Name: saccharomyces cerevisiae exponential growth kinetics in batch culture to analyze respiratory and fermentative metabolism
Uploaded: 2018-09-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism at JoVE.com

Projektet stöddes av bidrag av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (licensnummer 293940) och Fundación TELMEX-TELCEL (licensnummer 162005585), både till IKOM.

1. kultur Media och inokulum förberedelse
<ol><li>Bereda 100 mL 2% jäst extrakt-pepton-dextros (YPD) flytande medium (lägga 1 g jäst extrakt, kaseinpepton, 2 g och 2 g glukos till 100 mL destillerat vatten). Fördela 3 mL av media i 15 mL steriliserbar koniska rör. Autoklav media under 15 minuter vid 121 ° C och 1,5 psi. Obs: Media kan förvaras i upp till en månad vid 4 – 8 ° C.</li>
	<li>Inokulera ett koniskt rör fyllda med 3 mL cool steril 2% YPD buljong med 250 μL av S. cerevisiae celler bev...

<ol>
	<li>Parrella, E., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+to+study+mitochondrial+dysfunction+and+disease.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease.</a> Methods. 46 (4), 256-262 (2008).</li><li>Rosas Lemus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glycolysis-derived+hexose+phosphates+in+the+induction+of+the+Crabtree+effect.">The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2018).</li><li>Xu, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warburg+effect+or+reverse+Warburg+effect?+A+review+of+cancer+metabolism.">Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism.</a> Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).</li><li>De Deken, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crabtree+effect:+a+regulatory+system+in+yeast.">The Crabtree effect: a regulatory system in yeast.</a> Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).</li><li>Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+yeast+short-term+Crabtree+effect+and+its+origin.">Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin.</a> The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).</li><li>Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crabtree+and+Warburg+effects:+Do+metabolite-induced+regulations+participate+in+their+induction?.">The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction?.</a> Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).</li><li>Keating, E., Martel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimetabolic+Effects+of+Polyphenols+in+Breast+Cancer+Cells:+Focus+on+Glucose+Uptake+and+Metabolism.">Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).</li><li>Pfeiffer, T., Morley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionary+perspective+on+the+Crabtree+effect.">An evolutionary perspective on the Crabtree effect.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).</li><li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li><li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+bacterial+cultures.">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).</li><li>Cui, S., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mathematical+models+for+the+growth+of+tumors+with+time+delays+in+cell+proliferation.">Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation.</a> Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).</li><li>Benzekry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+mathematical+models+for+description+and+prediction+of+experimental+tumor+growth.">Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth.</a> Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).</li><li>Ramos-Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+induces+mitochondrial+dysfunction+and+decreases+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+a+glucose-dependent+manner.">Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).</li><li>Madrigal-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy-dependent+effects+of+resveratrol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).</li><li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+growth+curves:+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot.">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).</li></ol>

Lång tid har gått sedan J. Monod10 uttryckt att studiet av tillväxten av bakteriekulturer är den grundläggande metoden för mikrobiologi. Tillkomsten av de molekylära verktyg förseningar-användning och studie av tillväxten som en teknik. Trots komplexiteten i tillväxt vilket innebär många inbördes relaterade processer, kan dess underliggande mekanismer beskrivas med hjälp av matematiska modeller11. Detta är en robust metod som kan användas som ett kompletter...

Saccharomyces cerevisiae tillväxt har fungerat som ett värdefullt verktyg att identifiera dussintals fysiologiska och molekylära mekanismer. Tillväxt mäts primärt av tre metoder: seriespädningar för spot test, kolonibildande enhet räknar och tillväxtkurvor. Dessa tekniker kan användas ensamt eller i kombination med en mängd olika substrat, miljöförhållanden, mutanter och kemikalier för att undersöka specifika reaktioner eller fenotyper.
Mitokondriell andning är en biologisk process där tillväxt kinetik har tillämpats framgångsrikt för att upptäcka okända mekanismer. I detta fall komplettering tillväxt medier med icke-jäsbara kol källor såsom glycerol, laktat eller etanol (som metaboliseras uteslutande av mitokondriell respiration), som den enda källan för kol och energi tillåter för att utvärdera den respiratoriska tillväxt, vilket är viktigt att upptäcka störningar i oxidativ fosforylering aktivitet1. Däremot, är det komplicerat att använda tillväxt kinetiska modeller som en metod för att dechiffrera mekanismerna bakom jäsning.
Studien av jäsning och mitokondrie respiration är viktigt att klarlägga de molekylära mekanismerna bakom vissa fenotyper av Crabtree och Warburg effekter2,3. Effekten Crabtree kännetecknas av en ökning av glycolytic flux, förtryck av mitokondriell andning, och inrättandet av jäsning som den primära vägen att generera ATP i närvaro av höga koncentrationer av jäsbara kolhydrater (> 0,8 mM)4,5. Warburg effekten är metaboliskt analoga Crabtree resonemang, med skillnaden att i däggdjursceller, den viktigaste produkten av jäsning är laktat6. Faktiskt, Warburg effekten ställs ut av en mängd olika cancerceller, utlöser glukosupptag och konsumtion även i närvaro av syre7. Därmed, har studera den molekylära basen för växeln från andning att jäsning i Crabtree effekt både biotekniska återverkningar (för etanolproduktion) och potentiella effekter i cancerforskning.
S. cerevisiae tillväxt kan vara ett lämpligt verktyg att studera Crabtree och Warburg effekterna. Denna idé är baserad på det faktum att den jäst exponentiella fasen, de centrala vägar som används för att producera ATP är mitokondriell respiration och jäsning, som är nödvändiga för att upprätthålla tillväxten. Till exempel är tillväxten av S. cerevisiae intimt förknippad med funktionen av ATP-genererande vägar. I S. cerevisiae, mitokondriell respiration producerar cirka 18 ATP molekyler per glukos molekyl, medan jäsning genererar endast 2 ATP molekyler, förväntas därav att tillväxttakten har snäva länkar med metaboliska vägar producera ATP8. I detta avseende när jäsningen är den främsta vägen att generera ATP, kompenserar jästen låg ATP produktionen genom att öka andelen glukosupptag. Tvärtom, är glukos förbrukning av jästceller som använder mitokondriell andning som ATP huvudkällan låg. Detta indikerar att det är viktigt för jästen att sense kolhydrat tillgänglighet innan man kan avgöra hur ATP kommer att genereras. Därför glukos tillgänglighet spelar en viktig roll i övergången mellan jäsning och mitokondrie respiration i S. cerevisiae. I närvaro av stora mängder glukos föredrar jästen jäsning som den centrala vägen att generera ATP. Intressant, när jästen jäsa, upprätthålls specifika tillväxttakten vid högsta. Däremot, under låga nivåer av glukos producerar S. cerevisiae ATP med hjälp av mitokondriell respiration, upprätthålla lägre tillväxttakt. Därmed, variation i koncentrationen av glukos och användning av andra kolkällor framkalla förändringar i jästens preferens mellan fermentativa och respiratoriska tillväxt. Genom att beakta detta faktum med ekvationen exponentiell tillväxt, kan man få biologiska innebörden av kinetiska parametrar såsom fördubbling tid (Dt) och tillväxthastighet (µ). Till exempel hittades lägre µ värden när jästen använder mitokondriell andning som den primära vägen. Tvärtom, under förhållanden som gynnar jäsningen, hittades högre µ värden. Denna metod kan användas för att mäta de sannolika mekanismerna av kemikalier som påverkar jäsning och mitokondrie respiration i S. cerevisiae.
Syftet med denna uppsats är att föreslå en metod baserad på tillväxt kinetik för screening effekterna av en viss substans/förening på mitokondriell andning eller jäsning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4353</td>
			<td style="width:167px;">For inoculum incubation or conical fask cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bioscreen&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Growth curves</td>
			<td style="width:119px;">C MBR</td>
			<td>For batch cultures in microplates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Peptone from casein, enzymatic digest</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">82303</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">09182-1KG-F</td>
			<td>For YPD broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacteriological Agar</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A5306</td>
			<td>For YPD agar preparation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>S8282</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(NH4)2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A4418</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Y1251</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Yeast synthetic drop-Out medium supplements</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Y1501</td>
			<td>For SC broth preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium sulfate granular</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">0792-R</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resveratrol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">R5010</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Galactose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td>G8270</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S7903</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Absolut ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Merck</td>
			<td align="right">107017</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">J.T. Baker</td>
			<td>2136-01</td>
			<td>For medium supplementation example</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Honeycomb microplates</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">9502550</td>
			<td>For microplate cultures</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

saccharomyces cerevisiae exponential growth kinetics in batch culture to analyze respiratory and fermentative metabolism

Saccharomyces cerevisiae celler i den exponentiella fasen upprätthålla sin tillväxt genom att producera ATP genom jäsning och/eller mitokondrie respiration. Jäsbara kolhalten reglerar främst hur jästceller generera ATP; Således driver variationen i jäsbara kolhydrater nivåer energisk metabolismen av S. cerevisiae. Detta dokument beskriver en hög genomströmning metod baserad på exponentiell jäst tillväxt att uppskatta effekterna av koncentrationen förändringar och naturen av kol källan på andningsorganen och fermentativa metabolism. Tillväxten av S. cerevisiae är mätt i en mikroplattan eller skakas koniska kolven genom bestämning av den optiska densiteten (OD) på 600 nm. Sedan byggs en tillväxtkurva genom plotting OD kontra tid, vilket gör att identifiering och val av den exponentiella fasen, och är utrustad med exponentiell ekvation att få kinetiska parametrar. Låg specifik tillväxt med högre fördubbling gånger representerar vanligtvis en respiratorisk tillväxt. Däremot indikerar högre specifik tillväxt med lägre fördubbling gånger fermentativa tillväxt. Tröskelvärden för fördubbling tid och tillväxthastighet är beräknat med välkända luftvägs- eller fermentativa villkor, såsom icke-jäsbara kolkällor eller högre koncentrationer av jäsbara sockerarter. Detta erhålls för varje specifik stam. Slutligen, de beräknade kinetiska parametrarna jämförs med tröskelvärdena att fastställa huruvida jästen visar fermentativa eller respiratorisk tillväxt. Fördelen med denna metod är dess relativa enkelhet för att förstå effekterna av en substans/förening på fermentativa eller respiratorisk metabolism. Det är viktigt att betona att tillväxt är en invecklad och komplicerad biologisk process. preliminära data från denna metod måste därför styrkas genom kvantifiering av syreförbrukning och ackumulering av jäsning biprodukter. Därmed, kan denna teknik användas som en preliminär genomgång av föreningar/ämnen som kan störa eller förbättra fermentativa eller respiratorisk metabolism.

Tillväxtkurvorna kan användas för att preliminärt diskriminera respiratoriska och fermentativa fenotyper i S. cerevisiae jästen. Därför vi utfört batch kulturer av S. cerevisiae (BY4742) med olika glukos koncentrationer som har rapporterats inducera fermentativa tillväxt: 1%, 2% och 10% (w/v)9. Kulturer visar en fermentativa fenotyp har en liten fördröjning och en exponentiell fas med en hög tillväxttakt (figur 1<...

Watch this Scientific Journal Video about Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism at JoVE.com

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae Exponentiell tillväxt Kinetics i Batch kultur att analysera respiratoriska och fermentativa Metabolism

Här presenterar vi ett protokoll för att uppskatta respiratoriska och fermentativa ämnesomsättningen genom att montera den exponentiella tillväxten av Saccharomyces cerevisiae till ekvationen exponentiell tillväxt. Beräkning av de kinetiska parametrarna tillåter för screening av påverkan av ämnen/föreningar på jäsning eller mitokondrie andning.

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom de biotekniska och biomedicinska områden som vad som är den molekylära grunden bakom Warburg och Crabtree effekter. Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter den höga genomströmningsstudien av effekterna av vissa ämnen i respiratorisk och fermentativ metabolism. Börja med att inokulera en 15-milliliter koniska rör som innehåller tre milliliter av sval, steril 2%jästextrakt peptone dextrose, eller YPD buljong, med 250 mikroliter av S.cerevisiae jästceller bevaras i glycerol vid negativa 20 grader Celsius.Inkubera jästen över natten i en orbital shaker vid 30 grader Celsius och 200 rpm. för strimmor på en 60-milliliter, 2% YPD agar-fylld Petriskål nästa morgon. Odla skålen vid 30 grader Celsius tills isolerade kolonier observeras.Sedan inokulera en enda isolerad koloni i ett nytt koniskt rör som innehåller 10 milliliter av sval, steril 2%YPD buljong för övernattning kultur vid 30 grader Celsius med skakningar. För mikroplatttillväxt-kurvinställning, tillsätt 145 mikroliter av ett lämpligt experimentellt kulturellt medium till varje brunn av en steril 10-gånger-10 brunnsmikroplatta med lock och inokulera varje brunn med fem mikroliter av övernattningskulturen. Sedan inkubera multi-well plattan i en mikroplatt läsare vid 30 grader Celsius med konstant agitation vid 200 rpm i 48 timmar, mätning av den optiska densiteten vid 600 nanometer var 30 eller 60 minuter.För skakad konisk kolvtillväxt-kurva setup, inokulera 20 milliliter koniska kolvar innehållande 4,8 milliliter av en lämplig steril odling media med 200 mikroliter av pre-inokutur kultur vid en 600 nanometer optisk densitet av två för inkubation vid 30 grader Celsius och 250 rpm. Agitation vid 250 varv per minut är avgörande för att uppnå en lämplig tillväxt i låga koncentrationer av kolkällor som utövar luftvägarna tillväxt som vi har observerat en minskad jäst tillväxt i andningsbesvär vid lägre agitation hastigheter. För att möjliggöra mätning av den optiska densiteten vid 600 nanometer varannan timme i 24 timmar späds 100 mikroliter av den skakade koniska kolvkulturen i 900 mikroliter av destillerat vatten i en en-milliliter spektrofotsvrostett och blanda försiktigt genom pipetter.För databearbetning, i en lämplig statistisk paket programvara, skapa en ny projektfil, öppna den nya tabellen och grafmenyn, och välj XY. Under exempeldatamenyn väljer du börja med en tom datatabell och en punkter och anslutningslinjegraf. Låt X-avsnittet vara omarkerat i delkolumner för replikat eller felvärden. I avsnittet Y väljer du ange 10 replikatvärden i delkolumnerna sida vid sida och tomt medelvärde och fel-SD. Klicka sedan på skapa.Ange vid vilken tidpunkt OD-mätningarna erhölls i X-kolumnen och de OD-värden som erhållits från kulturerna i kolumnen Y. Om du vill identifiera den exponentiella tillväxtfasen omvandla Y-kolumndata till logaritmer klickar du på analysera och markerar transformeringens analys. Använd Y är lika med logg Y för att välja Y-värdena och öppna galleriet med resultat.Markera transformeringsdatatabellen, klicka på analysera och välj den linjära regressionsanalysen, exklusive de optiska densitetsvärdena som inte följer en linjär trend genom att välja värdena i tabellen och deprimerande kontroll och E.In galleriet med datatabeller, markera data en tabell och klicka på analysera. Välj den icke-linjära regressionskurvans passningsanalys och de datamängder som ska analyseras och klicka på OK. Använd sedan minst rutor som passar till data, lämnar interpolera avsnittet omarkerat och klicka på OK. Därefter öppnar du en ny projektfil och i den nya tabell- och grafmenyn väljer du kolumnvalet, börjar med en tom datatabell och önskad graf. Ställ in grafen för att rita medelvärdet med standardavvikelsen och klicka på skapa.Kopiera värdena för medelvärde eller deltatid från tabellen icke-linjära passningsresultat i galleriet med resultat och klistra in data i en kolumn. Slutligen, klicka på analysera och välj analys av intresse i kolumnen analyser menyn för att jämföra de kinetiska parametrarna för de olika nutrimental villkor. Tillväxtkinetiska tröskelvärdena varierar mellan starka sidor och måste utvärderas enligt de förutsättningar som vi använder i analysen.Kulturer som demonstrerar en fermentativ fenotyp har en liten lag-fas och en exponentiell fas med en hög tillväxthastighet. Kulturer som erhåller energi främst genom oxidativ fosforylering uppvisar en längre laggfas med långsam tillväxttakt under den exponentiella fasen. Beräkning av den specifika tillväxthastigheten och fördubblingstiden för tillväxtkurvorna med hjälp av den exponentiella tillväxtekvationen möjliggör fastställande av tröskelvärden för de respiratoriska och fermentativa tillväxtvärdena.Till exempel, i dessa representativa experiment, effekterna av olika resveratrol koncentrationer på S.cerevisiae BY4742 celler avslöjar modifieringen av cellen energisk status som svar på varierande glukos koncentrationer. Här, tillskott med 10%glukos visar att lägre koncentrationer av ammonium gynna fermentativ metabolism som framgår av en utökad exponentiell tillväxt fas i dessa kulturer, medan en högre koncentration inducerar en respiro-fermentativ metabolism som framgår av en utökad lagfas och en långsammare tillväxthastighet under den exponentiella fasen. Slutligen kan robusta skillnader i fermentativa fördubblingstidsvärden observeras mellan dessa två olika jäststammar som odlas under samma förhållanden, vilket belyser nödvändigheten av att validera fördubblingstidströskeln för varje analyserad stam.Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att detta protokoll endast används för att sås ut fenotyp. De specifika effekterna på respiration och jäsning måste bekräftas av syreförbrukningsanalyser eller genom ackumulering av fermentationsbiprodukter respektive.

Research

JoVE Journal

Biology

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissekering av Saccharomyces cerevisiae ASCI

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Kvantitativa Phosphoproteomics i Fatty Acid Stimulerade Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analys för Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

En fluorescensmikroskopi-analys för övervakning Mitophagy i jästen Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Kopplade Analyser för övervakning Proteinåterveckningssteg i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Kombinera Magnetisk Sortering av Mother celler och fluktuationer Tester för att analysera arvsmassan Instabilitet Under Mitotisk Cell Aging in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Snabb Identifiering av kemiska genetiska interaktioner i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Tillväxt baserade Bestämning och biokemisk Bekräftelse av genetiska Krav för proteinnedbrytning i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Riktad evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant bibliotek Skapande och screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...