Name: saccharomyces cerevisiae exponential growth kinetics in batch culture to analyze respiratory and fermentative metabolism
Uploaded: 2018-09-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism at JoVE.com

פרויקט זה נתמך על ידי מענקים של Consejo נאסיונאל דה Ciencia y Tecnología (מענק מס ' 293940) ושל Fundación TELMEX-TELCEL (גרנט מספר 162005585), שניהם IKOM.

1. תרבות המדיה והכנות Inoculum
<ol><li>להכין 100 מ של 2% תמצית-peptone-dextrose (YPD) שמרים בינוני נוזלי (להוסיף תמצית 1 גר' שמרים, 2 גר' קזאין peptone, ו- 2 גר' גלוקוז ל 100 מ של מים מזוקקים). לוותר על 3 מ"ל של המדיה לתוך צינורות חרוט sterilizable 15 mL. אוטוקלב התקשורת למשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס ו 1.5 psi. הערה: המדיה ניתן לאחסן עד ?...

<ol>
	<li>Parrella, E., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+to+study+mitochondrial+dysfunction+and+disease.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease.</a> Methods. 46 (4), 256-262 (2008).</li><li>Rosas Lemus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycolysis-derived+hexose+phosphates+in+the+induction+of+the+Crabtree+effect.">The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2018).</li><li>Xu, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warburg+effect+or+reverse+Warburg+effect?+A+review+of+cancer+metabolism.">Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism.</a> Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).</li><li>De Deken, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crabtree+effect:+a+regulatory+system+in+yeast.">The Crabtree effect: a regulatory system in yeast.</a> Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).</li><li>Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+yeast+short-term+Crabtree+effect+and+its+origin.">Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin.</a> The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).</li><li>Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crabtree+and+Warburg+effects:+Do+metabolite-induced+regulations+participate+in+their+induction?.">The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction?.</a> Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).</li><li>Keating, E., Martel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimetabolic+Effects+of+Polyphenols+in+Breast+Cancer+Cells:+Focus+on+Glucose+Uptake+and+Metabolism.">Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).</li><li>Pfeiffer, T., Morley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionary+perspective+on+the+Crabtree+effect.">An evolutionary perspective on the Crabtree effect.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).</li><li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li><li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+bacterial+cultures.">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).</li><li>Cui, S., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mathematical+models+for+the+growth+of+tumors+with+time+delays+in+cell+proliferation.">Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation.</a> Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).</li><li>Benzekry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+mathematical+models+for+description+and+prediction+of+experimental+tumor+growth.">Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth.</a> Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).</li><li>Ramos-Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+induces+mitochondrial+dysfunction+and+decreases+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+a+glucose-dependent+manner.">Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).</li><li>Madrigal-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy-dependent+effects+of+resveratrol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).</li><li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+curves:+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot.">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).</li></ol>

זמן רב עבר מאז ומונו ג'10 הביעו כי המחקר של הצמיחה של חיידקים תרבויות היא השיטה הבסיסית של מיקרוביולוגיה. כניסתו של הכלים מולקולרית מעכב את השימוש והלימוד של הגידול כמו טכניקה. למרות המורכבות של צמיחה אשר מערבת תהליכים לתקצב רבים, מנגנוני הבסיסית שלה יכולה להיות מתוארת באמצעות...

שמר האפייה צמיחה שימש כלי חשוב כדי לזהות עשרות מנגנונים פיזיולוגיים ומולקולרית. צמיחה נמדד בעיקר על ידי שלוש שיטות: טורי דילולים בדיקות ספוט, המושבה יוצרי יחידת ספירה של עקומות גדילה. שיטות אלה ניתן להשתמש לבד או בשילוב עם מגוון רחב של סובסטרטים, תנאים סביבתיים, מוטציות, כימיקלים לחקור תגובות ספציפיות או פנוטיפים.
נשימה מיטוכונדריאלי היא תהליך ביולוגי שבו קינטיקה גידול יושם בהצלחה על גילוי מנגנוני לא ידוע. במקרה זה, תוספת של צמיחה מדיה עם פחמן בהתססה של מקורות כגון גליצרול, לקטאט או אתנול (אשר הם מטבוליזם באופן בלעדי על ידי נשימה מיטוכונדריאלי), כמו המקור פחמן ואנרגיה הבלעדי מאפשר להעריך הצמיחה בדרכי הנשימה, וזה חשוב. לזהות לפליטת זרחון חמצוני פעילות1. מצד שני, זה מסובך להשתמש גידול קינטית מודלים כשיטה עבור פיענוח המנגנון מאחורי תסיסה.
המחקר של תסיסה ונשימה מיטוכונדריאלי חיונית כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים מאחורי פנוטיפים מסוימים כגון קרבטרי, ורבורג אפקטים2,3. האפקט קרבטרי מאופיין על ידי גידול של שטף glycolytic, דיכוי של הנשימה מיטוכונדריאלי, ואת הקמתה של תסיסה כנתיב העיקרי ליצירת ATP בנוכחות ריכוזים גבוהים של בהתססה של פחמימות (> 4,0.8 מ מ)5. ורבורג הוא אנלוגי סמויה על אפקט קרבטרי, כאשר ההבדל בכך בתרבית של תאים, המוצר העיקרי של תסיסה הוא לקטט6. אכן, ורבורג מוצגת על ידי מגוון של תאים סרטניים, מפעילה ספיגת הגלוקוז וצריכת אפילו בנוכחות חמצן7. ובכך, ללמוד את הבסיס המולקולרי של המתג של נשימה כדי תסיסה האפקט קרבטרי יש גם השלכות ביוטכנולוגי (לייצור אתנול) וגם השפעות אפשריות בחקר הסרטן.
Cerevisiae ס הצמיחה עשויה להיות כלי מתאים כדי לחקור את ההשפעות קרבטרי, ורבורג. הרעיון זה מבוסס על העובדה כי בשלב מעריכי שמרים, משעולים המרכזי שימוש להפקת ATP הם נשימה מיטוכונדריאלי, תסיסה, המהווה מרכיב חיוני כדי לקיים את הצמיחה. למשל, הצמיחה של cerevisiae בצורה אינטימית קשורה הפונקציה של מסלולים ליצירת ATP. במולקולות cerevisiae ס, מ- ATP מייצרת כ 18 מיטוכונדריאלי נשימה לכל מולקולת גלוקוז, ואילו תסיסה יחולל רק 2 מולקולות ATP, ומכאן הוא צפוי כי קצב הגידול יש קישורים הדוקים עם משעולים חילוף החומרים הפקת ATP8. בהקשר זה, כאשר המסלול העיקרי ליצירת ATP תסיסה, השמרים מפצה על ייצור ATP נמוכה על-ידי הגברת קצב ספיגת הגלוקוז. להפך, צריכת הסוכר על ידי תאי שמרים להשתמש נשימה מיטוכונדריאלי כמקור ATP העיקרי הוא נמוך. אפשרות זו מציינת כי חשוב עבור השמרים ל הגיוני פחמימות זמינות לפני קביעת איך ייווצר ATP. לכן, זמינות גלוקוז ממלא תפקיד חשוב ב הבורר בין תסיסה ונשימה מיטוכונדריאלי ב cerevisiae ס. בנוכחות כמויות גבוהות של גלוקוז, מעדיף השמרים תסיסה כמו הנתיב המרכזי ליצירת ATP. מעניין, השמרים הוא החימוץ, קצב הגידול הספציפי נשמר מקסימום שלה. מצד שני, תחת רמות נמוכות של גלוקוז, cerevisiae ס מייצרת ATP באמצעות נשימה מיטוכונדריאלי, שמירה על שיעורי הצמיחה נמוכה. ובכך, וריאציה בריכוז של גלוקוז ושימוש של מקורות פחמן אחרים לגרום שינויים בהעדפות של השמרים בין צמיחה fermentative, מערכת הנשימה. מאת לוקח בחשבון את העובדה הזו עם המשוואה גידול אקספוננציאלי, הוא יכול להשיג את המשמעות הביולוגית של קינטי פרמטרים כגון הכפלת זמן (Dt) ושיעור צמיחה ספציפיים (ממוצע). לדוגמה, ערכים נמוכים יותר ממוצע נמצאו כאשר השמרים משתמש נשימה מיטוכונדריאלי כנתיב העיקרי. להפך, בתנאים טובה תסיסה, נמצאו ערכים ממוצע גבוהים יותר. מתודולוגיה זו עשוי לשמש כדי למדוד את המנגנונים סביר של כל כימיקלים המשפיעים על תסיסה ונשימה מיטוכונדריאלי ב cerevisiae ס.
מטרת מאמר זה היא להציע שיטה המבוססת על צמיחה קינטיקה לסינון את ההשפעות של תרכובת/חומר נתון על נשימה מיטוכונדריאלי או תסיסה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4353</td>
			<td style="width:167px;">For inoculum incubation or conical fask cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bioscreen&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Growth curves</td>
			<td style="width:119px;">C MBR</td>
			<td>For batch cultures in microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Peptone from casein, enzymatic digest</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">82303</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">09182-1KG-F</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacteriological Agar</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td>For YPD agar preparation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>S8282</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(NH4)2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A4418</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Y1251</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yeast synthetic drop-Out medium supplements</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Y1501</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium sulfate granular</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">0792-R</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resveratrol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">R5010</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S7903</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Absolut ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Merck</td>
			<td align="right">107017</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td>2136-01</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Honeycomb microplates</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">9502550</td>
			<td>For microplate cultures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saccharomyces cerevisiae exponential growth kinetics in batch culture to analyze respiratory and fermentative metabolism

שמר האפייה תאים בשלב מעריכי לקיים את הצמיחה שלהם על-ידי הפקת ATP באמצעות תסיסה ו/או מיטוכונדריאלי נשימה. ריכוז פחמן בהתססה של מושל בעיקר איך תאי השמרים מייצרים ATP; לפיכך, הוריאציה ברמות פחמימות בהתססה של כוננים חילוף החומרים האנרגטי של cerevisiae ס. מאמר זה מתאר שיטה תפוקה גבוהה המבוססת על צמיחת שמרים מעריכי כדי להעריך את ההשפעות של שינויי ריכוז והטבע של מקור פחמן על חילוף החומרים הנשימה ואת fermentative. הצמיחה של cerevisiae נמדד microplate או מנוער חרוט הבקבוק על-ידי קביעת הצפיפות האופטית (OD)-600 ננומטר. לאחר מכן, עקומת גדילה זה נבנה על ידי OD ההתוויה נגד הזמן, אשר מאפשרת זיהוי ובחירה של שלב מעריכית, והוא מצויד עם המשוואה הגידול האקספוננציאלי לקבל פרמטרים קינטי. שיעורי צמיחה ספציפיים נמוך עם גבוה יותר פעמים ההכפלה בדרך כלל מייצגים גידול בדרכי הנשימה. לעומת זאת, שיעור צמיחה ספציפיים גבוה עם התחתון פעמים ההכפלה מצביעים על צמיחה fermentative. ערכי הסף של הכפלת זמן ושיעור צמיחה ספציפיים מוערך באמצעות מחלות בדרכי הנשימה או fermentative ידועים, כמו פחמן בהתססה של מקורות או ריכוז גבוה של סוכרים בהתססה. זה מתקבל עבור כל זן ספציפי. לבסוף, הפרמטרים קינטי מחושב מושווים עם ערכי סף כדי לקבוע אם השמרים מציגה צמיחה fermentative ו/או בדרכי הנשימה. היתרון של שיטה זו הוא הפשטות היחסית להבנת השפעת תרכובת/חומר על חילוף החומרים fermentative או בדרכי הנשימה. חשוב להדגיש כי הצמיחה היא תהליך ביולוגי מסובכים ומורכבים; לכן, המידע הראשוני של שיטה זו חייבת להיות שחלקית כימות של צריכת החמצן והצטברות תוצרי לוואי תסיסה. ובכך, טכניקה זו יכולה לשמש הקרנה ראשוני של תרכובות/חומרים אשר עשויים להפריע או לשפר את חילוף החומרים fermentative או בדרכי הנשימה.

עקומות גדילה יכול לשמש preliminarily להפלות בין פנוטיפים הנשימה ו fermentative ב ס cerevisiae השמרים. לכן, ביצענו תרבויות אצווה של cerevisiae ס (BY4742) עם ריכוזי גלוקוז שונים דווח כי כדי לגרום לצמיחה fermentative: 1%, 2% ו- 10% (w/v)9. תרבויות מציג הפנוטיפ fermentative שלב פיגור קטן ויש שלב מערי...

Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism at JoVE.com

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

שמר האפייה קינטיקה גידול אקספוננציאלי בתרבות אצווה כדי לנתח את חילוף החומרים הנשימה ואת Fermentative

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את חילוף החומרים בדרכי הנשימה, fermentative על-ידי התאמת הגידול האקספוננציאלי של האפייה למשוואה צמיחה אקספוננציאלית. חישוב הפרמטרים קינטי מאפשר להקרנה של השפעות של חומרים/תרכובות תסיסה או מיטוכונדריאלי נשימה.

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים ביוטכנולוגיים וביו-רפואיים כגון מה הם הבסיס המולקולרי מאחורי השפעות ורבורג ו Crabtree. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מחקר תפוקה גבוהה של ההשפעות של חומרים מסוימים בחילוף החומרים הנשימה והתסיסה. התחל על ידי חיסון צינור חרוט 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של קריר, סטרילי 2%שמרים לחלץ דקסטרוז פפטונה, או מרק YPD, עם 250 microliters של תאי שמרים S.cerevisiae השתמרו גליצרול ב 20 מעלות צלזיוס שלילי.הדגירה את השמרים לילה בשייקר מסלולית ב 30 מעלות צלזיוס ו 200 סל"ד. לפסים על צלחת פטרי 60 מיליליטר, 2%YPD מלא אגר למחרת בבוקר. תרבות המנה ב 30 מעלות צלזיוס עד מושבות מבודדות נצפו.ואז לחסן מושבה מבודדת אחת בצינור חרוט חדש המכיל 10 מיליליטר של מרק קריר, סטרילי 2% YPD לתרבות הלילה ב 30 מעלות צלזיוס עם רעידות. להגדרת עקומת צמיחת מיקרופלאט, הוסיפו 145 מיקרוליטרים של מדיום תרבותי ניסיוני מתאים לכל באר של מיקרופלאט סטרילי של 10 על 10 היטב עם מכסה וחסן כל באר עם חמישה מיקרוליטרים של תרבות הלילה. ואז להדק את הצלחת רב היטב בקורא מיקרופלסטיק ב 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה מתמדת ב 200 סל"ד במשך 48 שעות, מדידת הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר כל 30 או 60 דקות.עבור הגדרת עקומת צמיחה של בקבוק חרוט מזועזע, לחסן 20 בקבוקונים חרוט מיליליטר המכיל 4.8 מיליליטר של מדיה תרבותית סטרילית מתאימה עם 200 microliters של תרבות טרום אינקולום ב 600 ננומטר צפיפות אופטית של שניים עבור דגירה ב 30 מעלות צלזיוס ו 250 סל"ד. תסיסה ב 250 מהפכות לדקה היא קריטית כדי להשיג צמיחה מתאימה ריכוזים נמוכים של מקורות פחמן המפעילים צמיחה נשימתית כפי שראינו צמיחה מופחתת שמרים במצבי נשימה במהירויות תסיסה נמוכות יותר. כדי לאפשר מדידה של הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר כל שעתיים במשך 24 שעות, לדלל 100 microliters של תרבות הבקבוק חרוט מזועזע ב 900 microliters של מים מזוקקים בקובט ספקטרופוטומטר אחד מיליליטר בעדינות לערבב על ידי פיפטה.לעיבוד נתונים, בתוכנת חבילה סטטיסטית מתאימה, צרו קובץ פרוייקט חדש, פתחו את תפריט הטבלה והגרף החדש ובחרו XY. תחת תפריט הנתונים לדוגמה, בחר התחל בטבלת נתונים ריקה ובגרף נקודות וחיבור קו. השאר את מקטע X לא נבחר בקוטומי משנה עבור שכפולים או ערכי שגיאה. במקטע Y, בחר הזן 10 ערכי שכפול בכלובי משנה זה לצד זה וב- SD של ממוצע התוויית נתונים וטעייה. לאחר מכן לחץ על צור.הזן את השעה שבה מדידות OD הושגו בעמודה X ואת ערכי OD שהתקבלו מהתרבויות בעמודה Y. כדי לזהות את שלב הצמיחה המעריכית הממר את נתוני העמודה Y ללוגאריתמים, לחץ על נתח ובחר את ניתוח ההמרה. השתמש ב- Y שווה יומן רישום Y כדי לבחור את ערכי Y ולפתוח את גלריית התוצאות.בחר את טבלת נתוני ההמרה, לחץ על נתח ובחר את ניתוח הרגרסיה הליניארית, למעט ערכי הצפיפות האופטית שאינם תואמים למגמה ליניארית על-ידי בחירת הערכים בטבלה ופקד מדכא ו- E.In גלריית טבלאות הנתונים, בחר את הנתונים בטבלה אחת ולחץ על נתח. בחרו בניתוח התאמה של עקומת רגרסיה לא ליניארית ובערכות הנתונים לניתוח ולחצו על הלחצן 'אשר'. לאחר מכן החל פחות ריבועים על הנתונים, משאיר את מקטע האינטרפולציה לא נבחר, ולחץ על אישור. לאחר מכן, פתח קובץ פרוייקט חדש, ובתפריט הטבלה והגרף החדש, בחר את בחירת העמודה, התחל בטבלת נתונים ריקה ובגרף הרצוי. הגדר את התרשים להתווית הממוצע עם סטיית התקן ולחץ על צור.העתק את ערכי הזמן הממוצע או הדלתא מטבלת תוצאות התאמה לא ליניארית בגלריה של תוצאות והדבק את הנתונים בעמודה. לבסוף, לחץ לנתח ולבחור את הניתוח של עניין בתפריט ניתוח עמודות כדי להשוות את הפרמטרים הקינטיים של התנאים nutrimental שונים. ערכי הסף הקינטיים של הצמיחה משתנים בין נקודות החוזק ויש להעריך אותם בהתאם לתנאים בהם אנו משתמשים בניתוח.תרבויות המדגימים פנוטיפ תסיסה יש שלב השהיה קטן שלב מעריכי עם קצב צמיחה גבוה. תרבויות המשיגות אנרגיה בעיקר על ידי זרחון חמצוני מפגינות שלב השהיה ארוך יותר עם קצב צמיחה איטי במהלך השלב המעריכי. חישוב קצב הגדילה הספציפי והכפלת זמן עקומות הצמיחה באמצעות משוואת הצמיחה המעריכית מאפשרים קביעת סף לערכי הצמיחה הנשימתיים והתסיסתיים.לדוגמה, בניסויים ייצוגיים אלה, ההשפעות של ריכוזי רזברטרול שונים על תאי S.cerevisiae BY4742 חושפות את השינוי במצב האנרגטי של התא בתגובה לריכוזי גלוקוז משתנים. כאן, תוספי עם 10%גלוקוז מדגים כי ריכוזים נמוכים יותר של אמוניום לטובת חילוף החומרים תסיסה כפי שמוכיח שלב צמיחה מעריכי מורחב בתרבויות אלה, בעוד ריכוז גבוה יותר גורם לחילוף חומרים מותסס הפוגה כפי שמוכיח שלב השהיה מורחבת וקצב צמיחה איטי יותר במהלך השלב המעריכי. לבסוף, ניתן לראות הבדלים חזקים בערכי זמן הכפלה מותססים בין שני זני שמרים שונים אלה הגדלים באותם תנאים, המדגישים את הצורך לאמת את סף זמן ההכפלה עבור כל זן שנותח.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי פרוטוקול זה משמש רק כדי לסנן את הפנוטיפ. ההשפעות הספציפיות על הנשימה והתסיסה חייבות להיות מאושרות על ידי מתנאים לצריכת חמצן או על ידי הצטברות של תוצרי לוואי של תסיסה בהתאמה.

Research

JoVE Journal

Biology

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

שילוב מיון מגנטי של תאי אמא ומבחני תנודות לנתח חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...