Name: saccharomyces cerevisiae exponential growth kinetics in batch culture to analyze respiratory and fermentative metabolism
Uploaded: 2018-09-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism at JoVE.com

Dette prosjektet ble støttet av tilskudd av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (bevilgning nummer 293940) og Fundación TELMEX-TELCEL (bevilgning nummer 162005585), både til IKOM.

1. kultur medier og Inoculum forberedelser
<ol><li>Forberede 100 mL 2% gjær ekstrakt-pepton-druesukker (YPD) flytende medium (legge 1 g av gjær ekstra, kasein pepton 2 g og 2 g av glukose til 100 mL destillert vann). Dispensere 3 mL media i 15 mL sterilisert konisk rør. Autoclave media i 15 min 121 ° C og 1,5 psi. Merk: Mediene kan lagres i opptil en måned på 4-8 ° C.</li>
	<li>Vaksinere et konisk rør fylt med 3 mL kule sterilt 2% YPD buljong med 250 μL S. cerevisiae celler i glyserol på 20 ° C. ...

<ol>
	<li>Parrella, E., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+to+study+mitochondrial+dysfunction+and+disease.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease.</a> Methods. 46 (4), 256-262 (2008).</li><li>Rosas Lemus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycolysis-derived+hexose+phosphates+in+the+induction+of+the+Crabtree+effect.">The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2018).</li><li>Xu, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warburg+effect+or+reverse+Warburg+effect?+A+review+of+cancer+metabolism.">Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism.</a> Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).</li><li>De Deken, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crabtree+effect:+a+regulatory+system+in+yeast.">The Crabtree effect: a regulatory system in yeast.</a> Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).</li><li>Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+yeast+short-term+Crabtree+effect+and+its+origin.">Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin.</a> The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).</li><li>Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crabtree+and+Warburg+effects:+Do+metabolite-induced+regulations+participate+in+their+induction?.">The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction?.</a> Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).</li><li>Keating, E., Martel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimetabolic+Effects+of+Polyphenols+in+Breast+Cancer+Cells:+Focus+on+Glucose+Uptake+and+Metabolism.">Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).</li><li>Pfeiffer, T., Morley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionary+perspective+on+the+Crabtree+effect.">An evolutionary perspective on the Crabtree effect.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).</li><li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li><li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+bacterial+cultures.">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).</li><li>Cui, S., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mathematical+models+for+the+growth+of+tumors+with+time+delays+in+cell+proliferation.">Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation.</a> Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).</li><li>Benzekry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+mathematical+models+for+description+and+prediction+of+experimental+tumor+growth.">Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth.</a> Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).</li><li>Ramos-Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+induces+mitochondrial+dysfunction+and+decreases+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+a+glucose-dependent+manner.">Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).</li><li>Madrigal-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy-dependent+effects+of+resveratrol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).</li><li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+curves:+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot.">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).</li></ol>

Lang tid har gått siden J. Monod10 uttrykt at studiet av veksten av bakteriekulturer er den grunnleggende metoden for mikrobiologi. Ankomsten av molekylære verktøy forsinker forbruket og studie av vekst som en teknikk. Til tross for kompleksiteten i vekst som involverer mange beslektede prosesser, kan dens underliggende mekanismer beskrives ved hjelp av matematiske modeller11. Dette er en robust tilnærming som kan brukes som et supplerende verktøy for å belyse de mest...

Saccharomyces cerevisiae veksten har vært et verdifullt verktøy for å identifisere dusinvis av fysiologiske og molekylære mekanismer. Vekst måles av tre metoder: føljetong fortynninger for spot testing, colony-forming enhet teller og vekst kurver. Disse teknikkene kan brukes alene eller i kombinasjon med en rekke underlag, miljøforhold, mutanter og kjemikalier for å undersøke bestemte svar eller fenotyper.
Mitokondrielt åndedrett er en biologisk prosess der vekst kinetics har vært anvendt for å oppdage ukjent mekanismer. I dette tilfellet kosttilskudd vekst medier med ikke-fermentable karbon kilder som glyserol, laktat eller etanol (som metaboliseres utelukkende av mitokondrie åndedrett), som eneste karbon og energi kilde for å vurdere den åndedretts vekst, som er viktig å oppdage forstyrrelser i oxidative fosforylering aktivitet1. På den annen side, er det komplisert å bruke vekst kinetic modeller for å tyde mekanismene bak gjæring.
Studiet av gjæring og mitokondrie åndedrett er viktig å belyse molekylære mekanismer bak visse fenotyper som Crabtree og Warburg effekter2,3. Crabtree effekten er preget av en økning av glycolytic forandring, undertrykkelse av mitokondrie åndedrett, og etableringen av gjæring som den primære sti å generere ATP i nærvær av høye konsentrasjoner av fermentable karbohydrater (> 0,8 mM)4,5. Warburg effekten er metabolically analog til Crabtree effekten, med forskjellen at i pattedyrceller, hovedproduktet av gjæring er laktat6. Faktisk er Warburg effekten utstilt ved en rekke kreftceller, utløser glukose opptak og forbruk selv i nærvær av oksygen7. Dermed har studere molekylære grunnlaget for overgangen fra åndedrett til gjæring i Crabtree effekten både bioteknologisk konsekvenser (for etanolproduksjon) og mulige konsekvenser i kreftforskning.
S. cerevisiae vekst kan være et egnet verktøy for å studere virkningene Crabtree og Warburg. Denne ideen er basert på det faktum at i gjær eksponentiell fase, sentrale veier brukt til å produsere ATP er mitokondrie åndedrett og gjæring, som er avgjørende for å opprettholde vekst. For eksempel er veksten av S. cerevisiae nært knyttet til funksjonen av ATP-generering. S. cerevisiae, mitokondrie åndedrett produserer ca 18 ATP molekylene per glukose molekylet, mens gjæring bare genererer 2 ATP molekylene, er derav det forventet at veksten har tette forbindelser med metabolske veier produsere ATP8. I denne forbindelse når gjæringen er den viktigste ruten å generere ATP, kompenserer gjær for lite ATP produksjonen ved å øke hastigheten av glukose opptak. Tvert imot, er glukose forbruket gjærceller bruke mitokondrie åndedrett som hovedkilden ATP lav. Dette indikerer at det er viktig for gjær følelse karbohydrater tilgjengelighet før du bestemmer hvordan ATP skal genereres. Derfor glukose tilgjengelighet spiller en viktig rolle i Bytt mellom gjæring og mitokondrie respirasjon i S. cerevisiae. I nærvær av høye mengder glukose foretrekker gjær fermentering som sentrale ruten å generere ATP. Interessant, når gjær er gjæring, beholdes den spesifikk vekstraten på maksimumsnivå. På den annen side, under lave nivåer av glukose produserer S. cerevisiae ATP ved hjelp mitokondrie åndedrett, opprettholde lavere vekstrater. Dermed indusere variasjon i konsentrasjon av glukose og bruk av andre karbon kilder endringer i gjær og preferanse mellom fermentative og luftveier. Ved å ta hensyn til dette faktum med eksponentiell vekst ligningen, kan man få biologiske betydningen av kinetic parametre som dobling tid (Dt) og spesifikk vekstrate (μ). For eksempel ble lavere μ verdier funnet under gjær bruker mitokondrie åndedrett som den primære stien. Tvert imot, under forhold som favoriserer gjæring, ble høyere µ verdier funnet. Denne metoden kan brukes til å måle sannsynlig mekanismer for noen kjemikalier påvirker gjæring og mitokondrie åndedrett i S. cerevisiae.
Målet med denne utredningen er å foreslå en metode basert på vekst kinetics for screening effekten av en gitt stoffet/sammensatt på mitokondrie åndedrett eller gjæring.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4353</td>
			<td style="width:167px;">For inoculum incubation or conical fask cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bioscreen&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Growth curves</td>
			<td style="width:119px;">C MBR</td>
			<td>For batch cultures in microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Peptone from casein, enzymatic digest</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">82303</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">09182-1KG-F</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacteriological Agar</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td>For YPD agar preparation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>S8282</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(NH4)2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A4418</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Y1251</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yeast synthetic drop-Out medium supplements</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Y1501</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium sulfate granular</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">0792-R</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resveratrol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">R5010</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S7903</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Absolut ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Merck</td>
			<td align="right">107017</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td>2136-01</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Honeycomb microplates</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">9502550</td>
			<td>For microplate cultures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saccharomyces cerevisiae exponential growth kinetics in batch culture to analyze respiratory and fermentative metabolism

Saccharomyces cerevisiae celler i eksponentiell fase opprettholde sin vekst ved å produsere ATP gjennom gjæring og/eller mitokondrie åndedrett. Fermentable karbon konsentrasjonen styrer hovedsakelig hvordan gjærceller generere ATP; dermed stasjoner variasjonen i fermentable karbohydrater nivåer energisk metabolismen av S. cerevisiae. Dette dokumentet beskriver en høy gjennomstrømming metode basert på eksponentiell gjær vekst å beregne effekten av konsentrasjon endringer og natur karbon kilden på respiratory og fermentative metabolisme. Veksten av S. cerevisiae er målt i en microplate eller ristet konisk kolbe ved å bestemme optisk densitet (OD) på 600 nm. Deretter er en vekstkurve bygget av inntegningsrekkefølgen OD versus tid, som kan identifisere og velge den eksponentielle fasen, og er utstyrt med eksponentiell vekst ligningen som oppnå kinetic parametere. Lav bestemt vekstrater med høyere dobling ganger representerer vanligvis en åndedretts vekst. Derimot vise høyere bestemt vekstrater med lavere dobling ganger fermentative vekst. Terskelverdier for dobling tid og spesifikk vekstrate er beregnet ved hjelp av kjente luftveis- eller fermentative forhold, som ikke-fermentable karbon kilder eller høyere konsentrasjoner av fermentable sukker. Dette oppnås for hver bestemt stamme. Til slutt er beregnet kinetic parameterne sammenlignet med terskelverdier å etablere om gjær viser fermentative og/eller åndedretts vekst. Fordelen med denne metoden er sin relative enkelhet for å forstå virkningene av et stoff/sammensatt på fermentative eller respirasjonssykdommer metabolisme. Det er viktig å understreke at veksten er en intrikate og komplekse biologisk prosess; Derfor må foreløpige data fra denne metoden være bekreftet av kvantifisering av oksygenforbruk og akkumulering av gjæring biprodukter. Dermed, kan denne teknikken bli brukt som en foreløpig screening forbindelser/stoffer som kan forstyrre eller øke fermentative eller respirasjonssykdommer stoffskifte.

Vekst kurver kan brukes å foreløpig forskjellsbehandle respiratory og fermentative fenotyper i S. cerevisiae gjær. Derfor vi utført satsvise kulturer av S. cerevisiae (BY4742) med ulike glukose konsentrasjoner som er rapportert å indusere fermentative vekst: 1% og 2% 10% (w/v)9. Kulturer viser en fermentative fenotypen har en liten lag fase og en eksponentiell fase med høy vekst (figur 1). Etanol, glyserol og la...

Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism at JoVE.com

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae Eksponentiell vekst Kinetics i Batch kultur analysere Respiratory og Fermentative metabolisme

Her presenterer vi en protokoll for å beregne respiratory og fermentative metabolismen av passende Saccharomyces cerevisiae eksponensiell vekst i eksponensiell vekst formelen. Beregning av kinetic parametere tillater screening av påvirkninger av stoffer/forbindelser på gjæring eller mitokondrie åndedrett.

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen bioteknologiske og biomedisinske felt som hva som er molekylært grunnlag bak Warburg og Crabtree effekter. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater den høye gjennomstrømningsstudien av effekten av visse stoffer i respiratorisk og fermentativ metabolisme. Begynn med å inokulere et konisk rør på 15 milliliter som inneholder tre milliliter kjølige, sterile 2% gjærekstrakt peptondekstrose, eller YPD kjøttkraft, med 250 mikroliter s.cerevisiae gjærceller bevart i glyserol ved negative 20 grader Celsius.Inkuber gjæren over natten i en orbital shaker ved 30 grader Celsius og 200 rpm. for striping på en 60-milliliter, 2% YPD agar-fylt Petri parabolen neste morgen. Kultur parabolen på 30 grader Celsius til isolerte kolonier observeres.Inokuler deretter en enkelt isolert koloni i et nytt konisk rør som inneholder 10 milliliter kjølig, steril 2% YPD kjøttkraft for overnattingskultur ved 30 grader Celsius med risting. For mikroplate vekstkurve oppsett, tilsett 145 mikroliter av en passende eksperimentell kulturell medium til hver brønn av en steril 10-by-10 godt mikroplate med et lokk og inokulerer hver brønn med fem mikroliter av natten kultur. Deretter inkubere multi-brønnplaten i en mikroplateleser ved 30 grader Celsius med konstant agitasjon ved 200 rpm i 48 timer, og måler den optiske tettheten ved 600 nanometer hvert 30 eller 60.For rystet konisk kolbe vekst-kurve oppsett, inokulerer 20 milliliter koniske flasker som inneholder 4,8 milliliter av en passende steril kultur media med 200 mikroliter pre-inoculum kultur på en 600 nanometer optisk tetthet på to for inkubasjon ved 30 grader Celsius og 250 rpm. Agitasjon ved 250 omdreininger per minutt er avgjørende for å oppnå en passende vekst i lave konsentrasjoner av karbonkilder som utøver respiratorisk vekst som vi har observert en redusert gjærvekst i respiratoriske forhold ved lavere agitasjonshastigheter. For å tillate måling av den optiske tettheten ved 600 nanometer annenhver time i 24 timer, fortynne 100 mikroliter av den ristede koniske kolben kultur i 900 mikroliter destillert vann i en ett milliliter spektrofotometer cuvette og forsiktig blandes med pipette.For databehandling, i en passende statistisk pakkeprogramvare, opprett en ny prosjektfil, åpne den nye tabell- og grafmenyen og velg XY. Velg Start med en tom datatabell og et punkt og koble til linjediagram under eksempeldatamenyen. La X-delen være umerket i underkolonner for replikeringer eller feilverdier. I Y-delen velger du angi 10 replikere verdier i delkolonner side ved side og plottsnitt og feilSD. Klikk deretter opprett.Angi tidspunktet da OD-målingene ble innhentet i X-kolonnen og OD-verdiene hentet fra kulturene i Y-kolonnen. Hvis du vil identifisere den eksponentielle vekstfasen som transformerer Y-kolonnedataene til logaritmer, klikker du analyser og velger transformeringsanalysen. Bruk Y er lik logg Y til å velge Y-verdiene og åpne resultatgalleriet.Velg transformeringsdatatabellen, klikk analyser og velg den lineære regresjonsanalysen, unntatt de optiske tetthetsverdiene som ikke følger en lineær trend, ved å velge verdiene i tabellen og deprimerende kontroll, E.In og velg dataene en tabell og klikk analyser. Velg den ikke-lineære regresjonskurvekoblingskurveen og datasettene som skal analyseres, og klikk OK. Bruk deretter minst firkanter som passer til dataene, slik at interpolate-delen ikke er valgt, og klikker OK. Deretter åpner du en ny prosjektfil, og i den nye tabell- og diagrammenyen velger du kolonnevalget, starter med en tom datatabell og ønsket graf. Angi at diagrammet skal tegne inn gjennomsnittet med standardavviket, og klikk opprett.Kopier gjennomsnitts- eller deltatidsverdiene fra tabellen for ikke-lineære tilpass resultater i resultatgalleriet, og lim inn dataene i en kolonne. Til slutt klikker du analyser og velger analysen av interesse i kolonneanalysemenyen for å sammenligne de kinetiske parametrene for de forskjellige næringsforholdene. Vekstkinetiske terskelverdier varierer mellom styrker og må evalueres i henhold til forholdene vi bruker i analysen.Kulturer som viser en fermentativ fenotype har en liten forsinkelsesfase og en eksponentiell fase med høy vekstrate. Kulturer som oppnår energi hovedsakelig ved oksidativ fosforylering, viser en lengre forsinkelsesfase med en langsom veksthastighet i eksponentiell fase. Beregning av den spesifikke veksthastigheten og doblingen av vekstkurvene ved hjelp av eksponentiell vekstligning gir mulighet for innstilling av terskler for respiratoriske og fermentative vekstverdier.For eksempel, i disse representative eksperimenter, effekten av ulike resveratrol konsentrasjoner på S.cerevisiae BY4742 celler avsløremodifisering av cellen energisk status som svar på varierende glukosekonsentrasjoner. Her viser tilskudd med 10% glukose at lavere konsentrasjoner av ammonium favoriserer fermentativ metabolisme som det fremgår av en utvidet eksponentiell vekstfase i disse kulturene, mens en høyere konsentrasjon induserer en respiro-fermentativ metabolisme som det fremgår av en utvidet forsinkelsesfase og en langsommere vekstrate i eksponentiell fase. Til slutt kan robuste forskjeller i fermentative doblingstidsverdier observeres mellom disse to forskjellige gjærstammene som dyrkes under de samme forholdene, og fremhever nødvendigheten av å validere doblingstidsterskelen for hver belastning som analyseres.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at denne protokollen bare brukes til å screene ut fenotype. De spesifikke effektene på respirasjon og gjæring må bekreftes av oksygenforbruksanalyser eller ved akkumulering av henholdsvis fermenteringsbiprodukter.

Research

JoVE Journal

Biology

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse av mRNA molekyler med fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Sammen Analyser for Monitoring Protein Refolding i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Kombinere Magnetic Sortering av Mor Cells og svingninger tester for å analysere Genome Ustabilitet Under Mitotisk cellealdring<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identifikasjon av kjemiske Genetiske interaksjoner i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Vekst-baserte Fastsettelse og Biokjemisk Bekreftelse av Genetiske Krav for proteinnedbrytning i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Regissert Evolution Metode i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotek Creation og resirkulering

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...