Name: saccharomyces cerevisiae exponential growth kinetics in batch culture to analyze respiratory and fermentative metabolism
Uploaded: 2018-09-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism at JoVE.com

Dit project werd gesteund door subsidies van de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (subsidie nummer 293940) en Fundación TELMEX-TELCEL (subsidie nummer 162005585), zowel IKOM.

1. cultuurmedia en entmateriaal voorbereiding
<ol><li>Bereiden van 100 mL vloeibare voedingsbodem van 2% gist extract-pepton-dextrose (YPD) (1 g gist extract, caseïne pepton, 2 g en 2 g glucose aan 100 mL gedestilleerd water toevoegen). Breng 3 mL van de media in 15 mL steriliseerbare conische buizen. Autoclaaf de media gedurende 15 minuten staan bij 121 ° C en 1,5 psi. Opmerking: De media kunnen worden opgeslagen voor maximaal een maand bij 4-8 ° C.</li>
	<li>Inoculeer een conische buis gevuld met 3 mL cool ster...

<ol>
	<li>Parrella, E., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+to+study+mitochondrial+dysfunction+and+disease.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease.</a> Methods. 46 (4), 256-262 (2008).</li><li>Rosas Lemus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycolysis-derived+hexose+phosphates+in+the+induction+of+the+Crabtree+effect.">The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2018).</li><li>Xu, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warburg+effect+or+reverse+Warburg+effect?+A+review+of+cancer+metabolism.">Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism.</a> Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).</li><li>De Deken, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crabtree+effect:+a+regulatory+system+in+yeast.">The Crabtree effect: a regulatory system in yeast.</a> Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).</li><li>Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+yeast+short-term+Crabtree+effect+and+its+origin.">Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin.</a> The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).</li><li>Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crabtree+and+Warburg+effects:+Do+metabolite-induced+regulations+participate+in+their+induction?.">The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction?.</a> Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).</li><li>Keating, E., Martel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimetabolic+Effects+of+Polyphenols+in+Breast+Cancer+Cells:+Focus+on+Glucose+Uptake+and+Metabolism.">Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).</li><li>Pfeiffer, T., Morley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionary+perspective+on+the+Crabtree+effect.">An evolutionary perspective on the Crabtree effect.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).</li><li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li><li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+bacterial+cultures.">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).</li><li>Cui, S., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mathematical+models+for+the+growth+of+tumors+with+time+delays+in+cell+proliferation.">Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation.</a> Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).</li><li>Benzekry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+mathematical+models+for+description+and+prediction+of+experimental+tumor+growth.">Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth.</a> Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).</li><li>Ramos-Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+induces+mitochondrial+dysfunction+and+decreases+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+a+glucose-dependent+manner.">Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).</li><li>Madrigal-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy-dependent+effects+of+resveratrol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).</li><li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+curves:+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot.">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).</li></ol>

Een lange tijd verstreken is sinds J. Monod10 uitgedrukt dat de studie van de groei van bacteriële culturen de basismethode van de microbiologie is. De komst van de moleculaire tools vertraagt het gebruik en de studie van de groei als een techniek. Ondanks de complexiteit van groei, waarbij tal van onderling samenhangende processen, kunnen de onderliggende mechanismen worden beschreven met behulp van wiskundige modellen11. Dit is een robuuste benadering die kan worden gebr...

Saccharomyces cerevisiae groei heeft gediend als een waardevol instrument te identificeren van tientallen fysiologische en moleculaire mechanismen. Groei is gemeten voornamelijk op drie manieren: seriële verdunningen voor ter plaatse testen, kolonie-vormende unit tellen en groeikrommes. Deze technieken kunnen alleen of in combinatie met een verscheidenheid aan substraten, omgevingsfactoren, mutanten en chemicaliën te onderzoeken specifieke antwoorden of fenotypen worden gebruikt.
Mitochondriale ademhaling is een biologisch proces waarin groei kinetiek met succes toegepast is voor het ontdekken van onbekende mechanismen. In dit geval de suppletie van groei media met niet-fermenteerbare koolstof bronnen zoals glycerol, lactaat of ethanol (die uitsluitend worden gemetaboliseerd door mitochondriale ademhaling), omdat de enige bron van koolstof en energie voor de evaluatie van zorgt de respiratoire groei, die belangrijk is voor de opsporing van verstoringen in oxidatieve fosforylatie activiteit1. Aan de andere kant, is het ingewikkeld om groei kinetische modellen te gebruiken als een methode voor het ontcijferen van de mechanismen achter gisting.
De studie van gisting en mitochondriale ademhaling is essentieel voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen achter bepaalde fenotypen zoals de Crabtree en Warburg effecten2,3. Het effect van de Crabtree wordt gekenmerkt door een toename van glycolytic flux, onderdrukking van mitochondriale ademhaling, en de oprichting van gisting als de primaire route voor het genereren van ATP in aanwezigheid van hoge concentraties van fermenteerbare koolhydraten (> 0,8 mM)4,5. Het Warburg effect is metabolisch analoog naar de Crabtree-effect, met het verschil dat bij zoogdiercellen het belangrijkste product van de gisting lactaat6 is. Inderdaad, het Warburg effect wordt tentoongesteld door een verscheidenheid van kankercellen, triggering van de glucose-opname- en consumptie zelfs in aanwezigheid van zuurstof7. Aldus, heeft bestuderen van de moleculaire basis van de overstap van ademhaling om gisting in het effect van de Crabtree zowel de biotechnologische gevolgen (voor de productie van ethanol) en de potentiële effecten in kankeronderzoek.
S. cerevisiae groei mogelijk een geschikt hulpmiddel om te bestuderen van de Crabtree en Warburg effecten. Dit idee is gebaseerd op het feit dat in de exponentiële fase van gist, de centrale trajecten gebruikt voor de productie van ATP zijn mitochondriale ademhaling en gisting, die essentieel is om groei te ondersteunen. Bijvoorbeeld, is de groei van S. cerevisiae nauw verwant met de functie van ATP genererende trajecten. In S. cerevisiae, de mitochondriale ademhaling produceert ongeveer 18 ATP-moleculen per molecuul glucose, overwegende dat vergisting alleen 2 ATP-moleculen genereert, vandaar de verwachting is dat de groei nauwe banden met de stofwisselingsroutes heeft het produceren van ATP8. In dit opzicht, wanneer de gisting is de belangrijkste route voor het genereren van ATP, compenseert de gist de lage productie van ATP door het optrekken van het steunpercentage van de glucose-opname. Integendeel, is de glucose consumptie door gistcellen die gebruikmaken van mitochondriale ademhaling als de hoofdbron van ATP laag. Dit geeft aan dat het belangrijk is voor de gist om zin koolhydraten beschikbaarheid voordat er wordt bepaald hoe ATP zal worden gegenereerd. Dus, de beschikbaarheid van glucose speelt een belangrijke rol in de switch tussen gisting en mitochondriale ademhaling in S. cerevisiae. In de aanwezigheid van grote hoeveelheden glucose verkiest de gist gisting als de centrale route voor het genereren van ATP. Interessant is dat wanneer de gist is fermenteren, wordt de specifieke groeisnelheid gehandhaafd op zijn maximum. Aan de andere kant onder lage niveaus van de glucose produceert S. cerevisiae ATP mitochondriale ademhaling, met behoud van lagere groeicijfers. Aldus, variatie in de concentratie van glucose en het gebruik van andere bronnen koolstof veranderingen bij de gist de voorkeur tussen fermenterende en respiratoire groei veroorzaken. Rekening houdend met dit feit met de vergelijking van exponentiële groei, kan men de biologische betekenis van kinetische parameters zoals de verdubbeling van de tijd (Dt) en specifieke groeisnelheid (µ) verkrijgen. Lagere waarden µ bleken bijvoorbeeld wanneer de gist mitochondriale ademhaling als het primaire traject gebruikt. Integendeel, onder voorwaarden die gisting gunst, hogere waarden µ bleken. Deze methode kan worden gebruikt voor het meten van de waarschijnlijke mechanismen van elke chemische stoffen op het gebied van fermentatie en mitochondriale ademhaling in S. cerevisiae.
Het doel van deze paper is voor te stellen een methode gebaseerd op de kinetiek van de groei voor het screenen van de effecten van een bepaalde stof/samengestelde op mitochondriale ademhaling of gisting.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4353</td>
			<td style="width:167px;">For inoculum incubation or conical fask cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bioscreen&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Growth curves</td>
			<td style="width:119px;">C MBR</td>
			<td>For batch cultures in microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Peptone from casein, enzymatic digest</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">82303</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">09182-1KG-F</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacteriological Agar</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td>For YPD agar preparation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>S8282</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(NH4)2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A4418</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Y1251</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yeast synthetic drop-Out medium supplements</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Y1501</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium sulfate granular</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">0792-R</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resveratrol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">R5010</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S7903</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Absolut ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Merck</td>
			<td align="right">107017</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td>2136-01</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Honeycomb microplates</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">9502550</td>
			<td>For microplate cultures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saccharomyces cerevisiae exponential growth kinetics in batch culture to analyze respiratory and fermentative metabolism

Saccharomyces cerevisiae cellen in de exponentiële fase groei hun wordt aangewezen door het produceren van ATP door middel van fermentatie en/of mitochondriaal ademhaling. De fermenteerbare koolstofconcentratie regelt voornamelijk hoe de gistcellen genereren ATP; Dus, de variatie in fermenteerbare koolhydraten niveaus rijdt de energetische stofwisseling van S. cerevisiae. Dit witboek beschrijft een methode van de high-throughput gebaseerd op exponentiële gist groei te schatten van de effecten van veranderingen van de concentratie en de aard van de koolstofbron op ademhalings- en fermenterende metabolisme. De groei van S. cerevisiae is gemeten in een microplate of geschud conische kolf door bepaling van de optische dichtheid (OD) op 600 nm. Vervolgens is een groeicurve gebouwd door plotting OD tegen de tijd, waardoor identificatie en selectie van de exponentiële fase, en is uitgerust met de vergelijking van exponentiële groei te verkrijgen van de kinetische parameters. Lage specifieke groeisnelheden met hogere verdubbeling keer vertegenwoordigen in het algemeen een respiratoire groei. Daarentegen geven hogere specifieke groeisnelheden met lagere verdubbeling keer fermenterende groei. Drempelwaarden van een verdubbeling van de tijd en de specifieke groeisnelheid worden geschat met behulp van bekende respiratoire of fermenterende aandoeningen, zoals niet-fermenteerbare koolstof bronnen of hogere concentraties van fermenteerbare suikers. Dit percentage wordt verkregen voor elke specifieke soort. Tot slot worden de berekende kinetische parameters vergeleken met de drempelwaarden vast te stellen of de gist fermenterende en/of respiratoire groei toont. Het voordeel van deze methode is de relatieve eenvoud voor inzicht in de effecten van een stof/samengestelde op fermenterende of luchtwegen metabolisme. Het is belangrijk om te benadrukken dat groei een ingewikkelde en complexe biologische proces is; Daarom moet de voorlopige gegevens van deze methode worden bevestigd door de kwantificering van zuurstofverbruik en accumulatie van bijproducten van gisting. Daarmee is deze techniek kan worden gebruikt als een oriënterende van verbindingen/stoffen die kunnen storen of verbetering van fermenterende of luchtwegen metabolisme.

Groeikrommes kunnen worden gebruikt om preliminair discrimineren tussen ademhalings- en fermenterende fenotypen in de S. cerevisiae gist. Dus we batch culturen van S. cerevisiae (BY4742) uitgevoerd met verschillende glucose concentraties die zijn gemeld voor het opwekken van fermenterende groei: 1%, 2% en 10% (m/v)9. Culturen waaruit een fermenterende fenotype hebben een kleine vertraging-fase en een exponentiële fase met een hoog groeipercentage...

Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism at JoVE.com

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae Exponentiële groei kinetiek in Batch cultuur voor het analyseren van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme

Hier presenteren we een protocol voor het inschatten van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme door het aanbrengen van de exponentiële groei van Saccharomyces cerevisiae voor de vergelijking van exponentiële groei. Berekening van de kinetische parameters zorgt voor de screening van invloeden van stoffen/verbindingen op gisting of mitochondriaal ademhaling.

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op biotechnologische en biomedische gebieden, zoals wat de moleculaire basis zijn achter de Warburg en de Crabtree-effecten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de hoge doorvoer studie van de effecten van bepaalde stoffen in de luchtwegen en fermentatieve metabolisme mogelijk maakt. Begin met het inenten van een 15-milliliter conische buis met drie milliliter koele, steriele 2%gist extract peptone dextrose, of YPD bouillon, met 250 microliter s.cerevisiae gistcellen bewaard in glycerol bij negatieve 20 graden Celsius.Incubeer de gist 's nachts in een orbitale shaker bij 30 graden Celsius en 200 rpm. voor strepen op een 60-milliliter, 2%YPD agar gevuld petrischaal de volgende ochtend. Kweek het gerecht op 30 graden Celsius tot geïsoleerde kolonies worden waargenomen.Dan inenten een enkele geïsoleerde kolonie in een nieuwe conische buis met 10 milliliter koele, steriele 2%YPD bouillon voor 's nachts cultuur op 30 graden Celsius met schudden. Voor microplate groei-curve setup, voeg 145 microliters van een geschikt experimenteel cultureel medium aan elke put van een steriele 10-bij-10 goed microplaat met een deksel en inenting elk goed met vijf microliter van de nachtelijke cultuur. Vervolgens incubeer de multi-well plaat in een microplate lezer op 30 graden Celsius met constante agitatie bij 200 rpm gedurende 48 uur, het meten van de optische dichtheid op 600 nanometer om de 30 of 60 minuten.Voor geschud conische kolf groei-curve setup, inenting 20 milliliter conische kolven met 4,8 milliliter van een geschikte steriele cultuur media met 200 microliters van pre-inoculum cultuur op een 600 nanometer optische dichtheid van twee voor incubatie bij 30 graden Celsius en 250 rpm. Agitatie bij 250 omwentelingen per minuut is van cruciaal belang om een geschikte groei in lage concentraties van koolstofbronnen die ademhalingsgroei uit te oefenen als we hebben waargenomen een verminderde gistgroei in ademhalingsaandoeningen bij lagere agitatie snelheden te bereiken. Om de optische dichtheid gedurende 24 uur elke twee uur meten van de optische dichtheid op 600 nanometer mogelijk te maken, verdunt u 100 microliters van de geschude conische kolfcultuur in 900 microliter gedestilleerd water in een spectrofotometer cuvette van één milliliter en meng voorzichtig door pipet.Voor gegevensverwerking maakt u in een geschikte statistische pakketsoftware een nieuw projectbestand, opent u de nieuwe tabel- en grafiekmenu en selecteert u XY. Selecteer onder het voorbeeldgegevensmenu beginnen met een lege gegevenstabel en een punten- en verbindingsregelgrafiek. Laat de sectie X niet geselecteerd in subcolumns voor replica's of foutwaarden. Selecteer in de sectie Y 10 repliceren waarden in subkoloms naast elkaar en plot gemiddelde en fout-SD. Klik vervolgens op maken.Voer het tijdstip in waarop de OD-metingen zijn verkregen in de kolom X en de OD-waarden die zijn verkregen uit de culturen in de kolom Y. Als u de exponentiële groeifase wilt identificeren die de kolomgegevens van de Y omzet in logaritmen, klikt u op analyseren en selecteren van de transformatieanalyse. Gebruik Y is gelijk aan logboek Y om de Y-waarden te selecteren en de galerij met resultaten te openen.Selecteer de transformatiegegevenstabel, klik op analyseren en selecteer de lineaire regressieanalyse, met uitzondering van de optische dichtheidswaarden die geen lineaire trend volgen door de waarden in de tabel te selecteren en het besturingselement en E.In de tabelgalerie te deprimeren, de gegevens één tabel te selecteren en op analyseren te klikken. Selecteer de niet-lineaire regressiecurve-fit-analyse en de gegevenssets die u wilt analyseren en klik op OK. Pas vervolgens de minste vierkanten toe die passen bij de gegevens, waardoor de interpolatiesectie niet is geselecteerd en klik op OK. Open vervolgens een nieuw projectbestand en selecteer in het nieuwe tabel- en grafiekmenu de kolomkeuze, begin met een lege gegevenstabel en de gewenste grafiek. Stel de grafiek in om het gemiddelde met de standaarddeviatie te plotten en klik op maken.Kopieer de gemiddelde of deltatijdwaarden uit de resultatentabel niet-lineaire passen in de galerie met resultaten en plak de gegevens in een kolom. Klik tot slot op analyseren en selecteer de analyse van de interesse in het menu kolomanalyses om de kinetische parameters van de verschillende nutrimental-voorwaarden te vergelijken. De kinetische groeidrempelwaarden variëren per sterkte en moeten worden geëvalueerd op basis van de voorwaarden die we in de analyse gebruiken.Culturen die een fermentatief fenotype aantonen, hebben een kleine vertragingsfase en een exponentiële fase met een hoge groeisnelheid. Culturen die energie verkrijgen voornamelijk door oxidatieve fosforylatie vertonen een langere vertragingsfase met een langzame groei tijdens de exponentiële fase. Berekening van de specifieke groeisnelheid en verdubbelingstijd van de groeicurven met behulp van de exponentiële groeivergelijking maakt het mogelijk om drempels vast te stellen voor de ademhalings- en fermentatieve groeiwaarden.Bijvoorbeeld, in deze representatieve experimenten, de effecten van verschillende resveratrol concentraties op S.cerevisiae BY4742 cellen onthullen de wijziging van de cel energetische status in reactie op verschillende glucoseconcentraties. Hier, suppletie met 10%glucose toont aan dat lagere concentraties van ammonium gunst fermentatieve metabolisme zoals blijkt uit een uitgebreide exponentiële groeifase in deze culturen, terwijl een hogere concentratie induceert een respiro-fermentatieve metabolisme zoals blijkt uit een uitgebreide vertraging fase en een tragere groei tijdens de exponentiële fase. Ten slotte kunnen robuuste verschillen in fermentatieve verdubbelingstijdwaarden worden waargenomen tussen deze twee verschillende giststammen die onder dezelfde omstandigheden worden geteeld, waarbij de noodzaak wordt benadrukt om de verdubbelingstijddrempel voor elke geanalyseerde stam te valideren.Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat dit protocol alleen wordt gebruikt om fenotype screenen. De specifieke effecten op de ademhaling en fermentatie moeten worden bevestigd door respectievelijk de tests van het zuurstofverbruik of door de accumulatie van fermentatiebijproducten.

Research

JoVE Journal

Biology

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissectie van Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Kwantitatieve Phosphoproteomics in Fatty Acid Gestimuleerd Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

De combinatie van magnetische sorteren van Moeder Cellen en Schommelingen Tests om Genome Instabiliteit Tijdens mitose Aging in Analyze<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...