Name: generating recombinant avian herpesvirus vectors with crispr/cas9 gene editing
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

Les auteurs remercient Pippa Hawes pour aider avec l’imagerie confocale. Ce projet a été soutenu par la biotechnologie et les Biological Sciences Research Council (BBSRC) subventions BBS/E/I/00007034 et BB/L014262/1.

1. préparation des Cas9/gRNA Expression et construit des donateurs
<ol><li>
Construction des plasmides d’expression Cas9/gRNA
	<ol>
<li>Concevoir une séquence gRNA ciblant la région intergénique entre les gènes UL45 et UL46 de HVT comme décrit plus haut22. Aligner la séquence cible de guide-RNA contre le génome HVT pour écarter toute séquence hors cible potentielle dans le génome HVT. Synthétiser et cloner la séquence gRNA ciblant la région UL45/46 et sg-une séquence de données publiées23 dans pX459-V2 comme décrit plus haut22. Vérifier la séquence clonée gRNA par Sanger séquençage à l’aide de l' apprêt de U6-Fwd24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Construction du plasmide donneur
	<ol>
<li>Pour générer un plasmide donneur contenant la cassette d’expression VP2 taggée une cassette amovible de journaliste GFP, concevoir des oligos donneur-F et donateurs-R contenant les éléments suivants (Figure 1A et Figure 3A) : une sg-A séquence cible aux deux extrémités, un site de PacI, flanqué de deux séquences de LoxP pour le clonage de GFP journaliste cassette et l’excision et deux sites de SfiI pour le clonage de la cassette d’expression VP2.</li>
		<li>Clonez la séquence dans un vecteur pGEM-T-easy et, ensuite, cloner les gènes cassettes GFP et VP2 dans le vecteur résultant pour générer le plasmide donneur désigné comme pGEM-sgA-GFP-VP222. Remarque : N’importe quel vecteur de clonage peut être utilisé pour construire le plasmide de donateurs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation d’ADN plasmidique
	<ol>
<li>Préparer les plasmide donneur et Cas9/gRNA expression plasmide DNAs à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commercial selon les instructions du fabricant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CRISPR/Cas9-mediated Knock-in : Transfection et l’Infection
<ol><li>La veille de la transfection, préparer des fibroblastes d’embryons de poussins (CEFs) pour la transfection/infection, utilisant des embryons vieux de 10 jours, dans un milieu M199 additionné de 5 % sérum fœtal (SVF), 10 % bouillon tryptose phosphate, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine, et fungizone 0,25 µg/mL. Graine de 1,3 x 106 cellules / puits dans chaque puits d’une plaque de 6 puits en 2,5 mL de milieu. Remarque : Les cellules CEF peuvent être conservés pendant 3 jours à 4 ° C.</li>
	<li>Transfecter cellules CEF (document établi en étape 2.1) avec 0,5 µg de UL45/46-gRNA, 0,5 µg de sg-A et 1 µg de pGEM-sgA-GFP-VP2, utilisant un réactif approprié transfection selon les instructions du fabricant. Incuber les cellules pendant 12 h dans un incubateur (à 38,5 ° C, avec 5 % de CO2).</li>
	<li>posttransfection de 12 h de plasmides Cas9/gRNA et donateurs, diluer le stock de virus HVT avec milieu de culture M199 à 1 x 105 UFP/mL. Ajoutez 130 µL du virus dilué dans chaque puits des cellules transfectées et un puits de cellules celllulaire comme témoin négatif avec la même quantité de virus. Incuber les cellules transfectées/infectés pendant 3 jours à 38,5 ° C, avec 5 % de CO2. Effectuer toutes les procédures en utilisant le Code de conduite commun (JCoPR) approuvé par les bailleurs de fonds.</li>
</ol>3. la récolte et la Purification du Virus Recombinant HVT
<ol><li>
Fluorescence-lancée de cellules tri
	<ol>
<li>Préparer deux plaques à 96 puits préconfigurées avec 2 x 104 cellules CEF par bien le jour avant le tri.</li>
		<li>Trypsinize transfectées/infectés CEFs 3 d après l’infection. Aspirer le milieu de chaque puits et rincez la plaque de cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA (0,48 mM) pour trypsinize les cellules dans un incubateur à 38,5 ° C pendant environ 5 min.</li>
		<li>Resuspendre et transférer les cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL avec 50 µL de FBS. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS avec 1 % FBS. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajuster le nombre de cellules à 1 x 106 cellules/mL. Remarque : Les cellules peuvent être conservés sur glace pendant 1-2 h.</li>
		<li>Les cellules de transfert à un polystyrène tri tube par l’intermédiaire de son plafond de crépine. Trier les cellules individuelles exprimant GFP dans des plaques de 96 puits ensemencés avec CEFs utilisant le trieur de cellules selon les instructions du fabricant. Incuber les cellules triées pour 5D à 38,5 ° C, avec 5 % de CO2. Remarque : Un passage du virus recombinant peut-être être nécessaires avant le tri si il y a trop de cellules individuelles de GFP-expression et quelques plaques de GFP-positifs dans le puits original.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passage des virus recombinants
	<ol>
<li>Préparer les plaques 6 puits ensemencés avec 1,3 x 106 cellules CEF par bien le jour avant le passage. 5 d postsorting, contrôlez les plaques 96 puits sous un microscope à fluorescence. Marquer les puits contenant une seule plaque de GFP-positif. Remarque : Voir la Figure 2A pour une plaque représentante de GFP-positif.</li>
		<li>Trypsinize chaque GFP-positif bien avec 50 µL de trypsine-EDTA pendant 3 min, ajouter 50 µL de milieu de culture, resuspendre et transférer les cellules dans un puits d’une plaque de 6 puits avec CEFs. Il s’agira de la première génération de recombinant HVT.</li>
		<li>La récolte de la première génération de virus recombinants, 3 jours plus tard, geler dans un flacon de chaque dans 1 mL de congélation moyen contenant du sérum de veau foetal 10 % (FCS), 10 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) et milieu de culture de 80 % et stocker les virus dans l’azote liquide. Remarque : Le moment de la récolte varie de 2-4 d selon la capacité de montant et de la prolifération du virus.</li>
		<li>Prélever des cellules5 1 x 10 de chaque première génération de virus, centrifuger à eux et éliminer le surnageant. Stocker les cellules à-20 ° C pour l’extraction de l’ADN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Détection d’insertion génomique par polymerase chain reaction
	<ol>
<li>Pour l’extraction de l’ADN, dégivrez et resuspendre le culot de cellules de l’étape 3.2.4 avec 50 µL d’empiète sur le tampon (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1mM EDTA, 25 mM NaCl et 200 µg/mL de protéinase K) et lyser les échantillons à 65 ° C pendant 30 min et , puis, à 95 ° C pendant 2 min inactiver la protéinase k</li>
		<li>Effectuer une réaction en chaîne par polymérase (PCR) avec 3' jonction des amorces (tableau 1) à l’aide de 1 µL de l’échantillon d’ADN. Pour chaque échantillon, préparer le mélange de réaction suivant 20 µL sur glace : 2 x PCR Master Mix (10 µL) et 10 amorce en amont µM (0,5 µL), 10 amorce en aval µM (0,5 µL), matrice d’ADN (1 µL) et eau exempte de nucléase (8 µL). Le programme d’amplification est : 95 ° C pendant 2 min ; 95 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 40 s pour 35 cycles ; 72 ° C pendant 7 min. charge 2 µL des produits d’amplification d’un puits du gel d’agarose de 1 % pour l’électrophorèse sur gel. Remarque : Voir la Figure 2A , pour un résultat représentatif de la jonction 3' PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. l’excision du gène rapporteur Fluorescent via la Cre-lox système
<ol><li>Pour supprimer le gène de la GFP le virus recombinant, transfecter 2 µg de plasmide d’expression recombinase Cre dans la plaque de 6 puits préconfigurée avec des cellules CEF, utilisant un réactif de transfection suivant les instructions du fabricant.</li>
	<li>posttransfection de 12 h, décongeler un flacon de virus recombinant de l’azote liquide, resuspendre doucement, 50 µL de graines dans chaque puits de cellules transfectées et définir un puits comme contrôle négatif avec la même quantité de virus. Incuber pendant 3 jours à 38,5 ° C, avec 5 % de CO2.</li>
</ol>5. plaque Purification
<ol><li>
Fluorescence-lancée de cellules tri
	<ol>
<li>Plaques à 96 puits deux semences avec 2 x 104 cellules CEF par bien le jour avant le tri.</li>
		<li>Suivez les procédures décrites dans l’étape 3.1 72 h après l’infection (de l’étape 4) pour préparer les cellules infectées pour le tri. Trier les cellules nonfluorescence unique dans des plaques de 96 puits ensemencés avec CEFs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passage des virus recombinants et confirmation par PCR
	<ol>
<li>Choisissez 5 à 10 nonfluorescence unique plaques 5D postsorting, leur trypsinize avec 50 µL de trypsine-EDTA à 38,5 ° C pendant 3 min et ajouter 50 µL de milieu de culture pour remettre en suspension les cellules. Remarque : Voir la Figure 2B pour une plaque représentante de GFP-négatif.</li>
		<li>Passer la moitié des cellules dans chaque puits d’une plaque de 6 puits préconfigurée avec CEFs comme la deuxième génération.</li>
		<li>Centrifuger les cellules restantes de chaque clone à 200 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 50 µL d’empiète sur le tampon d’extraction de l’ADN.</li>
		<li>Effectuer le PCR avec des amorces 5' junction (tableau 1) à l’aide de 1 µL de matrice d’ADN avec le même état de réaction PCR comme indiqué au point 3.3.2. Remarque : Voir la Figure 2B pour un résultat représentatif de 5' jonction PCR.</li>
		<li>Selon les résultats PCR, choisir trois à cinq clones positifs de HVT recombinante de passages supplémentaires et de vérification.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. vérification de la recombinaison HVT
<ol><li>
Test d’immunofluorescence indirecte
	<ol>
<li>Infecter les CEFs avec la deuxième génération de recombinant que HVT obtenu à l’étape 5.2 dans la plaque 24 puits ensemencé avec 2. 5 x 105 CEFs le jour avant l’infection. Supprimer la cellule milieu de culture 48 h après l’infection et ajouter 500 µL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pour fixer les cellules. Incuber les plaques à température ambiante pendant 30 min, puis, enlever le fixateur et laver la couche de cellules 3 x avec du PBS. Remarque : Les cellules peuvent être conservés à 4 ° C à cette étape pendant plusieurs semaines.</li>
		<li>Retirer le PBS et ajouter 500 µL de 0,1 % de Triton X-100 pour permeabilize les cellules pendant 15 min. laver la cellule couche 3 fois avec du PBS.</li>
		<li>Liaison non spécifique de bloc en ajoutant un tampon de blocage (5 % de sérum bovin dans du PBS) pendant 1 h.</li>
		<li>Diluer l’anticorps monoclonal anti-VP2 anticorps primaire HH7 ou HVT-infectés par le sérum de poulet au 1 : 200 dans un tampon bloquant, ajouter 200 µL / puits et incuber à température ambiante pendant 1 h. laver la cellule couche 3 x avec du PBS.</li>
		<li>Diluer l’anticorps secondaire chèvre anti-souris IgG Alexa 568 ou d’anti-poulet IgG Alexa 488 au 1 : 200 dans un tampon bloquant de la chèvre, ajouter 200 µL / puits, incuber à température ambiante pendant 1 heure et laver les cellules 3 x avec du PBS. Contrôler l’expression de la protéine sous le microscope de fluorescence. Remarque : Voir la Figure 4 pour une VP2 représentant résultat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Séquençage du gène VP2
	<ol>
<li>Amplifier la séquence d’ADN couvrant la région intergénique, UL45 et UL46, avec haute fidélité ADN polymérase et amorces UL45-F1 et UL46-R1 (tableau 1) pour détecter l’insertion entière.</li>
		<li>Préparer le mélange de réaction de 50 µL suivants : 5 µL de 10 x Pfx mélange réactionnel, 1,5 µL de 10 µM en amont et mix amorce en aval, 1 µL du mélange dNTP 10 mM, 1 µL de 50 mM MgSO4, 1 µL de matrice d’ADN et 0,5 µL de Pfx ADN polymérase et ajouter de l’eau exempte de nucléase à 50 µL. Le programme d’amplification est : 95 ° C pendant 2 min ; 95 ° C pendant 15 s, 55 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 3 min pour 35 cycles. Charger tous les produits PCR au gel d’agarose à 1 % pour l’électrophorèse sur gel.</li>
		<li>Purifier le produit PCR suit l’instruction d’un kit de purification de gel ADN. Envoyer 10 µL du produit PCR (30 ng/µL) à une société de séquencement pour confirmer le knock-in du gène VP2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. stabilité du Virus Recombinant
<ol><li>Semences 2,6 x 106 CEF cellules dans chaque fiole T25 le jour avant l’expansion du virus.</li>
	<li>Décongeler au moins trois clones positifs de l’étape 5.2 ; ajouter un flacon de cellules/virus dans chaque fiole T25. Incuber à 38,5 ° C, avec 5 % de CO2 jusqu'à ce qu’on observe un effet cytopathique 50 %.</li>
	<li>Récolter les cellules dans 2 mL de milieu de culture ; infecter 50 µL dans un nouveau ballon T25 préconfigurée avec des cellules du corps expéditionnaire canadien pour la prochaine génération. Garder de passage le virus recombinant au moins 15 générations. Analyser chaque génération de virus par PCR pour la présence de la séquence VP2 et par dosage de l’immunofluorescence indirecte (IFA) pour l’expression VP2 évaluer la stabilité des virus recombinants.</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+repair:+53BP1+comes+into+focus.">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway.">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le système CRISPR/Cas9 est devenu un outil précieux dans l’édition de gène. Les technologies traditionnelles de recombinant vecteur de développement HVT, tels que la recombinaison homologue13 et BAC mutagénèse technologie25, impliquent généralement plusieurs séries de vecteur de clonage et de la sélection, ainsi que d’un dépistage à grande échelle, ce qui peut prendre plusieurs mois. Le protocole décrit ici en utilisant une stratégie NHEJ-CRISPR/Cas9-based combinée avec le système Cre-Lox et monocellulaires tri est une approche plus pratique, plus rapide et efficace dans la production de vaccin recombinant. À l’aide de ce gazoduc, le virus recombinant puisse être obtenu dans seulement 1 à 2 semaines24et étapes de purification de plaque peuvent aussi être réduites à une séparation de la tour à l’aide de fluorescence-lancée de cellules tri17. L’ensemble du processus, de gRNA construction design et donateurs pour obtenir le virus HVT recombinant purifié, peut être réalisé au cours du mois. Les étapes critiques de génération réussie à HVT recombinante comprennent le choix de haute efficacité gRNA afin de cibler le génome viral afin d’assurer un clivage efficace pour l’insertion de gènes étrangers, l’efficacité de transfection élevé pour maximiser les chances de Cas9 / gRNAs et le virus de se réunir à la même cellule pour l’édition et l’intervalle de 12 heures entre la transfection des plasmides donneur et gRNA et l’infection virale d’autoriser Cas9 et gRNA à s’exprimer à un niveau raisonnable avant que le virus pénètre dans les cellules.
La limitation pour la génération de recombinant HVT est que la complexité de l’identification de GFP-positifs des clones de jonction PCR. Les cassettes de GFP-VP2 pouvaient être insérés soit l’orientation. La jonction que PCR décrite ici est seulement pour l’identification de l’insert dans l’orientation de sens. Dans le cas de l’insert dans l’orientation antisense, PCR en utilisant les paires d’amorces décrites ne fonctionnerait pas, et les amorces internes pourraient être échangés à cet effet. Un autre problème potentiel est que la construction de donateurs ne peut servir pour l’insertion d’un gène dans le même virus en raison de l’existence de la séquence LoxP restante après l’enlèvement de la GFP par traitement de Cre. Une nouvelle construction de donneur avec une variante LoxP séquence pourrait servir au lieu de cela dans un but d’insertion multiple.
NHEJ et HDR (réparation axés sur l’homologie) sont les deux voies pour réparer les ruptures de double-brin (CDB) créés par Cas926,27. NHEJ est plus efficace lorsqu’il se produit tout au long du cycle cellulaire28, alors que le HDR est moins efficace et se produit seulement pendant S et G2 phases6,29,30. Nous avons exploité la voie de réparation NHEJ plus efficace ici pour introduire des gènes étrangers dans les endroits ciblés. Bien que le NHEJ de réparation peut-être introduire des indels en rejoignant les extrémités d’ADN endommagées ou incompatibles à une homologie indépendant mécaniquement flexible processus31,32 entre les séquences clivées donneur et l’ADN génomique, les indels peut se produire uniquement sur les sites de clivage du sgA, et la cassette d’expression génétique étrangère n’est pas affectée. Un autre avantage de cette approche est que NHEJ est exempt de la restriction de la construction de l’homologie de bras, faisant le clonage étape très simple. Ceci amène un grand potentiel pour l’application de NHEJ pour l’insertion de gènes étrangers. La mise en place d’un site cible de gRNA universelle à la fois termine du gène étranger cassette rend le processus plus rapid que le modèle de donateurs pourrait être construit tout de suite sans avoir besoin de sélection spécifique gRNA. L’épine dorsale du plasmide contenant des sites cibles de sgA, LoxP sites et sites PacI et SfiI donateurs peut également être partagé largement entre gènes rapporteurs différents, l’expression des gènes étrangers-cassettes et vecteurs de virus différents, donnant à cette nouvelle approche l’avantage de personnalisation.
L’insert VP2 HVT-qui était utilisé pour décrire le protocole dans ce manuscrit ; Cependant, la même approche peut servir à insérer plus de gènes viraux à différents endroits de génomiques du génome HVT en utilisant le gRNA ciblant la séquence correspondante souhaitée pour le développement de vaccins multivalents de HVT vecteur recombinants. Autres souches vaccinales MDV, tels que les SB-1 et CVI988, autres herpèsvirus aviaires, y compris la laryngotrachéite infectieuse virus virus de canard entérite et aussi autres virus ADN aviaires, tels que les virus de la variole et des adénovirus, peuvent également être conçues à l’aide de la même approche pour le développement d’un vaccin recombinant multivalent. Le développement de nouveaux vaccins vectorisées multivalents utilisant la plate-forme du système CRISPR/Cas9 décrite ici sera très bénéfique pour l’industrie de la volaille pour se protéger contre plusieurs maladies de la volaille.

Maladie de Marek (MD) est une maladie lymphoproliférative des poulets induite par le sérotype 1 (Gallid Herpesvirus 2 [GAHV-2]) du genre Mardivirus dans la sous-famille Alphaherpesvirinae. Mardivirus comprend également deux sérotypes non pathogènes : sérotype 2 (GaHV-3) et le sérotype 3 (MeHV-1, historiquement connu comme HVT) qui sont utilisés comme vaccins contre MD Vaccin HVT vivant (souche FC-126) est la première génération de vaccin de MD utilisé dans les années 1970 et est encore utilisé couramment dans les formulations de vaccin bivalent et polyvalente pour fournir une protection accrue contre les MD HVT est aussi largement utilisé comme un vecteur de vaccin d’induire la protection contre un certain nombre de maladies aviaires en raison de sa polyvalence et de sécurité pour ovo et administration sous-cutanée écloserie tant en capacité de fournir une immunité permanente. La stratégie visant à générer des vaccins recombinants HVT repose sur deux classique recombinaison homologue dans les cellules infectées par le virus, qui se chevauchent cosmide DNAs ou BAC mutagénèse2. Cependant, ces méthodes sont généralement longues et fastidieuses, nécessitant la construction de vecteurs de transfert, le maintien du génome viral dans Escherichia coli, des purifications plaque et la suppression de la séquence de BAC et de la sélection marqueur du virus édité3,4.
CRISPR/associés (Cas9) est le gène plus populaire outil d’édition ces dernières années en raison de sa polyvalence et sa spécificité. Le système CRISPR/Cas9 a été utilisé avec succès dans la génération efficace des cellules génétiquement modifiées et des modèles animaux5,6,7,8,9,10, ainsi que dans la manipulation de plusieurs virus à ADN grands génomes11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20. Après avoir signalé une méthode simple et efficace, utilisant le système CRISPR/Cas9 pour modifier le génome HVT21, nous avons développé un pipeline pour la génération rapide et efficace de recombinant HVT22.
Afin de prolonger l’application potentielle de cette méthode, nous décrivons la méthodologie détaillée pour la génération de recombinaison vaccin HVT exprimant le gène VP2 de IBDV au locus UL45/46 dans le présent rapport. L’approche combine NHEJ-CRISPR/Cas9 pour insérer le gène VP2 taggé gène rapporteur GFP et un système de Cre-LoxP pour enlever la cassette d’expression de GFP plus tard. Par rapport aux traditionnelle recombinaison et BAC recombineering techniques, nous démontrons que NHEJ-CRISPR/Cas9 ainsi qu’un système de Cre-Lox est une approche rapide et efficace pour produire le vaccin HVT recombinant.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:988px;" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">M199 medium, Earle&#39;s Salts</td>
			<td style="width:221px;">Life technology</td>
			<td style="width:163px;">11150059</td>
			<td style="width:235px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140148</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td>antifunigal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptose Phosphate Broth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8782</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HVT Fc126 strain</td>
			<td>Avian Disease and Oncology Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>wildtype HVT virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pX459-v2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #62988</td>
			<td>Cas9 and gRNA expression vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-T Easy Vector Systems</td>
			<td>promega</td>
			<td>A1360</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Subcloning Efficiency DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>rR0547S</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SfiI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0123S</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-X2</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 6004</td>
			<td>transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture 6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Master Mixes</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td>junction PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum Pfx DNA Polymerase</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11708021</td>
			<td>PCR amplification of full insert</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>immunoflourescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td>immunoflourescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica TCS SP5 LASAF</td>
			<td>immunoflourescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS cell sorter</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>BD FACSAria</td>
			<td>single cell sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (4% in PBS)</td>
			<td>Santa cruz biotechnology</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td>cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30960</td>
			<td>permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating recombinant avian herpesvirus vectors with crispr/cas9 gene editing

HERPESVIRUS de dindons et dindes (HVT) est un vecteur viral idéal pour la génération de vaccins recombinants contre un certain nombre de maladies aviaires, telles que l’influenza aviaire (Ia), la maladie de Newcastle (ND) et la bursite infectieuse (EIA), à l’aide de chromosomes artificiels bactériens ( BAC) par mutagénèse ou par les méthodes conventionnelles de recombinaison. Le cluster régulièrement entrecoupées de répétitions palindromiques (CRISPR) / Cas9 système a été utilisé avec succès dans de nombreux contextes pour l’édition de gène, y compris la manipulation de plusieurs génomes de gros virus à ADN. Nous avons développé un rapid et efficace CRISPR/Cas9-mediated génome édition pipeline pour générer recombinant HVT. Afin de maximiser l’utilisation potentielle de cette méthode, nous présentons ici des informations détaillées sur la méthodologie de production HVT recombinant exprimant la protéine VP2 de IBDV. La cassette d’expression VP2 est insérée dans le HVT génome via un NHEJ (fin-joining non-homologues)-voie de réparation dépendants. Une cassette d’expression de protéine (GFP) fluorescence verte est d’abord attachée à l’insertion pour faciliter la visualisation et ensuite retiré par la Cre-LoxP système. Cette approche offre un moyen efficace d’introduire d’autres antigènes viraux dans le génome HVT pour le développement rapide des vaccins recombinants.

La stratégie utilisée pour la production du vaccin HVT recombinante est décrit dans la Figure 1, qui comprend comment le plasmide donneur est construite (Figure 1A) et les procédures pour générer le recombinant HVT (Figure 1B ). Plaques de GFP-positif de cinq à trente entourés de plaques de type sauvage peuvent être observés dans le gène frapper-dans puits sous le posttransfection de fluorescence microscope 3 d - infection. Le virus purifié obtenu après que unicellulaires tri (Figure 2A) a été analysée par 3' jonction PCR, qui montre un produit PCR de la taille attendue (Figure 2A, panneau inférieur). Après l’excision du reporter GFP par recombinase Cre, plus de 50 % des plaques perdu leur expression de la GFP. La plaque purifiée après l’excision de la GFP (Figure 2B) en triant les unicellulaires a été confirmée par la jonction 5' PCR, qui montre le produit PCR de bonne taille (Figure 2B, panneau inférieur). La figure 3 montre les résultats du séquençage des deux jonction produits PCR avec différents éléments colorés. Dans la Figure 4, l’expression de la protéine a été confirmée par IFA avec l’anticorps monoclonal spécifique au VP2 et anti-HVT poulet sérum. Comme prévu, cellules infectées par le HVT parental peuvent seulement être teintés par le sérum anti-HVT (verts), tandis que les cellules infectées par HVT recombinantes montrent clairement l’expression du gène VP2 (rouge).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig1.jpg"> Figure 1: stratégie pour la génération d’une recombinaison vaccin HVT-guidé. (A), ce tableau montre une représentation schématique de la stratégie de clonage pour donneur construction plasmidique. Les principaux éléments sont les deux sites cibles de Cas9 (sgA) pour libérer la cassette d’expression VP2 d’insertion et une cassette GFP journaliste flanqué de séquences LoxP pour l’excision de GFP. (B), ce panneau affiche une vue d’ensemble d’une stratégie en deux étapes gène knock-in. Le fragment d’insertion de la GFP et les cassettes d’expression VP2 est libéré par clivage Cas9/sgA et inséré dans le génome HVT à UL45/46 loci via NHEJ-CRISPR/Cas9. Le virus recombinant GFP-positif est ensuite trié et purifié par la seule cellule activée par fluorescence cellulaire triant (FACS). Par la suite, le gène rapporteur GFP est excisé par recombinase Cre et le virus recombinant est purifié et caractérisé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig2.jpg"> Figure 2 : Vérification de la recombinaison HVT. (A) ce panneau montre une plaque de GFP-positive (HVT-GFP-VP2) visualisée sous le microscope de fluorescence (panneau supérieur) et au contrôle de PCR de HVT-GFP-VP2 avec amorces VP2-F & UL46-R1 pour la jonction 3'. ()B) ce panneau indique une plaque (HVT-VP2) visualisée après l’excision de la GFP de HVT-GFP-VP2, à l’aide de recombinase Cre et vérification de PCR de HVT-VP2 avec amorces UL45-F1 et VP2-R1 pour la jonction 5'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig3.jpg"> Figure 3 : Séquence d’analyse des virus recombinant HVT. (A) les séquences des éléments clés dans des couleurs différentes dans ce panneau sont la région intergénique HVT entre UL45/46 avec la séquence cible de gRNA a souligné et une flèche indiquant le site de clivage de Cas9, la cassette d’expression VP2 avec la fin des séquences en minuscule italique, la séquence cible de sg-A en rouge avec la flèche indiquant le site de clivage de Cas9, la séquence de site LoxP en vert et deux séquences de sites SfiI en bleu. (B) ce panneau montre les résultats de séquençage de la jonction 5' et 3' et une présentation schématique des HVT-VP2 avec éléments clés avec des couleurs correspondantes présentées en séquences. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig4.jpg"> Figure 4 : Caractérisation de la recombinaison HVT-VP2. Ce panneau montre la confirmation de l’expression réussie de VP2 en CEFs infectés par le test d’immunofluorescence indirecte (IFA) avec un anticorps monoclonal anti-VP2 HH7 (rouge). HVT infection est confirmée par IFA avec du sérum de poulet infectés HVT (vert). La barre d’échelle = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Génération des vecteurs recombinants Avian Herpesvirus avec CRISPR/Cas9 gène édition

HERPESVIRUS de dindons et dindes (HVT) est largement utilisé comme une plateforme de vecteur pour la génération de vaccins recombinants contre un certain nombre de maladies aviaires. Cet article décrit une méthode simple et rapide pour la génération de vaccins recombinants HVT-guidé à l’aide d’un NHEJ-CRISPR/Cas9 intégré et système de Cre-Lox.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Cette approche offre un moyen efficace d’introduire d’autres antigènes viraux dans le génome hvt pour le développement rapide de vaccins recombinants. Un certain avantage de cette technique est qu’une cassette d’expression GFP est attachée à l’insert d’abord pour une visualisation facile, puis supprimée par le système Cre-LoxP. La même approche peut être utilisée pour insérer plus de gènes viraux à différents endroits du génome hvt, ou d’autres virus de l’herpès aviaire pour le développement de vaccins recombinants multivalents.Katy Moffat, experte en tri cellulaire, démontrera la procédure. Na Tang, Yaoyao Zhang et Guanggang Qu, scientifiques de mon laboratoire. La veille de la transfection préparer fibroblastes embryon poussin tel que décrit dans le protocole texte.Graine 1,3 million de cellules en 2,5 millilitres de milieu dans chaque puits d’une plaque de six puits. Transfecter les cellules CEF avec 0,5 microgramme chacun des deux plasmides d’ARN guide Cas9, et un microgramme du plasmide donneur à l’aide d’un réagage de transfection approprié selon les instructions du fabricant. Incuber les cellules à 38,5 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 12 heures.12 heures après transfection diluer le stock de virus HVT avec le milieu de culture M199 à une concentration de 100 000 unités formant de la plaque par millilitre. Ajouter 130 microlitres du virus dilué à chaque puits de cellules transfectées. Réglez un puits de cellules non infectées comme un contrôle négatif et ajoutez la même quantité de virus.Incuber les cellules à 38,5 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours. La veille du tri, préparer deux 96 plaques de puits en ensemencer 20 000 cellules dans chaque puits. Trois jours après l’infection, récupérez les six plaques de puits contenant les CEF transfectés et infectés.Aspirer le milieu de chaque puits et rincer la feuille de cellule avec PBS. Ajouter un millilitre de 0,05 % trypsine-EDTA à chaque puits et incuber les cellules à 38,5 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant environ cinq minutes. Ensuite, résuspendez les cellules avec 50 microlitres de FBS et transférez cette suspension dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Centrifugeuse à 200 fois la gravité pendant cinq minutes. Resuspendez les cellules en un millilitre de PBS contenant 1%FBS. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules et ajuster la densité cellulaire à un million de cellules par millilitre.Ensuite, transférez les cellules dans un tube de tri en polystyrène à travers son capuchon de passoire. À l’aide d’un trieur cellulaire, trier les cellules individuelles exprimant le GFP dans les plaques de puits préséées 96. Incuber les plaques avec les cellules triées à 38,5 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant cinq jours.Après cinq jours, utilisez le microscope à fluorescence pour vérifier les 96 plaques de puits et marquer les puits qui contiennent une seule plaque positive GFP. Essayez chaque GFP positif bien avec 50 microlitres de trypsine-EDTA pendant trois minutes. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de milieu de culture pour résuspendre les cellules et transférer cette suspension dans un puits d’une plaque de six puits avec des CEF.Après trois jours, congeler un flacon de chacune des premières générations de virus recombinants dans le milieu de congélation. Conservez ces virus récoltés dans de l’azote liquide. Recueillir 100 000 cellules de chacune des premières généra tures de virus.Centrifugeuse les cellules à 2000 rpm pendant cinq minutes, et jeter le supernatant. Conserver les cellules à un taux négatif de 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à effectuer l’extraction de l’ADN. Lorsqu’ils sont prêts à effectuer l’extraction de l’ADN utiliser 50 microlitres de tampon squishing pour décongeler et résuspendre les granulés cellulaires.Lyse les échantillons à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 95 degrés Celsius pendant deux minutes pour inactiver le Proteinase K.Effectuer une réaction PCR avec trois amorces de jonction de premier plan en utilisant un microlitre de chaque échantillon d’ADN tel que décrit dans le protocole de texte. Chargez deux microlitres des produits d’amplification à un puits de gel d’agarose de 1% pour l’électrophoresis de gel. Pour éliminer le gène GFP du virus recombinant, utilisez un réaccente de transfection pour transfecter deux microlitres de plasmide d’expression cre recombinase dans la plaque de six puits qui a été préséminée avec des cellules CEF.12 heures après la transfection décongeler un flacon de virus recombinant de l’azote liquide. Resuspendez doucement le virus et ensemencez 50 microlitres dans chaque puits de cellules transfectées, en fixant un ainsi que le contrôle négatif avec la même quantité de virus. Incuber à 38,5 degrés Celsius pendant trois jours.72 heures après l’infection préparer les cellules pour le tri comme décrit précédemment. Trier les cellules non fluorescentes individuelles dans une plaque de 96 puits présénée avec des CEF. Ensuite, essayez de visualiser les plaques choisies et de résuser les cellules correspondantes telles que décrites dans le protocole texte.Passez la moitié des cellules dans chaque puits d’une plaque de puits de 96 qui a été précédée de CEF comme deuxième génération. Centrifuger les cellules restantes de chaque clone à 200 fois la gravité pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules avec 50 microlitres de tampon squishing pour l’extraction de l’ADN.Ensuite, effectuez pcr avec cinq amorces de jonction de premier plan en utilisant un microlitre de modèle d’ADN tel que décrit dans le protocole de texte. Sur la base des résultats pcr choisir trois à cinq clones positifs de HVT recombinant pour d’autres passages et la vérification. Tout d’abord, infecter les CEF avec la deuxième génération de HVT recombinant dans une plaque de puits présénée 24.48 heures après l’infection enlever le milieu de culture et ajouter 500 microlitres de 4% paraformaldéhyde dans PBS pour fixer les cellules. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, retirez le fixatif et lavez la couche cellulaire trois fois avec PBS.Retirez le PBS et ajoutez 500 microlitres de 0,1% Triton X-100 pour perméabiliser les cellules. Après 15 minutes laver la couche cellulaire trois fois avec PBS. Ajouter le tampon de blocage pendant une heure pour bloquer la liaison non spécifique.Ensuite, diluer l’anticorps primaire anti-VP2 anticorps monolinal HH7 ou HVT infecté sérum de poulet à un à 200 dans le tampon de blocage. Ajouter 200 microlitres de l’anticorps primaire dilué à chaque puits et incuber à température ambiante pendant une heure. Lavez la couche cellulaire trois fois avec PBS.Diluer l’anticorps secondaire chèvre anti-souris IgG Alexa 568 ou chèvre anti-poulet IgG Alexa 488 à un à 200 dans le tampon de blocage. Ajouter 200 microlitres d’anticorps secondaires dilués à chaque puits et incuber à température ambiante pendant une heure. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec PBS.Utilisez le microscope à fluorescence pour vérifier l’expression des protéines. La veille de l’expansion du virus graine 2,6 millions de cellules CEF dans chaque flacon T25. Décongeler au moins trois clones positifs et ajouter un flacon de cellules ou de virus à chaque flacon.Incuber les flacons à 38,5 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’un effet cytopathique de 50% soit observé. Ensuite, récoltez les cellules en deux millilitres de milieu de culture. Infecter 50 microlitres à un nouveau flacon T25 qui a été présééré avec des cellules CEF pour la prochaine génération.Continuez à passer le virus recombinant pendant au moins 15 générations. À l’aide de PCR analyser chaque génération de virus pour la présence de la séquence VP2. À l’aide d’un test d’immunofluorescence indirecte, analyser chaque génération de virus d’expression VP2.Après le tri d’une seule cellule, le virus purifié obtenu est analysé par trois PCR de jonction principale, qui montre un produit PCR de la taille prévue. Après l’excision du journaliste du GFP par Cre recombinase plus de 50% des plaques ont perdu leur expression GFP. La plaque purifiée après l’excision GFP est obtenue par tri cellulaire unique et est encore confirmée par cinq PCR de jonction principale qui montre le produit de la taille prévue.L’expression protéique est ensuite confirmée par un test d’immunofluorescence indirecte avec un anticorps monoclonal spécifique VP2 et un sérum de poulet anti-HVT. Comme prévu, les cellules infectées par le HVT parental ne peuvent être tachées que par sérum anti-HVT. Tandis que les cellules infectées recombinantes de HVT montrent clairement l’expression du gène VP2.Pour générer un virus recombinant taux élevé de transfection est nécessaire pour maximiser les chances du virus et l’insert de se rencontrer dans la même cellule pour l’édition d’avoir lieu. Suite à cette procédure, des expériences animales peuvent être réalisées pour évaluer l’immunogénicité et l’efficacité des vaccins recombinants. La mise au point de nouveaux vaccins vecteurs multivalents utilisant la plate-forme système CRISPR/Cas9 décrite ici sera très bénéfique pour l’industrie avicole afin de se protéger contre de multiples maladies de la volaille.

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