Name: saccharomyces cerevisiae exponential growth kinetics in batch culture to analyze respiratory and fermentative metabolism
Uploaded: 2018-09-30T14:00:00
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Este proyecto fue apoyado por becas del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (número 293940) y Fundación TELMEX-TELCEL (número 162005585), ambos a IKOM.

1. medios de cultivo y preparación del inóculo
<ol><li>Preparar 100 mL de medio líquido de 2% levadura extracto-peptona-dextrosa (YPD) (agregue 1 g de levadura extracto, 2 g de peptona de caseína, y 2 g de glucosa a 100 mL de agua destilada). Pipetear 3 mL de los medios de comunicación en esterilizable tubos cónicos de 15 mL. Autoclave de los medios de comunicación durante 15 min a 121 ° C y 1.5 psi. Nota: Los medios de comunicación pueden conservarse hasta un mes en 4 – 8 ° C.</li>
	<li>Inocular un tubo...

<ol>
	<li>Parrella, E., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+to+study+mitochondrial+dysfunction+and+disease.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease.</a> Methods. 46 (4), 256-262 (2008).</li><li>Rosas Lemus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycolysis-derived+hexose+phosphates+in+the+induction+of+the+Crabtree+effect.">The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2018).</li><li>Xu, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warburg+effect+or+reverse+Warburg+effect?+A+review+of+cancer+metabolism.">Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism.</a> Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).</li><li>De Deken, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crabtree+effect:+a+regulatory+system+in+yeast.">The Crabtree effect: a regulatory system in yeast.</a> Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).</li><li>Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+yeast+short-term+Crabtree+effect+and+its+origin.">Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin.</a> The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).</li><li>Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crabtree+and+Warburg+effects:+Do+metabolite-induced+regulations+participate+in+their+induction?.">The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction?.</a> Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).</li><li>Keating, E., Martel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimetabolic+Effects+of+Polyphenols+in+Breast+Cancer+Cells:+Focus+on+Glucose+Uptake+and+Metabolism.">Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).</li><li>Pfeiffer, T., Morley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionary+perspective+on+the+Crabtree+effect.">An evolutionary perspective on the Crabtree effect.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).</li><li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li><li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+bacterial+cultures.">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).</li><li>Cui, S., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mathematical+models+for+the+growth+of+tumors+with+time+delays+in+cell+proliferation.">Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation.</a> Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).</li><li>Benzekry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+mathematical+models+for+description+and+prediction+of+experimental+tumor+growth.">Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth.</a> Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).</li><li>Ramos-Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+induces+mitochondrial+dysfunction+and+decreases+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+a+glucose-dependent+manner.">Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).</li><li>Madrigal-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy-dependent+effects+of+resveratrol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).</li><li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+curves:+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot.">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).</li></ol>

Mucho tiempo ha pasado desde que J. Monod10 expresa que el estudio del crecimiento de cultivos bacterianos es el método básico de la microbiología. El advenimiento de las herramientas moleculares retrasa el uso y el estudio del crecimiento como una técnica. A pesar de la complejidad de crecimiento que involucra numerosos procesos relacionados entre sí, sus mecanismos subyacentes pueden describirse mediante el uso de modelos matemáticos11. Se trata de un enfoque robust...

Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae ha servido como una herramienta valiosa para identificar decenas de mecanismos fisiológicos y moleculares. Crecimiento se mide principalmente por tres métodos: diluciones seriadas para pruebas de punto, unidad formadora de colonias contando y las curvas de crecimiento. Estas técnicas se pueden utilizar solo o en combinación con una variedad de sustratos, condiciones ambientales, mutantes y productos químicos para investigar las respuestas específicas o fenotipos.
La respiración mitocondrial es un proceso biológico en el cual cinética de crecimiento se ha aplicado con éxito para descubrir mecanismos desconocidos. En este caso, la suplementación del medio de crecimiento con carbono no fermentables fuentes tales como el glicerol, el lactato o el etanol (que se metabolizan exclusivamente por la respiración mitocondrial), como la única fuente de carbono y energía permite evaluar la crecimiento respiratorio, que es importante detectar las perturbaciones en la fosforilación oxidativa actividad1. Por otro lado, es complicado usar modelos cinéticos de crecimiento como un método para descifrar los mecanismos detrás de la fermentación.
El estudio de la fermentación y la respiración mitocondrial es fundamental para dilucidar los mecanismos moleculares detrás de ciertos fenotipos como el Crabtree y Warburg efectos2,3. El efecto Crabtree se caracteriza por un aumento del flujo glicolítico, la represión de la respiración mitocondrial y el establecimiento de la fermentación como la vía primaria para generar ATP en presencia de altas concentraciones de carbohidratos fermentables (> 0,8 mM)4,5. El efecto de Warburg es metabólicamente análogo al efecto Crabtree, con la diferencia que en células de mamíferos, el principal producto de la fermentación es lactato6. De hecho, el efecto de Warburg es exhibido por una variedad de células cancerosas, provocando la absorción de glucosa y consumo incluso en presencia de oxígeno7. De tal modo, estudiando la base molecular de la cambio de respiración a la fermentación en el efecto Crabtree tiene repercusiones biotecnología (producción de etanol) e impactos potenciales en la investigación del cáncer.
Crecimiento de S. cerevisiae puede ser una herramienta adecuada para estudiar los efectos de Crabtree y Warburg. Esta idea es basa en el hecho de que en la fase exponencial de la levadura, las vías central utilizadas para producir ATP son la respiración mitocondrial y la fermentación, que son esenciales para sostener el crecimiento. Por ejemplo, el crecimiento de S. cerevisiae está íntimamente relacionada con la función de las vías generadoras de ATP. En moléculas de S. cerevisiae, la respiración mitocondrial produce aproximadamente 18 ATP por molécula de glucosa, mientras que la fermentación sólo genera 2 moléculas de ATP, por lo tanto, se espera que la tasa de crecimiento tiene estrecha vínculos con las vías metabólicas la producción de ATP8. En este sentido, cuando la fermentación es la ruta principal para generar ATP, la levadura compensa la baja producción de ATP mediante el aumento de la tasa de absorción de la glucosa. Por el contrario, el consumo de glucosa por las células de levadura que utilizan la respiración mitocondrial como la principal fuente de ATP es bajo. Esto indica que es importante que la levadura a la disponibilidad de hidratos de carbono de sentido antes de determinar cómo se genera ATP. Por lo tanto, la disponibilidad de la glucosa desempeña un papel importante en el interruptor entre fermentación y respiración mitocondrial en S. cerevisiae. En presencia de altas cantidades de glucosa, la levadura prefiere la fermentación como la ruta central para generar ATP. Curiosamente, cuando la fermentación de la levadura, la tasa de crecimiento se mantiene en su máximo. Por otra parte, bajo niveles bajos de glucosa, S. cerevisiae produce ATP utilizando la respiración mitocondrial, manteniendo tasas de crecimiento. Por lo tanto, variación en la concentración de la glucosa y el uso de otras fuentes de carbono inducir cambios en la preferencia de la levadura entre el crecimiento fermentativo y respiratorio. Teniendo en cuenta este hecho con la ecuación de crecimiento exponencial, se puede obtener el significado biológico de parámetros cinéticos como la duplicación de tiempo (Dt) y tasa de crecimiento específico (μ). Por ejemplo, se encontraron menores valores de μ cuando la levadura utiliza la respiración mitocondrial como la vía principal. Por el contrario, bajo condiciones que favorecen la fermentación, se encontraron valores más altos de μ . Esta metodología puede utilizarse para medir los probables mecanismos de sustancias químicas que afectan a la fermentación y la respiración mitocondrial en S. cerevisiae.
El objetivo de este trabajo es proponer un método basado en la cinética de crecimiento para la detección de los efectos de un determinada sustancia/compuesto sobre la respiración mitocondrial o fermentación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4353</td>
			<td style="width:167px;">For inoculum incubation or conical fask cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bioscreen&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Growth curves</td>
			<td style="width:119px;">C MBR</td>
			<td>For batch cultures in microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Peptone from casein, enzymatic digest</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">82303</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">09182-1KG-F</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacteriological Agar</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td>For YPD agar preparation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>S8282</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(NH4)2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A4418</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Y1251</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yeast synthetic drop-Out medium supplements</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Y1501</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium sulfate granular</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">0792-R</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resveratrol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">R5010</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S7903</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Absolut ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Merck</td>
			<td align="right">107017</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td>2136-01</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Honeycomb microplates</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">9502550</td>
			<td>For microplate cultures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saccharomyces cerevisiae exponential growth kinetics in batch culture to analyze respiratory and fermentative metabolism

Las células de Saccharomyces cerevisiae en la fase exponencial sostienen su crecimiento mediante la producción de ATP por fermentación o respiración mitocondrial. La concentración de carbono fermentables principalmente gobierna cómo las células de levadura generan ATP; por lo tanto, la variación en los niveles de carbohidratos fermentables impulsa el metabolismo energético de S. cerevisiae. Este papel describe un método de alto rendimiento basado en el crecimiento exponencial de la levadura para estimar los efectos de los cambios de la concentración y naturaleza de la fuente de carbono sobre el metabolismo respiratorio y fermentativo. El crecimiento de S. cerevisiae es medido en una microplaca o sacudirse cónico matraz mediante la determinación de la densidad óptica (OD) a 600 nm. Entonces, una curva de crecimiento es construida por OD trazado frente al tiempo, que permite la identificación y selección de la fase exponencial y está equipado con la ecuación de crecimiento exponencial para obtener parámetros cinéticos. Las tasas de crecimiento bajo con tiempos de duplicación superiores generalmente representan un crecimiento respiratorio. Por el contrario, mayores tasas de crecimiento específico con menores tiempos de duplicación indican crecimiento fermentativo. Valores umbral de duplicar el tiempo y la tasa de crecimiento específico se calculan usando condiciones respiratorias o fermentativas bien conocidas, tales como fuentes de carbono no fermentables o altas concentraciones de azúcares fermentables. Esto se obtiene de cada cepa específica. Por último, los parámetros cinéticos calculados se comparan con los valores de umbral para establecer si la levadura demuestra crecimiento fermentativo o respiratorio. La ventaja de este método es su relativa sencillez para la comprensión de los efectos de un compuesto de sustancia en el metabolismo fermentativo o respiratorio. Es importante destacar que el crecimiento es un proceso intrincado y complejo biológico; por lo tanto, los datos preliminares de este método deben ser corroborados por la cuantificación del consumo de oxígeno y la acumulación de subproductos de la fermentación. Por lo tanto, esta técnica puede utilizarse como una proyección preliminar de compuestos/sustancias que pueden alterar o mejorar el metabolismo fermentativo o respiratorio.

Las curvas de crecimiento pueden utilizarse para diferenciar preliminarmente los fenotipos respiratorios y fermentativos de la levadura S. cerevisiae . Por lo tanto, se realizaron cultivos batch de S. cerevisiae (BY4742) con concentraciones diferentes de glucosa que se han divulgado para inducir el crecimiento fermentativo: 1%, 2% y 10% (w/v)9. Las culturas que muestran un fenotipo fermentativo tienen un pequeño retraso y una fase exponencial con...

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Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae Cinética de crecimiento exponencial en la cultura de lote para analizar el metabolismo respiratorio y fermentativo

Aquí presentamos un protocolo para estimar el metabolismo respiratorio y fermentativo encajando el exponencial crecimiento de Saccharomyces cerevisiae a la ecuación de crecimiento exponencial. Cálculo de los parámetros cinéticos permite la proyección de la influencia de compuestos de sustancias en fermentación o respiración mitocondrial.

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos biotecnológico y biomédico, como cuáles son la base molecular detrás de los efectos de Warburg y Crabtree. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de alto rendimiento de los efectos de ciertas sustancias en el metabolismo respiratorio y fermentativo. Comience por inocular un tubo cónico de 15 mililitros que contenga tres mililitros de frío, estéril 2% de dextrosa de peptona extracto de levadura, o caldo YPD, con 250 microlitros de células de levadura S.cerevisiae preservadas en glicerol a 20 grados Celsius negativos.Incubar la levadura durante la noche en un agitador orbital a 30 grados celsius y 200 rpm. para rayar en un plato de Petri lleno de 60 mililitros, 2%YPD lleno de agar a la mañana siguiente. Cultivar el plato a 30 grados centígrados hasta que se observen colonias aisladas.Luego inocular una sola colonia aislada en un nuevo tubo cónico que contiene 10 mililitros de caldo fresco y estéril de 2%YPD para cultivo nocturno a 30 grados centígrados con temblores. Para la configuración de la curva de crecimiento de la microplaca, añada 145 microlitros de un medio cultural experimental apropiado a cada pocócula de una microplaca estéril de 10 por 10 pocono con una tapa e inocular cada pocóculo con cinco microlitros del cultivo nocturno. A continuación, incubar la placa multi-pozo en un lector de microplacas a 30 grados Celsius con agitación constante a 200 rpm durante 48 horas, midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros cada 30 o 60 minutos.Para la configuración de la curva de crecimiento del matraz cónico agitado, inocular matraces cónicos de 20 mililitros que contengan 4,8 mililitros de un medio de cultivo estéril apropiado con 200 microlitros de cultivo pre-inóculo a una densidad óptica de 600 nanómetros de dos para incubación a 30 grados Celsius y 250 rpm. La agitación a 250 revoluciones por minuto es fundamental para lograr un crecimiento adecuado en bajas concentraciones de fuentes de carbono que ejercen un crecimiento respiratorio, ya que hemos observado un crecimiento reducido de la levadura en condiciones respiratorias a velocidades de agitación más bajas. Para permitir la medición de la densidad óptica a 600 nanómetros cada dos horas durante 24 horas, diluir 100 microlitros del cultivo de matraz cónico agitado en 900 microlitros de agua destilada en una cubetatómetro espectrofotómetro de un mililitro y mezclar suavemente por pipeta.Para el procesamiento de datos, en un software de paquete estadístico adecuado, cree un nuevo archivo de proyecto, abra el nuevo menú de tabla y gráfico y seleccione XY. En el menú de datos de ejemplo, seleccione comenzar con una tabla de datos vacía y un gráfico de puntos y líneas de conexión. Deje la sección X sin seleccionar en subcolumnas para réplicas o valores de error. En la sección Y, seleccione 10 valores de réplica en subcolumnas en paralelo y la media de trazado y el error SD. A continuación, haga clic en crear.Introduzca la hora a la que se obtuvieron las mediciones de OD en la columna X y los valores de OD obtenidos de las referencias culturales de la columna Y. Para identificar la fase de crecimiento exponencial que transforma los datos de la columna Y en logaritmos, haga clic en analizar y seleccionar el análisis de transformación. Utilice Y es igual al registro Y para seleccionar los valores Y y abrir la galería de resultados.Seleccione la tabla de datos de transformación, haga clic en analizar y seleccione el análisis de regresión lineal, excluyendo los valores de densidad óptica que no siguen una tendencia lineal seleccionando los valores de la tabla y presionando el control y E.In la galería de tablas de datos, seleccione los datos de una tabla y haga clic en analizar. Seleccione el análisis de ajuste de curva de regresión no lineal y los conjuntos de datos que desea analizar y haga clic en Aceptar. A continuación, aplique los cuadrados mínimos que se ajusten a los datos, dejando la sección de interpolación sin seleccionar y haga clic en Aceptar. A continuación, abra un nuevo archivo de proyecto y, en el nuevo menú de tabla y gráfico, seleccione la opción de columna, comience con una tabla de datos vacía y el gráfico deseado. Establezca el gráfico para trazar la media con la desviación estándar y haga clic en Crear.Copie los valores de tiempo medio o delta de la tabla de resultados de ajuste no lineal en la galería de resultados y pegue los datos en una columna. Por último, haga clic en analizar y seleccionar el análisis de interés en el menú de análisis de columnas para comparar los parámetros cinéticos de las diferentes condiciones nutrimentales. Los valores de umbral cinético de crecimiento varían entre las fortalezas y deben evaluarse de acuerdo con las condiciones que utilizamos en el análisis.Los cultivos que demuestran un fenotipo fermentativo tienen una pequeña fase de retraso y una fase exponencial con una alta tasa de crecimiento. Los cultivos que obtienen energía principalmente por fosforilación oxidativa exhiben una fase de retraso más larga con una tasa lenta de crecimiento durante la fase exponencial. El cálculo de la tasa de crecimiento específica y el tiempo de duplicación de las curvas de crecimiento utilizando la ecuación de crecimiento exponencial permite el establecimiento de umbrales para los valores de crecimiento respiratorio y fermentativo.Por ejemplo, en estos experimentos representativos, los efectos de diferentes concentraciones de resveratrol en las células S.cerevisiae BY4742 revelan la modificación del estado energético celular en respuesta a diferentes concentraciones de glucosa. Aquí, la suplementación con 10%glucosa demuestra que las concentraciones más bajas de amonio favorecen el metabolismo fermentativo como lo demuestra una fase de crecimiento exponencial extendida en estos cultivos, mientras que una mayor concentración induce un metabolismo-fermentativo como lo demuestra una fase de retraso extendida y una tasa de crecimiento más lenta durante la fase exponencial. Por último, se pueden observar fuertes diferencias en los valores de tiempo de duplicación fermentativa entre estas dos cepas de levadura diferentes cultivadas en las mismas condiciones, destacando la necesidad de validar el umbral de tiempo de duplicación para cada cepa analizada.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que este protocolo solo se utiliza para detectar el fenotipo. Los efectos específicos sobre la respiración y fermentación deben confirmarse mediante ensayos de consumo de oxígeno o por la acumulación de subproductos de fermentación, respectivamente.

Research

JoVE Journal

Biology

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

La disección de Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Investigación

Biología

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

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Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

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El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

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Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

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Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combinando clasificación magnética de las células madre y las pruebas de fluctuación para analizar la inestabilidad del genoma Durante mitótico Aging Cell en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

La rápida identificación de químicos interacciones genéticas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Dirigida Método Evolución en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creación y Proyección

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