Name: saccharomyces cerevisiae exponential growth kinetics in batch culture to analyze respiratory and fermentative metabolism
Uploaded: 2018-09-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism at JoVE.com

Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (concessione numero 293940) e Fundación TELMEX-TELCEL (concessione numero 162005585), entrambi a IKOM.

1. terreni di coltura e preparazione dell'inoculo
<ol><li>Preparare 100 mL di terreno liquido 2% lievito estratto-peptone-destrosio (YPD) (aggiungere 1 g di lievito estratto, 2 g di peptone di caseina, e 2 g di glucosio per 100 mL di acqua distillata). Versare 3 mL dei media in provette coniche da 15 mL sterilizzabile. Sterilizzare in autoclave i media per 15 min a 121 ° C e 1,5 psi. Nota: I media possono essere memorizzati fino ad un mese a 4 – 8 ° C.</li>
	<li>Inoculare un tubo conico riempito con 3 mL di brod...

<ol>
	<li>Parrella, E., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+to+study+mitochondrial+dysfunction+and+disease.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease.</a> Methods. 46 (4), 256-262 (2008).</li><li>Rosas Lemus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycolysis-derived+hexose+phosphates+in+the+induction+of+the+Crabtree+effect.">The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2018).</li><li>Xu, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warburg+effect+or+reverse+Warburg+effect?+A+review+of+cancer+metabolism.">Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism.</a> Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).</li><li>De Deken, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crabtree+effect:+a+regulatory+system+in+yeast.">The Crabtree effect: a regulatory system in yeast.</a> Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).</li><li>Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+yeast+short-term+Crabtree+effect+and+its+origin.">Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin.</a> The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).</li><li>Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crabtree+and+Warburg+effects:+Do+metabolite-induced+regulations+participate+in+their+induction?.">The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction?.</a> Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).</li><li>Keating, E., Martel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimetabolic+Effects+of+Polyphenols+in+Breast+Cancer+Cells:+Focus+on+Glucose+Uptake+and+Metabolism.">Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).</li><li>Pfeiffer, T., Morley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionary+perspective+on+the+Crabtree+effect.">An evolutionary perspective on the Crabtree effect.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).</li><li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li><li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+bacterial+cultures.">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).</li><li>Cui, S., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mathematical+models+for+the+growth+of+tumors+with+time+delays+in+cell+proliferation.">Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation.</a> Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).</li><li>Benzekry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+mathematical+models+for+description+and+prediction+of+experimental+tumor+growth.">Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth.</a> Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).</li><li>Ramos-Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+induces+mitochondrial+dysfunction+and+decreases+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+a+glucose-dependent+manner.">Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).</li><li>Madrigal-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy-dependent+effects+of+resveratrol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).</li><li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+curves:+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot.">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).</li></ol>

Molto tempo è passato da quando J. Monod10 espresso che lo studio della crescita delle colture batteriche è il metodo di base di microbiologia. L'avvento degli strumenti molecolari ritarda l'utilizzo e lo studio della crescita come tecnica. Nonostante la complessità della crescita che coinvolge numerosi processi interconnessi, suoi meccanismi di fondo possono essere descritto utilizzando modelli matematici11. Si tratta di un approccio robusto che può essere utilizzato c...

Crescita di Saccharomyces cerevisiae ha servito come uno strumento prezioso per identificare decine di meccanismi fisiologici e molecolari. La crescita è misurata principalmente in tre modi: diluizioni seriali per spot test, unità formanti colonie contando e curve di crescita. Queste tecniche utilizzabile da solo o in combinazione con una varietà di substrati, condizioni ambientali, mutanti e prodotti chimici per esaminare le risposte specifiche o fenotipi.
La respirazione mitocondriale è un processo biologico in cui cinetica di crescita è stato applicato con successo per scoprire i meccanismi sconosciuti. In questo caso, il completamento della crescita media con carbonio non fermentabili fonti quali glicerolo, lattato o etanolo (che sono metabolizzati esclusivamente tramite respirazione mitocondriale), come l'unica fonte di carbonio e di energia permette di valutare la crescita delle vie respiratorie, che è importante per rilevare perturbazioni nella fosforilazione ossidativa attività1. D'altra parte, è complicato da usare modelli di cinetica di crescita come un metodo per decifrare i meccanismi dietro la fermentazione.
Lo studio della fermentazione e respirazione mitocondriale è essenziale per delucidare i meccanismi molecolari dietro alcuni fenotipi come il Crabtree e Warburg effetti2,3. L'effetto Crabtree è caratterizzata da un aumento del flusso glicolitico, repressione di respirazione mitocondriale e l'istituzione di fermentazione come la via primaria per generare ATP in presenza di alte concentrazioni di carboidrati fermentabili (> 0,8 mM)4,5. L'effetto di Warburg è metabolicamente analogico all'effetto Crabtree, con la differenza è che in cellule di mammifero, il prodotto principale della fermentazione è lattato6. Infatti, l'effetto di Warburg è esposto da una varietà di cellule tumorali, innescando l'assorbimento del glucosio e consumo anche in presenza di ossigeno7. Quindi, studiare le basi molecolari dell'interruttore dalla respirazione alla fermentazione nell'effetto Crabtree ha ripercussioni biotecnologiche (per la produzione di etanolo) sia potenziali impatti nella ricerca sul cancro.
S. cerevisiae crescita può essere uno strumento adatto per studiare gli effetti di Crabtree e Warburg. Questa idea è basata sul fatto che nella fase esponenziale di lievito, le vie centrali, utilizzate per produrre ATP sono la respirazione mitocondriale e la fermentazione, che sono essenziali per sostenere la crescita. Per esempio, la crescita di S. cerevisiae è intimamente legata alla funzione delle vie di generazione di ATP. Nelle molecole di S. cerevisiae, la respirazione mitocondriale produce circa 18 ATP per molecola di glucosio, mentre la fermentazione genera solo 2 molecole di ATP, quindi ci si aspetta che il tasso di crescita ha stretti legami con le vie metaboliche la produzione di ATP8. A questo proposito, quando la fermentazione è la via principale per generare ATP, il lievito compensa la bassa produzione di ATP aumentando il tasso di assorbimento del glucosio. Al contrario, il consumo di glucosio dalle cellule di lievito che utilizzano la respirazione mitocondriale come la principale fonte di ATP è basso. Questo indica che è importante per il lievito a disponibilità di carboidrati senso prima di determinare come verrà generato ATP. Pertanto, la disponibilità di glucosio gioca un ruolo importante nello switch tra fermentazione e respirazione mitocondriale in S. cerevisiae. In presenza di elevate quantità di glucosio, il lievito preferisce fermentazione come la via centrale per generare ATP. È interessante notare che, quando il lievito è fermentazione, il tasso di crescita specifico viene mantenuto al suo massimo. D'altra parte, sotto i bassi livelli di glucosio, S. cerevisiae produce ATP utilizzando la respirazione mitocondriale, mantenere tassi di crescita inferiori. Quindi, variazione della concentrazione di glucosio e l'uso di altre fonti di carbonio indurre cambiamenti nella preferenza di lievito tra crescita fermentativa e respiratoria. Prendendo in considerazione questo fatto con l'equazione di crescita esponenziale, uno può ottenere il significato biologico dei parametri cinetici come raddoppiando il tempo (Dt) e tasso di crescita specifico (µ). Ad esempio, i valori di µ più bassi sono stati trovati quando il lievito utilizza la respirazione mitocondriale come la via primaria. Al contrario, in condizioni che favoriscono la fermentazione, i valori più alti di µ sono stati trovati. Questa metodologia può essere usata per misurare i probabili meccanismi di sostanze chimiche che influenzano la fermentazione e la respirazione mitocondriale in S. cerevisiae.
L'obiettivo di questa carta è di proporre un metodo basato sulla cinetica di crescita per gli effetti di un determinata sostanza/composto sulla respirazione mitocondriale o fermentazione di screening.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4353</td>
			<td style="width:167px;">For inoculum incubation or conical fask cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bioscreen&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Growth curves</td>
			<td style="width:119px;">C MBR</td>
			<td>For batch cultures in microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Peptone from casein, enzymatic digest</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">82303</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">09182-1KG-F</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacteriological Agar</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td>For YPD agar preparation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>S8282</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(NH4)2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A4418</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Y1251</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yeast synthetic drop-Out medium supplements</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Y1501</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium sulfate granular</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">0792-R</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resveratrol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">R5010</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S7903</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Absolut ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Merck</td>
			<td align="right">107017</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td>2136-01</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Honeycomb microplates</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">9502550</td>
			<td>For microplate cultures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saccharomyces cerevisiae exponential growth kinetics in batch culture to analyze respiratory and fermentative metabolism

Cellule di Saccharomyces cerevisiae nella fase esponenziale sostengono la loro crescita con la produzione di ATP attraverso la fermentazione e/o respirazione mitocondriale. La concentrazione di carbonio fermentabili governa principalmente come le cellule di lievito generano ATP; così, la variazione nei livelli di carboidrati fermentescibili guida il metabolismo energetico di S. cerevisiae. Questo documento descrive un metodo di alto-rendimento basato su una crescita esponenziale lievito per stimare gli effetti delle variazioni di concentrazione e la natura della fonte di carbonio sul metabolismo fermentativo e respiratorio. La crescita di S. cerevisiae è misurata in una micropiastra o scossa conica boccetta determinando la densità ottica (OD) a 600 nm. Quindi, una curva di crescita è costruita da tracciato OD rispetto al tempo, che permette l'identificazione e la selezione della fase esponenziale ed è dotato con l'equazione di crescita esponenziale per ottenere parametri cinetici. Bassi tassi di crescita specifici con tempi di raddoppiamento superiori rappresentano generalmente una crescita delle vie respiratorie. Al contrario, tassi di crescita specifici superiori con tempi di raddoppiamento inferiori indicano crescita fermentativo. Valori di soglia di raddoppiare il tempo e il tasso di crescita specifico sono stimati utilizzando il ben note condizioni respiratorie o fermentative, come fonti di carbonio non fermentabili o più alte concentrazioni di zuccheri fermentescibili. Questo è ottenuto per ogni ceppo specifico. Infine, i parametri cinetici calcolati vengono confrontati con i valori di soglia per stabilire se il lievito Mostra una crescita fermentativa e/o respiratoria. Il vantaggio di questo metodo è la sua relativa semplicità per la comprensione degli effetti di un sostanza/composto sul metabolismo fermentativo o respiratorio. È importante sottolineare che la crescita è un processo biologico complesso e intricato; Pertanto, i dati preliminari da questo metodo devono essere corroborati dalla quantificazione del consumo di ossigeno e accumulazione dei sottoprodotti della fermentazione. Quindi, questa tecnica può essere utilizzata come uno screening preliminare di composti/sostanze che possono disturbare o migliorare il metabolismo fermentativo o respiratorio.

Curve di crescita possono essere utilizzate per discriminare preliminarmente tra fenotipi respiratori e fermentativi del lievito S. cerevisiae . Di conseguenza, abbiamo effettuato batch colture di S. cerevisiae (BY4742) con le concentrazioni di glucosio differenti che sono state segnalate per indurre la crescita fermentativo: 1%, 2% e 10% (p/v)9. Culture che mostra un fenotipo fermentativo hanno una piccolo lag fase e una fase esponenziale con un ...

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Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae Cinetica di crescita esponenziale nella cultura di Batch per analizzare il metabolismo fermentativo e respiratorio

Qui presentiamo un protocollo per stimare il metabolismo respiratorio e fermentativo inserendo la crescita esponenziale di Saccharomyces cerevisiae per l'equazione di crescita esponenziale. Calcolo dei parametri cinetici permette per lo screening delle influenze di sostanze/composti sulla fermentazione o respirazione mitocondriale.

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biotecnologico e biomedico come quali sono le basi molecolari dietro gli effetti di Warburg e Crabtree. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo studio ad alta produttività degli effetti di alcune sostanze nel metabolismo respiratorio e fermentativo. Inizia inoculando un tubo conico da 15 millilitri contenente tre millilitri di estratto di peptone destrosio fresco e sterile al 2%, o brodo YPD, con 250 microlitri di cellule di lievito S.cerevisiae conservate nel glicerolo a -20 gradi Celsius.Incubare il lievito durante la notte in uno shaker orbitale a 30 gradi Celsius e 200 giri/min. per striature su una piastra di Petri piena di agar da 60 millilitri, riempita di agar 2%YPD la mattina successiva. Coltura il piatto a 30 gradi Celsius fino a quando non si osservano colonie isolate.Quindi inoculare una singola colonia isolata in un nuovo tubo conico contenente 10 millilitri di brodo fresco e sterile 2%YPD per la coltura notturna a 30 gradi Celsius con scuotimento. Per la configurazione della curva di crescita della micropiatta, aggiungere 145 microlitri di un mezzo culturale sperimentale appropriato ad ogni pozzo di una micropiatta sterile da 10 per 10 porcile con coperchio e inoculare ogni pozzo con cinque microlitri della coltura notturna. Quindi incubare la piastra multi-pozzo in un lettore di micropiastrine a 30 gradi Celsius con agitazione costante a 200 giri/min per 48 ore, misurando la densità ottica a 600 nanometri ogni 30 o 60 minuti.Per l'impostazione della curva di crescita del pallone conico scosso, inoculare 20 matracci conici millilitri contenenti 4,8 millilitri di un apposito supporto di coltura sterile con 200 microlitri di coltura pre-inoculo ad una densità ottica di 600 nanometri di due per l'incubazione a 30 gradi Celsius e 250 giri/min. L'agitazione a 250 giri al minuto è fondamentale per raggiungere una crescita adeguata a basse concentrazioni di fonti di carbonio che esercitano una crescita respiratoria in quanto abbiamo osservato una ridotta crescita del lievito in condizioni respiratorie a velocità di agitazione più basse. Per consentire la misurazione della densità ottica a 600 nanometri ogni due ore per 24 ore, diluire 100 microlitri della coltura di pallone conico scosso in 900 microlitri di acqua distillata in una cuvetta spettrofotometrica da un millilitro e mescolare delicatamente con pipetta.Per l'elaborazione dei dati, in un software di pacchetti statistici appropriato, creare un nuovo file di progetto, aprire il nuovo menu tabella e grafico e selezionare XY. Nel menu dati di esempio selezionare Inizia con una tabella dati vuota e un grafico a linee di collegamento e punti. Lasciare la sezione X deselezionata nelle sottocolonne per le repliche o i valori di errore. Nella sezione Y, selezionare immettere 10 valori di replica nelle sottocolonne affiancate e tracciare la media e l'errore SD. Quindi fare clic su crea.Immettere il momento in cui le misurazioni OD sono state ottenute nella colonna X e i valori OD ottenuti dalle impostazioni cultura nella colonna Y. Per identificare la fase di crescita esponenziale che trasforma i dati della colonna Y in logaritmi, fare clic su analizza e selezionare l'analisi della trasformazione. Usa Y uguale al registro Y per selezionare i valori Y e aprire la raccolta dei risultati.Selezionare la tabella dei dati di trasformazione, fare clic su analizza e selezionare l'analisi di regressione lineare, escludendo i valori di densità ottica che non seguono una tendenza lineare selezionando i valori nella tabella e il controllo deprimente e E.In nella raccolta tabelle dati selezionare i dati di una tabella e fare clic su analizza. Selezionare l'analisi dell'adattamento della curva di regressione non lineare e i set di dati da analizzare e fare clic su OK. Quindi applicare i quadrati meno adatti ai dati, lasciando la sezione interpolata deselezionata e fare clic su OK. Aprire quindi un nuovo file di progetto e nel nuovo menu tabella e grafico selezionare la scelta della colonna, iniziare con una tabella dati vuota e il grafico desiderato. Impostate il grafico per tracciare la media con la deviazione standard e fate clic su Crea (Create).Copiare i valori del tempo medio o delta dalla tabella dei risultati di adattamento non lineare nella raccolta dei risultati e incollarli in una colonna. Infine, fate clic su analizza (Analyze) e selezionate l'analisi di interesse nel menu di analisi delle colonne per confrontare i parametri cinetici delle diverse condizioni nutrimentali. I valori soglia cinetici di crescita variano tra i punti di forza e devono essere valutati in base alle condizioni che utilizziamo nell'analisi.Le culture che dimostrano un fenotipo fermentativo hanno una piccola fase di ritardo e una fase esponenziale con un alto tasso di crescita. Le colture che ottengono energia principalmente dalla fosforilazione ossidativa mostrano una fase di ritardo più lunga con un lento tasso di crescita durante la fase esponenziale. Il calcolo del tasso di crescita specifico e il tempo di raddoppio delle curve di crescita utilizzando l'equazione di crescita esponenziale consentono di impostare soglie per i valori di crescita respiratoria e fermentativa.Ad esempio, in questi esperimenti rappresentativi, gli effetti delle diverse concentrazioni di resveratrolo sulle cellule S.cerevisiae BY4742 rivelano la modifica dello stato energetico cellulare in risposta alle diverse concentrazioni di glucosio. Qui, l'integrazione con glucosio al 10% dimostra che concentrazioni più basse di ammonio favoriscono il metabolismo fermentativo come evidenziato da una fase di crescita esponenziale estesa in queste colture, mentre una maggiore concentrazione induce un metabolismo respiro-fermentativo come evidenziato da una fase di ritardo prolungato e da un tasso di crescita più lento durante la fase esponenziale. Infine, si possono osservare solide differenze nei valori di raddoppio fermentativo tra questi due diversi ceppi di lievito coltivati nelle stesse condizioni, evidenziando la necessità di convalidare la soglia di raddoppio del tempo per ogni ceppo analizzato.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che questo protocollo viene utilizzato solo per schermare il fenotipo. Gli effetti specifici sulla respirazione e sulla fermentazione devono essere confermati rispettivamente dai saggi di consumo di ossigeno o dall'accumulo di sottoprodotti della fermentazione.

Research

JoVE Journal

Biology

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

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Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

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Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

La combinazione di ordinamento magnetico di cellule madri e test di fluttuazione per analizzare genoma instabilità mitotica Durante l&#39;invecchiamento cellulare in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Diretto Evolution Metodo<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creazione e screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...