0,5, 1 og 2 mM 5-ALA efterfulgt af 1.000 s af blåt lys. Disse resultater stemmer overens med vores tidligere publicerede forskning viser, at 5-ALA inkubationer på 30 min. efterfulgt af blå lys aktivering fører til en dosisafhængig stigning i andelen af fibroblastceller undergår apoptose12, 14.
Denne eksperimentelle tilgang til at studere PDT har fordele og begrænsninger. De beskrevne metoder er i overensstemmelse med klinisk praksis som et kommercielt tilgængelige PS og lyskilde anvendtes. Forskere kan tilpasse metoderne med forskellige celletyper, PSs, lyskilder og bestråling parametre. Der er dog begrænsninger for denne tilgang som denne protokol er designet for vedhængende celler dyrkes i en éncellelag. I klinisk praksis, forskelle i væv arkitektur eller sygdom patologi (dvs., hyperkeratose eller fibrose) kan nedsætte PS absorption eller lys penetration15. Som følge heraf kan behandling doser og eksperimentelle resultater ikke direkte modsvarer klinisk praksis. Klumpformet tumor modeller og mikrofluid chip er blevet undersøgt som metoder til at nærmere replikere tumor microenvironments16,17,18. Spheroids har indre og ydre cellulære nicher, som kan varierende indarbejder photosensitizers og repræsenterer heterogene tumor arkitektur. Andre forskere har brugt mikrofluid chips til skærmen behandling betingelser og vaskulære levering af photosensitizers. Mikrofluid chips kan dog være dyre at udvikle eller vanskelige at gennemføre for forskere uvante med teknikken. Derudover kan spheroids og mikrofluid chips ikke afspejle den kliniske behandling af hudkræft, hvor photosensitizers anvendes direkte til tumor overfladen uden vaskulære formidling. Forskere kan være nødvendigt at vurdere fordele og ulemper ved éncellelag kultur, klumpformet tumor modeller og mikrofluid chips for at studere PDT i forskellige sygdom systemer. Så der er ingen immun celler eller ekstracellulære matrix, er det ikke muligt at afgøre, hvordan PDT påvirker komplekse celle-celle interaktioner. Forskere kan være nødvendigt at bekræfte in vitro- eksperimentelle resultater ved hjælp af dyremodeller og kliniske forsøg. For at opnå høj Inter test gyldighed, er det vigtigt at opretholde konsekvent inkubation og lys parametre, når du udfører in vitro- PDT eksperimenter.
Temperatur er kendt for at ændre effekten af PDT19. Et studie viste, at celledød, 5-ALA optagelse, PP-IX dannelse og cytokin udgivelse kan styrkes ved at inkubere celler med 5-ALA ved temperaturer op til 44 ° C19. Inkubation temperaturer over 44 ° C kan føre til termisk induceret celledød, og inkubation temperaturer under 20 ° C kan ikke føre til betydelige 5-ALA udbredelsen og ophobningen19. Vi anbefaler, at forskere udføre PS inkubationer på en temperatur-justerbar varme blok ved en konstant temperatur til kontrol for potentielt forstyrrende termiske virkninger. Derudover er det vigtigt at udruge photosensitizer for en tilstrækkelig mængde af tid til at gøre det muligt for omdannelse af 5-ALA til PP-IX. I denne protokol, var SCC-13 cellerne inkuberes med 5-ALA i 30 min, som med held induceret celle apoptose. Vi har tidligere vist, at en 10 min inkubation af 5-ALA ikke betydeligt øger apoptose i fibroblast sammenlignet med ubehandlet kontrol fibroblaster11,14. PP-IX begynder at akkumulere i mus hud efter 5-ALA inkubere seks minutter ved 37 ° C. Derfor, efter ti minutter 5-ALA inkubation, der muligvis ikke tilstrækkelig ophobning af PP-IX til at fremkalde celle apoptose20. Vi anbefaler et minimum inkubationstiden for 20-30 min for 5-ALA baseret på vores tidligere undersøgelser11,14. Forskere kan være nødvendigt at optimere inkubationstid baseret på laboratoriet indstilling, photosensitizer interesse, celletype og kliniske indikation. Antistof titrering og optimering eksperimenter kan foretages for de bedste resultater ved hjælp af fabrikanter retningslinjer. Andre assays af interesse kan udføres efter blue light photoactivation herunder dihydroethidium flow cytometric kvantificering af ROS. 14
Variation i mængden af lys leveret pr. enhed areal (dvs. kulstofassimilationsraten) og total bestråling dosis (dvs. fluens) i photoactivation fasen kan påvirke ROS dannelse og celle apoptose21. Forholdet mellem fluens, irradians og tid kan beskrives ved følgende ligning:
Fluens (J/cm2) = irradians (W/cm2) x tid (s)
Som fluens er afhængig af tid, kan forlænge eller afkorte photoactivation faser ændre behandlingen effektivitet. Irradians er proportional med afstanden firkant mellem lyskilden og målvæv. Som et resultat, hvis lyset er for langt væk, der muligvis ikke tilstrækkelig lys energi leveret til den målrettede væv til at ophidse den PS. Alternativt indstrålingen kan forhøjes med lys, der reflekteres fra omgivende overflader. Derfor anbefaler vi udfører lys bestrålinger med celle kultur plader placeres på en sort overflade for at forhindre lysrefleksion. Forskere kan erhverve kommercielt tilgængelige eller FDA-godkendt blå lysdioder og fluorescerende enheder til brug i PDT eksperimenter, men disse enheder kan have forskellige power output og lys felt ensartethed. En bølgelængde-specifikke fotometer bør anvendes til at måle irradians på celleoverfladen og ensartethed i feltet lys før hver eksperiment for ensartede resultater. Et kommercielt tilgængelige diffuser kan bruges til at forbedre felt ensartethed, hvis nødvendigt.
I sammendrag, har vi beskrevet en in vitro- metode til at undersøge PDT ved detaljering teori, eksperimentelle metoder, begrænsninger, potentielle faldgruber og anbefalinger til optimering. PDT er en nyttig kliniske procedure og in vitro- forskning kan give mulighed for udvikling af roman PSs, optimering af protokoller og nye indikationer for PDT.

Fotodynamisk terapi (PDT) er en medicinsk procedure, der involverer inkubation af et eksogent anvendt photosensitizer (PS) efterfulgt af synligt lys photoactivation til at fremkalde celle apoptose. Federal Drug Administration (FDA) har godkendt PDT til behandling af aktinisk keratose (AK), og kliniske retningslinjer anbefaler PDT som en behandling for visse ikke-melanom hudkræft og acne vulgaris1,2. Nye ikke-dermatologiske anvendelser for PDT omfatter behandling af mave, prostata og gynækologiske kræftformer3. PDT er en fordelagtig terapeutisk modalitet, da det er billigt, ikke-invasiv og forbundet med minimale bivirkninger og ardannelse2.
I det første trin i PDT, en PS anvendes og lov til at akkumulere intracellulært2. I USA, er aktuel 5-aminolaevulinsyre (5-ALA) almindeligt anvendt til behandling af AKs. Under inkubation er fase, 5-ALA omdannes protoporphyrin IX (PP-IX) via hæm biosyntese pathway i indarbejdet celler3. Kræft og præ kræft celler er faldet indolacetaldoximdehydratase aktivitet, som konverterer protoporphyrin IX (PP-IX), i det endelige produkt, hæm. Som et resultat, ophobes kræft celler PP-IX i forhold til normale celler4,5. Denne ophobning af PP-IX i kræft og præ kræft celler i forhold til det omgivende væv giver mulighed for PDT at være en målrettet strategi med minimale bivirkninger. Lys bestråling fører til reaktive ilt arter (ROS) generation når ilt accepterer ophidset elektroner fra PP-IX. PP-IX har en peak absorption i det ultraviolette spektrum med mindre toppe i hele det synlige lysspektrum, herunder blå og røde lys2. ROS dannelse kan i sidste ende føre til celle apoptose, membran forstyrrelser, mitokondrie skader, immun graduering, keratinocytter spredning og kollagen omsætning6,7,8,9 , 10.
PDT blev udviklet i 1970 ' erne og er en udviklende terapeutisk modalitet3. FDA-godkendt protokollen til behandling af AKs anbefales 5-ALA hud inkubation i 14-18 h, men 1 til 2 h inkubationer er almindeligt anvendt i klinisk praksis2. In vitro, vi har vist, at kortere 15 min. 5-ALA inkubationer kan øge fibroblast celle apoptose sammenlignet med ubehandlet fibroblaster11,12. Derudover bliver roman chlorin, phthalocyanine og nanopartikel-baserede PSs studeret for at forbedre PDT virkning3. Heri, præsenterer vi en in vitro- metode til undersøgelse PDT i en vedhængende pladecellekræft celler. I denne protokol, SCC-13 cellerne inkuberes med 0, 0.5, 1.0, og 2 mM 5-ALA til 30 min og photoactivated med 417 nm blå lys til 1.000 s. Det primære resultat foranstaltning er apoptose og nekrose, som målt af annexin V og 7-aminoactinomycin D (7-AAD) flowcytometri. Denne behandling protokol er beregnet til at simulere PDT og kan justeres til at studere brugen af PDT med andre cellelinjer, photosensitizers, inkubation temperaturer eller photoactivation bølgelængder. Forberedelse af yderligere kontrolgrupper kan være nødvendige, herunder unstained, enkelt fluorophore plettet, negative og positive styringer til flowcytometri. En omfattende gennemgang af teorien, protokoller, eksperimenterende design og gating for apoptose/nekrose flowcytometri kan findes andetsteds13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1259">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Keratinocyte serum free medium&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:204px;">17005042</td>
			<td style="width:623px;">Culture medium for SSC-13 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM low glucose glutamax</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10567022</td>
			<td>Possible culture medium for other cell types</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">6-well culture plates</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>720083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For cell counting and plating&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BLU-U light&#160;</td>
			<td>DUSA</td>
			<td>Request from manufacturer</td>
			<td>Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-ALA</td>
			<td>DUSA</td>
			<td>Request from manufacturer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>C17032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowCellect Annexin Red Kit</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>FCCH100108&#160;</td>
			<td>Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSCanto II</td>
			<td>BD</td>
			<td>Request from manufacturer</td>
			<td>Any flow cytometer may be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Counting Chamber</td>
			<td>Hausser</td>
			<td>3120</td>
			<td>For cell counting and plating&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Request from manufacturer</td>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro approach to photodynamic therapy

Fotodynamisk terapi (PDT) er en medicinsk procedure, der involverer inkubation af et eksogent anvendt photosensitizer (PS) efterfulgt af synligt lys photoactivation til at fremkalde celle apoptose. Federal Drug Administration har godkendt PDT til behandling af aktinisk keratose, og kliniske retningslinjer anbefaler PDT som en behandling for visse ikke-melanom hudkræft og acne vulgaris. PDT er en fordelagtig terapeutisk modalitet, da det er billigt, ikke-invasiv, og forbundet med minimale bivirkninger og skræmme. I det første trin i PDT, en PS anvendes og lov til at akkumulere intracellulært. Efterfølgende let bestråling inducerer reaktive ilt arter formation, som kan i sidste ende føre til celle apoptose, membran forstyrrelser, mitokondrie skader, immun graduering, keratinocytter spredning og kollagen omsætning. Heri, præsenterer vi en in vitro- metode til undersøgelse PDT i en vedhængende cellelinie. Denne behandling protokol er beregnet til at simulere PDT og kan justeres til at studere brugen af PDT med forskellige cellelinjer, photosensitizers, inkubation temperaturer eller photoactivation bølgelængder. Pladecellekræft celler blev udruget med 0, 0.5, 1.0, og 2 mM 5-aminolaevulinsyre (5-ALA) i 30 min og photoactivated med 417 nm blå lys til 1.000 s. Det primære resultat foranstaltning var apoptose og nekrose, som målt af annexin V og 7-aminoactinomycin D flowcytometri. Der var en dosis-afhængige stigning i celle apoptose efter tredive minutters inkubation af 5-ALA. For at opnå høj Inter test gyldighed, er det vigtigt at opretholde konsekvent inkubation og lys parametre, når du udfører in vitro- PDT eksperimenter. PDT er en nyttig kliniske procedure og in vitro- forskning kan give mulighed for udvikling af roman PSs, optimering af protokoller og nye indikationer for PDT.

Efter SCC-13 celler blev udruget i 30 min med 0, 0,5, 1 og 2 mM 5-ALA og bestrålet med 1.000 s af blåt lys, der var en dosis-afhængige stigning i celle apoptose. Samlede apoptose (gennemsnit ± standard fejl af middelværdien) var 3,94 ± 0,34, 7,90 ± 0,52, 23.86 ± 0,52 og 38.33 ± 1,81 efter 30 min inkubation med 0, 0,5, 1 og 2 mM 5-ALA, henholdsvis, og 1000 sekunder af blå lys (figur 1). Vi sammenlignede den gennemsnitlige procentdel af apoptotiske celle mellem 0, 0,5, 1 og 2 mM 5-ALA rugede grupper ved hjælp af ANOVA. Celler behandles med 1 og 2 mM 5-ALA havde en betydelig stigning i celle apoptose i forhold til 0 mM 5-ALA behandlede celler. Figur 2A viser repræsentative flow cytometric gating af forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC) for SCC-13 cellerne inkuberes med 0, 0,5, 1 og 2 mM 5-ALA. Cirkel gating omslutter SCC-13 celle befolkning. For dette eksperiment, 7500 begivenheder blev indsamlet og SCC-13 celle befolkning gate fanget mindst 90% af begivenheder. Figur 2B viser en repræsentativ plot af 7-ald på x-aksen og annexin V på y-aksen. Cellepopulationer er gated i fire kvadranter (Q1 til Q4) til at diskriminere apoptotiske celler. Q1 (høj annexin v, lav 7-AAD) repræsenterer celler gennemgår tidlige apoptose. Q2 (høj annexin v, høj 7-AAD) repræsenterer celler underkastes sent apoptose og nekrose. Q3 (lav annexin v, høj 7-AAD) repræsenterer celler gennemgår nekrose. Q4 (lav annexin v, lav 7-AAD) repræsenterer celler ikke undergår apoptose eller nekrose. For at beregne procentdelen af celler undergår apoptose, tilføjet vi procentdelen af celler i Q1 og Q2. Inkonsistens i 5-ALA inkubation Periodelængde, inkubation temperatur eller photoactivation bestråling dosis kan ændre PDT effektivitet. Figur 3 viser en repræsentativ annexin V og 7-ald flow cytometric plot da inkubation temperatur er varieret (dvs., 27, 36 eller 42 ° C). Der var en afhængige temperaturstigning i apoptose.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig1.jpg"> Figur 1: dosisafhængig forøgelse af apoptose efter tredive minutters inkubation af 5-ALA. 5-ALA inkuberes ved 36 ° C i 30 minutter efterfulgt af 1.000 s af blåt lys i SCC-13 celler. Søjler repræsenterer gennemsnitlig procent annexin V positive celler i hver behandling og kontrolgruppen. Eksperimenter blev udført i tekniske tre eksemplarer. Statistisk signifikans var bestemt af ANOVA, med p < 0,05 angivet med en stjerne (*). Fejllinjer udgør gennemsnit ± standardfejl af middelværdien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig2.jpg"> Figur 2: repræsentant Flow Cytometry parceller. (A) repræsentative forward scatter vs side scatter flowcytometri parceller i arbitrære enheder (AU) for x - og y - aksen for 0, 0,5, 1 og 2 mM 5-ALA rugede celler. For dette eksperiment, 7500 begivenheder blev indsamlet og SCC-13 celle befolkning gate erobrede 90% af begivenheder. (B) repræsentative annexin V vs 7-ald flowcytometri parceller i AU for x - og y - aksen for 0, 0,5, 1 og 2 mM 5-ALA rugede celler. Q1: tidlige apoptotiske celler, Q2: sent apoptotiske/nekrotiske celler, Q3: nekrotiske celler og Q4: levedygtige celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig3.jpg"> Figur 3: inkubere 5-ALA ved forskellige temperaturer kan ændre PDT effektivitet. Repræsentative annexin V vs 7-ald flowcytometri parceller i AU for x - og y - aksen for SCC-13 cellerne inkuberes med 0,5 mM 5-ALA på 27, 36 og 42 ° C. Q1: tidlige apoptotiske celler, Q2: sent apoptotiske/nekrotiske celler, Q3: nekrotiske celler og Q4: levedygtige celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy at JoVE.com

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Fotodynamisk terapi (PDT) er en medicinsk procedure, der involverer inkubation af et eksogent anvendt photosensitizer (PS) efterfulgt af synligt lys photoactivation at inducere apoptose. Vi præsenterer en in vitro- PDT protokol udviklet til at simulere PDT, der kan bruges til at undersøge forskelle i PS inkubation og lys behandling parametre.

En In Vitro metode til Fotodynamisk terapi

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Brug af kvantitativ real-time PCR til Bestem donorcelle indpodning i en konkurrencepræget murin knoglemarvstransplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Cytotoksisk Effekten af ​​Fotodynamisk terapi i osteosarcomceller<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

A Multi-Modal Approach to Assessing Recovery in Youth Athletes Following Concussion

Multimodal tilgang til vurdering Recovery i Ungdom Atleter Følger Hjernerystelse

Concussion is one of the most commonly reported injuries amongst children and youth involved in sport participation. Following a concussion, youth can ...

A Neuroscientific Approach to the Examination of Concussions in Student-Athletes

En neurovidenskabelig tilgang til Undersøgelse af hjernerystelse i Student-atleter

Concussions are occurring at alarming rates in the United States and have become a serious public health concern. The CDC estimates that 1.6 to 3.8 ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

fremstilling og<em&gt; In vitro</em&gt; Karakterisering af Magnetized miR-modificerede endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

En metode til kvantificering Upper Limb Performance i min hverdag anvender accelerometre

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique som en<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool i Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Designing CAD/CAM Surgical Guides for Maxillary Reconstruction Using an In-house Approach

Designe CAD/CAM kirurgisk guider Maxillary Genopbygningsagentur ved hjælp af en In-house tilgang

Computer-aided design/computer-assisted manufacturing (CAD/CAM) is now being evaluated as a preparative technique for maxillofacial surgery. Because this ...