Name: saccharomyces cerevisiae exponential growth kinetics in batch culture to analyze respiratory and fermentative metabolism
Uploaded: 2018-09-30T14:00:00
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Dieses Projekt wurde unterstützt durch Zuschüsse des Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Grant-Nummer 293940) und Fundación TELMEX-TELCEL (Grant-Nummer 162005585), beide IKOM.

(1) Kultur, Medien und Inokulum Vorbereitung
<ol><li>100 mL 2 % Hefe-Extrakt-Pepton-Traubenzucker (YPD) flüssigen Medium vorbereiten (1 g Hefe-Extrakt, Kasein Pepton, 2 g und 2 g Glucose in 100 mL destilliertem Wasser hinzufügen). 3 mL der Medien in 15 mL sterilisierbare konische Rohre zu verzichten. Autoklaven der Medien für 15 min bei 121 ° C und 1,5 Psi. Hinweis: Der Datenträger kann bis zu einem Monat bei 4 – 8 ° c aufbewahrt werden</li>
	<li>Impfen Sie eine konische Rohr gefüllt mit 3 mL cool steril 2 ...

<ol>
	<li>Parrella, E., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+to+study+mitochondrial+dysfunction+and+disease.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease.</a> Methods. 46 (4), 256-262 (2008).</li><li>Rosas Lemus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycolysis-derived+hexose+phosphates+in+the+induction+of+the+Crabtree+effect.">The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2018).</li><li>Xu, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warburg+effect+or+reverse+Warburg+effect?+A+review+of+cancer+metabolism.">Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism.</a> Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).</li><li>De Deken, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crabtree+effect:+a+regulatory+system+in+yeast.">The Crabtree effect: a regulatory system in yeast.</a> Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).</li><li>Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+yeast+short-term+Crabtree+effect+and+its+origin.">Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin.</a> The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).</li><li>Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crabtree+and+Warburg+effects:+Do+metabolite-induced+regulations+participate+in+their+induction?.">The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction?.</a> Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).</li><li>Keating, E., Martel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimetabolic+Effects+of+Polyphenols+in+Breast+Cancer+Cells:+Focus+on+Glucose+Uptake+and+Metabolism.">Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).</li><li>Pfeiffer, T., Morley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionary+perspective+on+the+Crabtree+effect.">An evolutionary perspective on the Crabtree effect.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).</li><li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li><li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+bacterial+cultures.">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).</li><li>Cui, S., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mathematical+models+for+the+growth+of+tumors+with+time+delays+in+cell+proliferation.">Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation.</a> Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).</li><li>Benzekry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+mathematical+models+for+description+and+prediction+of+experimental+tumor+growth.">Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth.</a> Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).</li><li>Ramos-Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+induces+mitochondrial+dysfunction+and+decreases+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+a+glucose-dependent+manner.">Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).</li><li>Madrigal-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy-dependent+effects+of+resveratrol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).</li><li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+curves:+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot.">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).</li></ol>

Eine lange Zeit ist vergangen, seit J. Monod10 zum Ausdruck gebracht, dass die Untersuchung des Wachstums von Bakterienkulturen die grundlegende Methode der Mikrobiologie. Das Aufkommen der Molekulare Werkzeuge verzögert die Nutzung und das Studium des Wachstums als eine Technik. Trotz der Komplexität des Wachstums die zahlreichen miteinander verbundenen Prozesse umfasst, können die zugrunde liegenden Mechanismen mithilfe mathematischer Modelle11beschrieben werden. Dies ...

Saccharomyces Cerevisiae Wachstum diente als ein wertvolles Werkzeug, Dutzende von physiologischen und molekularen Mechanismen zu identifizieren. Wachstum wird hauptsächlich durch drei Methoden gemessen: Verdünnungsreihen für Stichproben, koloniebildenden Stückzählen und Wachstumskurven. Diese Techniken können allein oder in Kombination mit einer Vielzahl von Substraten, Umweltbedingungen, Mutanten und Chemikalien verwendet werden, um konkrete Antworten oder Phänotypen zu untersuchen.
Mitochondriale Atmung ist ein biologischer Prozess, in dem Wachstum Kinetik erfolgreich angewendet wurde für die Entdeckung unbekannter Mechanismen. In diesem Fall die Supplementierung von Wachstumsmedien mit nicht vergärbaren Carbon Quellen wie z. B. Glycerin, Lactat oder Ethanol (die ausschließlich durch die mitochondriale Atmung metabolisiert werden), denn die einzige Quelle für Kohlenstoff und Energie ermöglicht eine Bewertung der Atemwege Wachstum, das ist wichtig, um Störungen in Oxidative Phosphorylierung Aktivität1zu erkennen. Auf der anderen Seite ist es kompliziert, kinetische Wachstumsmodelle als eine Methode für die Entschlüsselung der Mechanismen hinter Gärung zu verwenden.
Das Studium der Gärung und die mitochondriale Atmung ist wichtig, die molekularen Mechanismen hinter bestimmten Phänotypen wie der Crabtree und Warburg Effekte2,3aufzuklären. Die Crabtree-Effekt zeichnet sich durch eine Steigerung der glykolytischen Flussmittel, Unterdrückung der mitochondrialen Atmung und Einrichtung der Gärung als der primäre Weg zum ATP in Gegenwart von hohen Konzentrationen von vergärbare Kohlenhydrate generieren (> 0,8 mM)4,5. Die Warburg-Effekt ist metabolisch analog zu der Crabtree-Effekt, mit dem Unterschied, dass in Säugerzellen, das Hauptprodukt der Gärung Laktat6ist. In der Tat ist der Warburg-Effekt durch eine Vielzahl von Krebszellen auslösen Glukoseaufnahme und Verbrauch auch in Gegenwart von Sauerstoff7ausgestellt. Dabei hat untersuchen die Molekulare Grundlagen der die Umstellung von Atmung auf Gärung in der Crabtree-Effekt biotechnologische folgen (für Ethanol-Produktion) und mögliche Auswirkungen in der Krebsforschung.
S. Cerevisiae Wachstum möglicherweise ein geeignetes Instrument zur Untersuchung der Auswirkungen von Crabtree und Warburg. Diese Idee ist, dass in der Hefe exponentielle Phase, die zentrale Wege verwendet, um ATP zu produzieren sind mitochondriale Atmung und Gärung, die wesentlich für nachhaltiges Wachstum. Zum Beispiel ist das Wachstum von S. Cerevisiae die Funktion der ATP-Erzeugung Bahnen eng verwandt. In S. Cerevisiae, die mitochondriale Atmung produziert ca. 18 ATP-Moleküle pro Glucose-Molekül während der Gärung nur 2 ATP-Moleküle erzeugt wird daher erwartet, dass die Wachstumsrate enge Verbindungen mit der Stoffwechselwege hat Herstellung von ATP8. In diesem Zusammenhang bei der Gärung ist der Hauptweg, ATP zu generieren, kompensiert die Hefe die geringe ATP-Produktion durch Erhöhung der Glukoseaufnahme. Im Gegenteil, ist der Glukose-Verbrauch von Hefezellen, die mitochondriale Atmung als die Hauptquelle der ATP zu verwenden gering. Dies bedeutet, dass es wichtig für die Hefe zu Sinn Kohlenhydrat Verfügbarkeit vor der Entscheidung, wie ATP generiert wird. Daher Glukose Verfügbarkeit spielt eine wichtige Rolle in der Wechsel zwischen Gärung und die mitochondriale Atmung in S. Cerevisiae. In Anwesenheit von hohen Mengen an Glukose bevorzugt die Hefe Gärung als die zentrale Route um ATP zu erzeugen. Interessant ist, wenn die Hefe Gärung ist, bleibt der spezifischen Wachstumsrate maximal. Auf der anderen Seite unter den niedrigen Niveaus von Glukose produziert S. Cerevisiae ATP mitochondriale Atmung mit geringere Wachstumsraten beibehalten. Dabei Unterschiede in der Konzentration von Glukose und die Verwendung von anderen Kohlenstoffquellen induzieren Veränderungen in der Hefe Präferenz zwischen fermentative und Atemwege Wachstum. Unter Berücksichtigung dieser Tatsache mit der exponentiellen Wachstums-Gleichung kann man die biologische Bedeutung der kinetischen Parameter wie die Verdoppelung der Zeit (Dt) und spezifischen Wachstumsrate (µ) erhalten. Zum Beispiel wurden niedrigere µ -Werte gefunden, wenn die Hefe mitochondriale Atmung als primäre Pfad verwendet. Im Gegenteil, fanden sich unter Bedingungen, die Gärung zu begünstigen, höhere µ -Werte. Diese Methode kann verwendet werden, um die wahrscheinlichen Mechanismen von Chemikalien die Gärung und mitochondriale Atmung in Messen S. Cerevisiae.
Das Ziel dieses Papiers ist es, eine Methode basierend auf Wachstum Kinetik für das screening der Auswirkungen einer bestimmten Substanz/Verbindung auf mitochondriale Atmung oder Gärung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4353</td>
			<td style="width:167px;">For inoculum incubation or conical fask cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bioscreen&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Growth curves</td>
			<td style="width:119px;">C MBR</td>
			<td>For batch cultures in microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Peptone from casein, enzymatic digest</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">82303</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">09182-1KG-F</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacteriological Agar</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td>For YPD agar preparation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>S8282</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(NH4)2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A4418</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Y1251</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yeast synthetic drop-Out medium supplements</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Y1501</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium sulfate granular</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">0792-R</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resveratrol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">R5010</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S7903</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Absolut ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Merck</td>
			<td align="right">107017</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td>2136-01</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Honeycomb microplates</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">9502550</td>
			<td>For microplate cultures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saccharomyces cerevisiae exponential growth kinetics in batch culture to analyze respiratory and fermentative metabolism

Saccharomyces Cerevisiae Zellen in der exponentiellen Phase unterstützen ihr Wachstum durch die Produktion von ATP durch Gärung und/oder mitochondriale Atmung. Der vergärbaren Kohlenstoffgehalt regelt vor allem, wie die Hefezellen ATP erzeugen; so treibt die Variation in vergärbare Kohlenhydrate Ebenen den Energiestoffwechsel von S. Cerevisiae. Dieses Whitepaper beschreibt eine Hochdurchsatz-Methode basiert auf exponentielle Hefe Wachstum, die Auswirkungen von Änderungen der Konzentration und Art der Kohlenstoffquelle auf Atemwege und fermentativen Stoffwechsel zu schätzen. Das Wachstum von S. Cerevisiae ist in einer Mikrotestplatte gemessen oder geschüttelt konischen Kolben durch die Bestimmung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm. Dann baut eine Wachstumskurve durch Plotten OD im Vergleich zur Zeit, was ermöglicht die Erkennung und Auswahl der exponentiellen Phase und ist ausgestattet mit der exponentiellen Wachstums-Gleichung, kinetische Parameter zu erhalten. Geringen spezifischen Wachstumsraten mit höheren Verdoppelung Zeit repräsentieren in der Regel eine respiratorische Wachstum. Im Gegensatz dazu zeigen höhere spezifische Wachstumsraten mit niedrigeren Verdoppelung Mal fermentative Wachstum. Grenzwerte der Verdoppelung der Zeit und spezifischen Wachstumsrate sind anhand der bekannteste Atem- oder fermentative Bedingungen wie nicht vergärbaren Kohlenstoffquellen oder höhere Konzentrationen an vergärbaren Zucker geschätzt. Dies ist für jede spezifische Belastung erreicht. Schließlich sind die berechneten kinetischen Parameter gegenüber der Schwellenwerte um festzustellen, ob die Hefe fermentative und/oder Atemwege Wachstum zeigt. Der Vorteil dieser Methode ist die relative Einfachheit für das Verständnis der Auswirkungen einer Substanz/Verbindung auf fermentative oder respiratorischen Stoffwechsel. Es ist wichtig, hervorzuheben, dass das Wachstum eines komplizierten und komplexen biologischen Verfahrens; vorläufige Daten aus dieser Methode müssen daher durch die Quantifizierung der Sauerstoffverbrauch und Akkumulation von Gärreste erhärtet werden. Dabei kann diese Technik als eine Vorauswahl von Verbindungen/Substanzen verwendet werden, die möglicherweise stören oder fermentativer oder respiratorischen Stoffwechsel.

Wachstumskurven lässt sich vorläufig zwischen Atem- und fermentative Phänotypen in der Hefe S. Cerevisiae zu unterscheiden. Daher führten wir Batch Kulturen von S. Cerevisiae (BY4742) mit verschiedenen Glukosekonzentration, die fermentative Wachstum induzieren gemeldet wurden: 1 %, 2 % und 10 % (w/V)9. Zeigt einen fermentativen Phänotyp Kulturen haben eine kleine Verzögerung und eine exponentielle Phase mit einer hohen Wachstumsrate (<strong...

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Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae Exponentielles Wachstum Kinetik in Batch-Kultur, Atem- und fermentativen Stoffwechsel analysieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Atemwege und fermentativen Stoffwechsel durch den Einbau des exponentiellen Wachstums von Saccharomyces Cerevisiae exponentielles Wachstum Gleichung zu schätzen. Berechnung der kinetischen Parameter kann für das Screening der Einflüsse der Stoffe/Verbindungen auf Gärung oder mitochondriale Atmung.

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im biotechnologischen und biomedizinischen Bereich zu beantworten, wie z. B. was die molekulare Basis hinter den Warburg- und Crabtree-Effekten ist. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Studie mit hohem Durchsatz der Auswirkungen bestimmter Substanzen im Atem- und Fermentationsstoffwechsel ermöglicht. Beginnen Sie mit der Impfung einer 15-Milliliter-Konustube mit drei Millilitern kühlem, sterilem 2%Hefeextrakt Peptondextrose oder YPD-Brühe, mit 250 Mikrolitern S.cerevisiae Hefezellen, die in Glycerin bei negativen 20 Grad Celsius konserviert werden.Inkubieren Sie die Hefe über Nacht in einem Orbital-Shaker bei 30 Grad Celsius und 200 Umdrehungen/Min.. zum Aufstreifen auf eine 60-Milliliter-, 2%YPD-Agar-gefüllte Petrischale am nächsten Morgen. Kultur das Gericht bei 30 Grad Celsius, bis isolierte Kolonien beobachtet werden.Dann impfen Sie eine einzelne isolierte Kolonie in einer neuen konischen Röhre, die 10 Milliliter kühle, sterile 2%YPD-Brühe für DieNachtkultur bei 30 Grad Celsius mit Schütteln enthält. Für den Aufbau der Mikroplatte Wachstumskurve, fügen Sie 145 Mikroliter eines geeigneten experimentellen kulturellen Mediums zu jedem Brunnen einer sterilen 10-mal-10 Well-Mikroplatte mit deckel und impfen sie jeden Brunnen mit fünf Mikrolitern der Nachtkultur. Dann inkubieren Sie die Multi-Well-Platte in einem Mikroplattenleser bei 30 Grad Celsius mit konstanter Rührung bei 200 Umdrehungen pro Minute für 48 Stunden, wobei die optische Dichte bei 600 Nanometern alle 30 oder 60 Minuten gemessen wird.Für geschüttelte Konzentrat-Wachstumskurven-Setup, impfen 20 Milliliter konische Kolben mit 4,8 Milliliter neines geeigneten sterilen Kulturmediummit 200 Mikroliter Vor-Inokulum-Kultur bei einer 600 Nanometer optischen Dichte von zwei für die Inkubation bei 30 Grad Celsius und 250 U/min. Agitation bei 250 Umdrehungen pro Minute ist entscheidend, um ein geeignetes Wachstum in niedrigen Konzentrationen von Kohlenstoffquellen zu erreichen, die Atemwachstum ausüben, da wir ein reduziertes Hefewachstum bei Atemwegserkrankungen bei niedrigeren Rührgeschwindigkeiten beobachtet haben. Um die Messung der optischen Dichte bei 600 Nanometern alle zwei Stunden für 24 Stunden zu ermöglichen, 100 Mikroliter der geschüttelten konischen Kolbenkultur in 900 Mikroliter destilliertem Wasser in einer Ein-Milliliter-Spektralphotometer-Küvette verdünnen und sanft per Pipette mischen.Erstellen Sie für die Datenverarbeitung in einer geeigneten statistischen Paketsoftware eine neue Projektdatei, öffnen Sie das neue Tabellen- und Diagrammmenü, und wählen Sie XY aus. Wählen Sie im Beispieldatenmenü Start mit einer leeren Datentabelle und einem Punkt und Verbindungsliniendiagramm aus. Lassen Sie den X-Abschnitt in Unterspalten für Replikationen oder Fehlerwerte deaktiviert. Wählen Sie im Y-Abschnitt 10 Replikationswerte in nebeneinander-unterspalten und Plotmittelwert und Fehler-SD aus. Klicken Sie dann auf Erstellen.Geben Sie den Zeitpunkt ein, zu dem die OD-Messungen in der X-Spalte erhalten wurden, und die OD-Werte, die aus den Kulturen in der Y-Spalte ermittelt wurden. Um die exponentielle Wachstumsphase zu identifizieren, in der die Y-Spaltendaten in Logarithmen umgewandelt werden, klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie die Transformationsanalyse aus. Verwenden Sie Y gleich Log Y, um die Y-Werte auszuwählen und den Ergebniskatalog zu öffnen.Wählen Sie die Tabelle "Transformationsdaten", klicken Sie auf Analysieren, und wählen Sie die lineare Regressionsanalyse aus, ohne die optischen Dichtewerte, die keinem linearen Trend folgen, indem Sie die Werte in der Tabelle auswählen und das Steuerelement deprimieren und den Katalog für Datentabellen E.In, die Daten in einer Tabelle auswählen und auf Analysieren klicken. Wählen Sie die Analyse der nichtlinearen Regressionskurve und die zu analysierenden Datensätze aus, und klicken Sie auf OK. Wenden Sie dann die kleinsten Quadrate an, die auf die Daten passen, sodass der Interpolationsabschnitt deaktiviert bleibt, und klicken Sie auf OK. Öffnen Sie anschließend eine neue Projektdatei, und wählen Sie im neuen Tabellen- und Diagrammmenü die Spaltenauswahl aus, beginnen Sie mit einer leeren Datentabelle und dem gewünschten Diagramm. Legen Sie das Diagramm so fest, dass der Mittelwert mit der Standardabweichung dargestellt wird, und klicken Sie auf Erstellen.Kopieren Sie die mittleren oder Deltazeitwerte aus der Tabelle der nichtlinearen Anpassungsergebnisse im Ergebniskatalog, und fügen Sie die Daten in eine Spalte ein. Klicken Sie schließlich auf Analysieren und wählen Sie die Analyse des Interesses im Menü "Spaltenanalysen" aus, um die kinetischen Parameter der verschiedenen nertrimentalen Bedingungen zu vergleichen. Die wachstumskinetischen Schwellenwerte variieren zwischen den Stärken und müssen entsprechend den Bedingungen bewertet werden, die wir in der Analyse verwenden.Kulturen, die einen fermentativen Phänotyp zeigen, haben eine kleine Verzögerungsphase und eine exponentielle Phase mit einer hohen Wachstumsrate. Kulturen, die Energie hauptsächlich durch oxidative Phosphorylierung erhalten, weisen eine längere Verzögerungsphase mit einer langsamen Wachstumsrate während der exponentiellen Phase auf. Die Berechnung der spezifischen Wachstumsrate und die Verdoppelungder Zeit der Wachstumskurven unter Verwendung der exponentiellen Wachstumsgleichung ermöglicht die Festlegung von Schwellenwerten für die atmungseren und fermentativen Wachstumswerte.Zum Beispiel, in diesen repräsentativen Experimenten, die Auswirkungen der verschiedenen Resveratrol Konzentrationen auf S.cerevisiae BY4742 Zellen zeigen die Veränderung der Zelle energetischen Status als Reaktion auf unterschiedliche Glukosekonzentrationen. Hier zeigt die Supplementierung mit 10%glukose, dass niedrigere Ammoniumkonzentrationen den fermentativen Stoffwechsel begünstigen, wie eine ausgedehnte exponentielle Wachstumsphase in diesen Kulturen zeigt, während eine höhere Konzentration einen respiro-fermentativen Stoffwechsel induziert, wie eine verlängerte Verzögerungsphase und eine langsamere Wachstumsrate während der exponentiellen Phase belegen. Schließlich können robuste Unterschiede bei den fermentativen Verdoppelungszeitwerten zwischen diesen beiden verschiedenen Hefestämmen beobachtet werden, die unter den gleichen Bedingungen angebaut werden, was die Notwendigkeit der Validierung des Verdoppelungszeitschwellenwerts für jeden analysierten Stamm unterstreicht.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass dieses Protokoll nur zum Abschirmen von Phänotyp verwendet wird. Die spezifischen Auswirkungen auf die Atmung und Fermentation müssen durch Sauerstoffverbrauchstests bzw. durch die Ansammlung von Fermentationsnebenprodukten bestätigt werden.

Research

JoVE Journal

Biology

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Forschung

Biologie

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

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This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

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Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

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Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

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Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

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Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

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Die Kombination von Magnet Sortierung der Mutterzellen und Fluktuation Tests zu Genominstabilität Während mitotischen Zellalterung in Analysieren<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Entwicklung Methode Regie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...