Name: generating recombinant avian herpesvirus vectors with crispr/cas9 gene editing
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

Gli autori ringraziano Pippa Hawes per aiutare con l'imaging confocale. Questo progetto è stato sostenuto dalla biotecnologia e Biological Sciences Research Council (BBSRC) concede BBS/E/I/00007034 e 1/L014262/BB.

1. preparazione di espressione Cas9/gRNA e costrutti di donatore
<ol><li>
Costruzione di plasmidi di espressione Cas9/gRNA
	<ol>
<li>Progettare una sequenza di gRNA targeting per regione intergenica fra geni UL45 e UL46 di HVT come descritto in precedenza22. Allineare la sequenza di destinazione Guida-RNA contro il genoma HVT per escludere qualsiasi potenziale fuori bersaglio sequenze nel genoma HVT. Sintetizzare e clonare la sequenza di gRNA targeting UL45/46 regione e sg-A sequenza da dati pubblicati23 in pX459-V2 come descritto in precedenza22. Verificare la sequenza clonata gRNA di Sanger sequenziamento utilizzando il primer U6-Fwd24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Costruzione del plasmide donatore
	<ol>
<li>Per generare un plasmide di donatore contenente la cassetta di espressione VP2 taggata con una cassetta di reporter GFP rimovibile, progettare i oligos donatore-F e donatore-R contenente i seguenti elementi (Figura 1A e Figura 3A): una sg-A sequenza di destinazione alle due estremità, un sito di PacI fiancheggiata da due sequenze LoxP per la GFP reporter cassetta clonazione e l'asportazione e due siti di SfiI per la clonazione della cassetta di espressione VP2.</li>
		<li>Clonare la sequenza in un vettore pGEM-T-facile e, quindi, duplicare le cassette di gene GFP e VP2 nel vettore risultante per generare il plasmide di donatore designato come pGEM-sgA-GFP-VP222. Nota: Qualsiasi vettore di clonazione può essere utilizzato per la costruzione del plasmide donatore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione del DNA del plasmide
	<ol>
<li>Preparare sia donatore plasmide e plasmidi di espressione Cas9/gRNA DNAs utilizzando un kit di estrazione del DNA commerciale secondo le istruzioni del produttore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CRISPR/Cas9-mediata Knock-in: transfezione e infezione
<ol><li>Il giorno prima di transfezione, preparare fibroblasti di embrione di pulcino (CEFs) per la transfezione/infezione, utilizzando embrioni 10 - giorno-vecchi in medium M199 completate con 5% siero bovino fetale (FBS), 10% Triptosio fosfato brodo, 100 U/mL penicillina-streptomicina, e fungizone 0,25 µ g/mL. 6 cellule di seme 1.3 x 10 per bene in tutti i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti in 2,5 mL di terreno. Nota: Le cellule CEF possono essere mantenute per 3 d a 4 ° C.</li>
	<li>Transfect cellule CEF (preparati in fase 2.1) con 0,5 µ g di UL45/46-gRNA, 0,5 µ g di sg-A e 1 µ g di pGEM-sgA-GFP-VP2 utilizzando un reagente di transfezione appropriato secondo le istruzioni del produttore. Incubare le cellule per 12 h in un incubatore (a 38,5 ° C con 5% CO2).</li>
	<li>posttransfection 12 h di plasmidi Cas9/gRNA e donatore, diluire lo stock di virus HVT con terreno di coltura M199 a 1 x 105 pfu/mL. Aggiungere 130 µ l di virus diluito in ciascun pozzetto delle cellule trasfettate e impostare un pozzetto delle cellule untransfected come controllo negativo con la stessa quantità di virus. Incubare le cellule transfettate/infetti per 3 d a 38,5 ° C con 5% CO2. Espletare tutte le procedure utilizzando il comune codice di pratica (JCoPR) approvato dai finanziatori.</li>
</ol>3. raccolta e purificazione del Virus ricombinante HVT
<ol><li>
Ordinamento delle cellule fluorescenza-attivato
	<ol>
<li>Preparare due piastre da 96 pozzetti preconfigurate con 2 x 104 cellule CEF per bene il giorno prima dell'ordinamento.</li>
		<li>Tripsinizzano transfected/infetti CEFs 3 d postinfection. Aspirare il mezzo da ogni pozzetto e sciacquare strato di cellule con tampone fosfato salino (PBS). Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA 0,05% (0,48 mM) a tripsinizzano le cellule nell'incubatrice 38,5 ° C per circa 5 min.</li>
		<li>Risospendere e trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL con 50 µ l di FBS. Centrifuga a 200 x g per 5 min.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 1 mL di PBS con 1% FBS. Contare i numeri di cellulare utilizzando un emocitometro e regolare il numero di cellule a 1 x 106 cellule/mL. Nota: Le cellule possono essere tenute su ghiaccio per 1-2 h.</li>
		<li>Trasferire le cellule un polistirolo ordinamento tubo attraverso il tappo del filtro. Ordinare le singole celle che esprimono GFP in piastre da 96 pozzetti seminate con CEFs utilizzando il classificatore celle secondo le istruzioni del fabbricante. Incubare le cellule ordinate per 5D a 38,5 ° C con 5% CO2. Nota: Un passaggio del virus ricombinante può essere necessaria prima dell'ordinamento se ci sono troppe cellule GFP-espressione singole e poche piastre di GFP-positive nel pozzo originale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaggio di virus ricombinanti
	<ol>
<li>Preparare piastre da 6 pozzetti seminate con 1.3 x 106 cellule CEF per bene il giorno prima del passaggio. 5D postsorting, controllare le piastre da 96 pozzetti con un microscopio a fluorescenza. Contrassegnare i pozzetti contenenti una singola placca di GFP-positive. Nota: Vedere la Figura 2A per una targa rappresentanza di GFP-positive.</li>
		<li>Tripsinizzano ogni GFP-positive bene con 50 µ l di tripsina-EDTA per 3 min, aggiungere 50 µ l di terreno di coltura, risospendere e trasferire le cellule in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con CEFs. Questa sarà la prima generazione di ricombinante HVT.</li>
		<li>Raccogliere la prima generazione di virus ricombinante 3 d più tardi, bloccare giù un flaconcino di ciascuno in 1 mL di congelamento medio contenente 10% siero fetale del vitello (FCS), 10% di dimetilsolfossido (DMSO) e terreno di coltura 80% e memorizzare i virus in azoto liquido. Nota: Il tempo del raccolto varia da 2-4 d a seconda della capacità di importo e la proliferazione del virus.</li>
		<li>Raccogliere 1 x 105 celle di ogni prima generazione di virus, centrifugare li e scartare il surnatante. Conservare le cellule a-20 ° C per l'estrazione del DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rilevamento di genomica inserimento da reazione a catena della polimerasi
	<ol>
<li>Per l'estrazione di DNA, sbrinamento e risospendere il pellet cellulare dal punto 3.2.4 con 50 µ l di tampone di schiacciamento (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1mM EDTA, 25 mM NaCl e proteinasi K 200 µ g/mL) e lisare i campioni a 65 ° C per 30 min e , quindi, a 95 ° C per 2 min inattivare la proteinasi K.</li>
		<li>Eseguire una reazione a catena della polimerasi (PCR) con 3' giunzione gli iniettori (tabella 1) utilizzando 1 µ l di campione di DNA. Per ogni campione, preparare la seguente miscela di reazione di 20 µ l su ghiaccio: 2x PCR Master Mix (10 µ l), primer di 10 µM a Monte (0,5 µ l), 10 µM a valle primer (0,5 µ l), mascherina del DNA (1 µ l) e acqua priva di nucleasi (8 µ l). Il programma di amplificazione è: 95 ° C per 2 min; 95 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s e 72 ° C per 40 s per 35 cicli; 72 ° C per 7 minimo carico 2 µ l dei prodotti di amplificazione in un pozzetto del gel di agarosio 1% per elettroforesi del gel. Nota: Vedere la Figura 2A per un risultato rappresentativo della giunzione 3' PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. l'asportazione del Gene Reporter fluorescenti tramite la Cre-lox sistema
<ol><li>Per rimuovere il gene GFP dal virus ricombinante, transfect 2 µ g di plasmide di espressione di Cre ricombinasi nella piastra 6 pozzetti preconfigurata con cellule CEF, usando un reagente di transfezione seguendo le istruzioni del fabbricante.</li>
	<li>posttransfection di 12 h, sbrinamento un flaconcino di virus ricombinante da azoto liquido, Risospendere delicatamente, semi 50 µ l in ogni pozzetto di cellule trasfettate e impostare un pozzetto come controllo negativo con la stessa quantità di virus. Incubare per 3 d a 38,5 ° C con 5% CO2.</li>
</ol>5. placca purificazione
<ol><li>
Ordinamento delle cellule fluorescenza-attivato
	<ol>
<li>Due piastre da 96 pozzetti seme con 2 x 104 cellule CEF per bene il giorno prima dell'ordinamento.</li>
		<li>Seguire le procedure descritte in un postinfection di 72 h di passaggio 3.1 (dal passaggio 4) per preparare le cellule infettate per l'ordinamento. Ordinare le celle singole nonfluorescence in piastre da 96 pozzetti seminate con CEFs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaggio dei virus ricombinanti e conferma di PCR
	<ol>
<li>Scegliere 5-10 nonfluorescence singole placche 5D postsorting, li tripsinizzano con 50 µ l di tripsina-EDTA a 38,5 ° C per 3 min e aggiungere 50 µ l di terreno di coltura per risospendere le cellule. Nota: Vedere la Figura 2B per una targa rappresentanza di GFP-negativo.</li>
		<li>Passare la metà delle cellule in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti preconfigurata con CEFs come la seconda generazione.</li>
		<li>Centrifugare le cellule rimanenti di ogni clone a 200 x g per 5 min, scartare il surnatante e risospendere le cellule con 50 µ l di tampone per estrazione del DNA di schiacciamento.</li>
		<li>Eseguire PCR con 5' giunzione primer (tabella 1) utilizzando 1 µ l della mascherina del DNA con la stessa condizione di reazione di PCR come descritto al punto 3.3.2. Nota: Vedere la Figura 2B per un risultato rappresentativo della 5' giunzione PCR.</li>
		<li>Base ai risultati PCR, scegliere tre-cinque cloni positivi di HVT ricombinante per ulteriori passaggi e verifica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Verifica del ricombinante HVT
<ol><li>
Analisi di immunofluorescenza indiretta
	<ol>
<li>Infettare CEFs con la seconda generazione di ricombinante che HVT ottenuti dal punto 5.2 della piastra a 24 pozzetti seminato con 2,5 x 105 CEFs il giorno prima dell'infezione. Rimuovere un postinfection di 48 h del terreno di coltura cellulare e aggiungere 500 µ l di paraformaldeide al 4% in PBS per fissare le cellule. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 min e, quindi, rimuovere il fissativo e lavare lo strato delle cellule 3 x con PBS. Nota: Le cellule possono essere conservate a 4 ° C a questo passaggio per diverse settimane.</li>
		<li>Rimuovere il PBS e aggiungere 500 µ l di 0.1% Triton X-100 per permeabilize le cellule per 15 min. lavare la cella di strato 3 volte con PBS.</li>
		<li>Legame non specifico di blocco con l'aggiunta di tampone bloccante (5% di siero bovino in PBS) per 1 h.</li>
		<li>Diluire l'anticorpo monoclonale anti-VP2 di anticorpo primario HH7 - o HVT-infettati del siero di pollo a 1: 200 in tampone bloccante, aggiungere 200 µ l per pozzetto e incubare a temperatura ambiente in 1 h. lavare la cella e il livello 3 volte con PBS.</li>
		<li>Diluire l'anticorpo secondario goat anti-mouse IgG Alexa 568 o anti-pollo di capra IgG Alexa 488 a 1: 200 in tampone bloccante, aggiungere 200 µ l per pozzetto, incubare a temperatura ambiente per 1 h e lavare le cellule 3 x con PBS. Verificare che l'espressione della proteina sotto il microscopio di fluorescenza. Nota: Vedere la Figura 4 per un rappresentante VP2 risultato di colorazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sequenziamento del gene VP2
	<ol>
<li>Amplificare la sequenza di DNA che attraversa la regione intergenica UL45 e UL46 con alta fedeltà DNA polimerasi e primer UL45-F1 e UL46-R1 (tabella 1) per rilevare l'inserimento di tutto.</li>
		<li>Preparare la seguente miscela di reazione di 50 µ l: 5 µ l di 10 x Pfx Mix di reazione, 1,5 µ l di 10 µM a Monte e mix di primer a valle, 1 µ l di miscela del dNTP 10mm, 1 µ l di 50mm MgSO4, 1 µ l della mascherina del DNA e 0,5 µ l di polimerasi del DNA Pfx e aggiungere acqua priva di nucleasi a 50 µ l. Il programma di amplificazione è: 95 ° C per 2 min; 95 ° C per 15 s, 55 ° C per 30 s e 68 ° C per 3 min per 35 cicli. Caricare tutto il prodotto PCR di gel per elettroforesi del gel di agarosio all'1%.</li>
		<li>Purificare il prodotto PCR seguendo le istruzioni di un kit di purificazione del gel del DNA. Invia 10 µ l di prodotto della PCR (30 ng / µ l) per una società di sequenziamento per confermare il knock-del gene VP2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. stabilità del Virus ricombinante
<ol><li>Cellule CEF seme 2.6 x 106 in ciascuna beuta T25 il giorno prima dell'espansione del virus.</li>
	<li>Scongelare almeno tre cloni positivi dal punto 5.2; aggiungere un flaconcino di cellule/virus in ciascuna beuta T25. Incubare a 38,5 ° C con 5% CO2 fino a quando si osserva un effetto citopatico 50%.</li>
	<li>Raccogliere le cellule in 2 mL di terreno di coltura; infettare 50 µ l di una nuova staffa T25 preconfigurata con cellule CEF per la prossima generazione. Mantenere il passaggio del virus ricombinante per almeno 15 generazioni. Analizzare ogni generazione di virus mediante PCR per la presenza della sequenza VP2 e di analisi di immunofluorescenza indiretta (IFA) per VP2 espressione valutare la stabilità dei virus ricombinante.</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+repair:+53BP1+comes+into+focus.">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway.">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il sistema CRISPR/Cas9 è diventato uno strumento prezioso nel gene di editing. Le tecnologie tradizionali per ricombinante sviluppo vettoriale HVT, come ricombinazione omologa13 e BAC mutagenesi tecnologia25, solitamente coinvolgono diversi giri di vettore di clonazione e selezione, nonché lo screening su larga scala, che può richiedere diversi mesi. Il protocollo descritto qui utilizzando una strategia di NHEJ-CRISPR/Cas9-base combinata con il sistema Cre-Lox e ordinamento cella singola è un approccio più conveniente, efficiente e veloce nella generazione di vaccino ricombinante. Utilizzando questa pipeline, il virus ricombinante può essere ottenuto all'interno di solo 1-2 settimane24e fasi di purificazione di placca possono anche essere ridotta ad una separazione con un unico arrotondamento mediante fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento17. L'intero processo, dalla costruzione di design e donatore di gRNA per ottenere il virus HVT ricombinante purificato, può essere raggiunto entro 1 mese. I passaggi critici per la generazione di HVT ricombinante successo includono la selezione di gRNA ad alta efficienza per il targeting del genoma virale per assicurare efficiente fenditura per l'inserimento del gene estraneo, l'efficienza di trasfezione elevata per massimizzare le possibilità per Cas9 / gRNAs e il virus di incontrare nella stessa cella per la modifica e l'intervallo di 12 ore tra la transfezione dei plasmidi donatore e gRNA e l'infezione virale per consentire Cas9 e gRNA di esprimersi ad un livello ragionevole, prima che il virus entra nelle cellule.
La limitazione per la generazione di HVT ricombinante è che la complessità dell'identificazione di GFP-positive cloni di giunzione PCR. Le cassette di GFP-VP2 potrebbero essere inserite in un orientamento. La giunzione che PCR descritto qui è solo per l'identificazione dell'inserto con l'orientamento di senso. In caso di inserimento in orientamento antisenso, PCR utilizzando le coppie di primer descritte non funzionerebbe e i primer interni potrebbero essere scambiati per questo scopo. Un altro potenziale problema è che il costrutto di donatore può essere utilizzato solo per l'inserimento di un gene del virus stesso a causa dell'esistenza della sequenza LoxP rimanente dopo la rimozione di GFP dal trattamento Cre. Un nuovo costrutto di donatore con una variante LoxP sequenza potrebbe essere invece utilizzato per uno scopo di inserimento più.
Le due vie per riparare le rotture del doppio filamento (DSBs) create da Cas926,27NHEJ e HDR (omologia-regia di riparazione). NHEJ è più efficiente poiché si verifica durante il ciclo cellulare28, considerando che HDR è meno efficiente e si verifica solo durante fasi da S e G229,a6,30. Abbiamo sfruttato il più efficiente via di riparazione NHEJ qui per introdurre geni estranei nelle località di destinazione. Sebbene la NHEJ riparazione può introdurre indels unendo utilizzate o danneggiate estremità di DNA attraverso un processo meccanicistico flessibile di omologia-indipendente31,32 tra la sequenza di spaccati donatore e DNA genomico, il indels può avvenire solo presso i siti di fenditura di sgA e la cassetta di espressione genica stranieri non è interessata. Un altro vantaggio di questo approccio è che NHEJ è libera dalla restrizione della costruzione del braccio di omologia, facendo la clonazione passo molto semplice. Questo richiede un grande potenziale per l'applicazione di NHEJ per l'inserimento del gene estraneo. L'introduzione di un sito di destinazione universale gRNA sia termina del gene estraneo cassetta rende il processo più rapido come il modello di donatore potrebbe essere costruito immediatamente senza la necessità per la selezione di specifici gRNA. La spina dorsale del plasmide donatore contenente siti di destinazione di sgA, siti LoxP e PacI e SfiI siti possa anche essere condivisi ampiamente tra geni diversi reporter, cassette di espressione genica stranieri e vettori di virus diversi, dando a questo nuovo approccio il vantaggio di personalizzazione.
L'inserto che harboring HVT VP2 è stato usato per descrivere il protocollo in questo manoscritto; Tuttavia, lo stesso approccio consente di inserire più geni virali alle posizioni differenti genomiche del genoma HVT utilizzando il gRNA sequenza corrispondente desiderata per lo sviluppo di vaccini ricombinanti a HVT vectored multivalenti di targeting. Altri ceppi di vaccino MDV, ad esempio SB-1 e CVI988, altri herpesvirus aviaria, compreso il virus della laringotracheite infettiva e anatra enterite virus e anche altri virus a DNA aviaria, come pox virus e adenovirus, possono anche essere progettati utilizzando lo stesso approccio per lo sviluppo di vaccini ricombinanti multivalente. Lo sviluppo di nuovi vaccini polivalenti basato su vettori, utilizzando la piattaforma di sistema CRISPR/Cas9 descritta qui sarà molto utile per l'industria di pollame proteggere contro le malattie multiple di pollame.

Malattia di Marek (MD) è una malattia linfoproliferativa di polli indotto dal sierotipo 1 (aviario Herpesvirus 2 [GAHV-2]) del genere Mardivirus nella sottofamiglia Alphaherpesvirinae. Mardivirus comprende anche due sierotipi non patogeni: sierotipo 2 (GaHV-3) e sierotipo 3 (MeHV-1, storicamente conosciuta come HVT) che sono utilizzati come vaccini contro MD. Vaccino vivo HVT (ceppo FC-126) è la prima generazione di vaccino MD usato nei primi anni 1970 ed è ancora utilizzato ampiamente nelle formulazioni di vaccino bivalente e polivalente per fornire una maggiore protezione contro MD. HVT è inoltre ampiamente usato come un vettore di vaccino per indurre la protezione contro una serie di malattie aviarie, grazie alla sua versatilità e sicurezza sia in ovo e somministrazione sottocutanea incubatoio e capacità di fornire un'immunità permanente. La strategia per generare vaccini ricombinanti HVT si basa su entrambi convenzionale ricombinazione omologa in cellule infettate da virus, sovrapposto cosmide DNAs o BAC mutagenesi2. Tuttavia, questi metodi sono generalmente molto tempo e laborioso, che richiede la costruzione di vettori di trasferimento, il mantenimento del genoma virale in Escherichia coli, purificazioni di placca e la rimozione della sequenza di BAC e selezione indicatore il virus modificato3,4.
CRISPR/associati (Cas9) è il gene più popolare strumento di editing negli ultimi anni grazie alla sua versatilità e la specificità. Il sistema CRISPR/Cas9 è stato utilizzato con successo nella generazione efficiente di cellule geneticamente modificate e modelli animali5,6,7,8,9,10, come così come la manipolazione di diversi grandi virus a DNA genomi11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20. Dopo la segnalazione di un metodo semplice ed efficace utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 per modificare il genoma HVT21, abbiamo sviluppato una pipeline per la generazione rapida ed efficiente di ricombinante HVT22.
Al fine di estendere l'applicazione potenziale di questo metodo, descriviamo la metodologia dettagliata per la generazione di ricombinante vaccino HVT che esprimono il gene VP2 di IBDV al luogo del UL45/46 in questo rapporto. L'approccio combina NHEJ-CRISPR/Cas9 per inserire il gene VP2 taggato con gene reporter GFP e un sistema di Cre-LoxP per rimuovere la cassetta di espressione di GFP successivamente. Rispetto al tradizionale ricombinazione e BAC recombineering tecniche, dimostriamo che NHEJ-CRISPR/Cas9 insieme ad un sistema Cre-Lox è un approccio rapido ed efficiente per generare vaccino ricombinante HVT.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:988px;" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">M199 medium, Earle&#39;s Salts</td>
			<td style="width:221px;">Life technology</td>
			<td style="width:163px;">11150059</td>
			<td style="width:235px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140148</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td>antifunigal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptose Phosphate Broth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8782</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HVT Fc126 strain</td>
			<td>Avian Disease and Oncology Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>wildtype HVT virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pX459-v2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #62988</td>
			<td>Cas9 and gRNA expression vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-T Easy Vector Systems</td>
			<td>promega</td>
			<td>A1360</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Subcloning Efficiency DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>rR0547S</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SfiI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0123S</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-X2</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 6004</td>
			<td>transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture 6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Master Mixes</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td>junction PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum Pfx DNA Polymerase</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11708021</td>
			<td>PCR amplification of full insert</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>immunoflourescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td>immunoflourescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica TCS SP5 LASAF</td>
			<td>immunoflourescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS cell sorter</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>BD FACSAria</td>
			<td>single cell sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (4% in PBS)</td>
			<td>Santa cruz biotechnology</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td>cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30960</td>
			<td>permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating recombinant avian herpesvirus vectors with crispr/cas9 gene editing

Herpesvirus dei tacchini (HVT) è un vettore virale ideale per la generazione di vaccini ricombinanti contro un certo numero di malattie aviarie, come l'influenza aviaria (AI), malattia di Newcastle (ND) e bursite infettiva (IBD), utilizzando artificiali batterici del cromosoma ( Mutagenesi di BAC) o i metodi convenzionali di ricombinazione. Il cluster regolarmente intervallate palindromi ripetizioni (CRISPR) / Cas9 sistema ha usato con successo in molte impostazioni per gene editing, tra cui la manipolazione di diversi genomi di grandi virus a DNA. Abbiamo sviluppato una rapida ed efficiente CRISPR/Cas9-mediata del genoma editing pipeline per generare ricombinante HVT. Per massimizzare l'uso potenziale di questo metodo, vi presentiamo qui informazioni dettagliate sulla metodologia di generare HVT ricombinanti esprimenti la proteina VP2 di IBDV. La cassetta di espressione VP2 è inserita nei HVT genoma tramite un NHEJ (unirsi nonhomologous fine)-via di riparazione dipendente. Una cassetta di espressione della proteina (GFP) fluorescenza verde viene collegata all'inserto per una visualizzazione semplice e poi rimosso tramite la Cre-LoxP sistema. Questo approccio offre un modo efficace per introdurre altri antigeni virali nel genoma HVT per il rapido sviluppo di vaccini ricombinanti.

La strategia utilizzata per la generazione del vaccino ricombinante HVT è descritto in Figura 1, che include come il plasmide di donatore è costruito (Figura 1A) e le procedure per generare il ricombinante HVT (Figura 1B ). Cinque a trenta piastre di GFP-positive circondate da placche di selvaggio-tipo possono essere osservate in gene bussare-in pozzi sotto il posttransfection d 3 microscopio di fluorescenza e - infezione. Il virus purificato ottenuto dopo la cernita di singola cellula (Figura 2A) è stato analizzato da 3' giunzione PCR, che mostra un prodotto PCR delle dimensioni previste (Figura 2A, pannello inferiore). Dopo l'asportazione del reporter GFP di Cre ricombinasi, oltre il 50% delle placche perso loro espressione di GFP. La placca purificata dopo l'asportazione di GFP (Figura 2B) ordinando cella singola è stato ulteriormente confermata da 5' giunzione PCR, che mostra il prodotto di PCR di giuste dimensioni (Figura 2B, pannello inferiore). La figura 3 Mostra i risultati del sequenziamento della entrambi giunzione prodotti di PCR con diversi elementi colorati. Nella Figura 4, l'espressione della proteina è stata confermata mediante IFA con anticorpo monoclonale specifico del VP2 e del siero anti-HVT pollo. Come previsto, le cellule infettate con il parental HVT possono solo essere macchiate dal siero anti-HVT (verde), mentre cellule ricombinanti HVT-infettati chiaramente ha mostrato l'espressione del gene VP2 (rosso).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig1.jpg"> Figura 1: strategia per la generazione di un recombinant HVT-vectored vaccino. (A), questo pannello mostra una rappresentazione schematica della clonazione strategia per donatore costruzione del plasmide. Gli elementi chiavi includono due siti di destinazione Cas9 (sgA) per il rilascio di insert, una cassetta GFP reporter affiancato con sequenze LoxP per l'asportazione di GFP e la cassetta di espressione VP2. (B), questo pannello mostra una panoramica della strategia di un gene knock-in due fasi. Il frammento di inserto della GFP e le cassette di espressione VP2 è rilasciato tramite fenditura Cas9/sgA e inserito nel genoma HVT presso UL45/46 loci via NHEJ-CRISPR/Cas9. Il virus ricombinante GFP-positive è quindi ordinato e purificato dalla cella singola fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS). Successivamente, il gene reporter GFP è asportato da Cre ricombinasi e il virus ricombinante è purificato e caratterizzato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig2.jpg"> Figura 2 : Verifica del ricombinante HVT. (A) questo pannello mostra una targa di GFP-positive (HVT-GFP-VP2) visualizzata sotto il microscopio a fluorescenza (pannello superiore) e la verifica di PCR di HVT-GFP-VP2 con primer VP2-F & UL46-R1 per la giunzione di 3'. (B) questo pannello mostra una targa (HVT-VP2) visualizzata dopo l'asportazione di GFP di HVT-GFP-VP2, usando la Cre ricombinasi e verifica di PCR di HVT-VP2 con gli iniettori UL45-F1 e VP2-R1 per la giunzione di 5'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig3.jpg"> Figura 3 : Analisi del virus ricombinante HVT di sequenza. (A) le sequenze degli elementi chiave in diversi colori in questo pannello sono la regione intergenica HVT tra UL45/46 con la sequenza di destinazione gRNA sottolineata e una freccia che indica il luogo di fenditura Cas9, la cassetta di espressione VP2 con fine sequenze corsivo minuscolo, la sequenza di sg-A destinazione in rosso con la freccia che indica il luogo di fenditura Cas9, la sequenza del sito LoxP in verde e due sequenze di SfiI siti in blu. (B) questo pannello mostra i risultati del sequenziamento delle giunzioni 5' e 3' e una presentazione schematica di HVT-VP2 con elementi chiave con i corrispondenti colori presentati in sequenze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig4.jpg"> Figura 4 : Caratterizzazione del ricombinante HVT-VP2. Questo pannello mostra la conferma della riuscita espressione di VP2 in CEFs infetti da analisi di immunofluorescenza indiretta (IFA) con l'anticorpo monoclonale anti-VP2 HH7 (rosso). HVT infezione è confermata dall'IFA con siero di pollame infetto HVT (verde). La barra della scala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Generazione di vettori ricombinanti Herpesvirus aviaria con CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus dei tacchini (HVT) è ampiamente usato come una piattaforma di vettore per la generazione di vaccini ricombinanti contro un certo numero di malattie aviarie. Questo articolo viene descritto un approccio semplice e rapido per la generazione di vaccini ricombinanti HVT-vectored utilizzando un sistema di Cre-Lox e integrato NHEJ-CRISPR/Cas9.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Questo approccio offre un modo efficiente per introdurre altri antigeni virali nel genoma HVT per il rapido sviluppo di vaccini ricombinanti. Un certo vantaggio di questa tecnica è che una cassetta di espressione GFP viene attaccata all'inserto prima per una facile visualizzazione e poi rimossa dal sistema Cre-LoxP. Lo stesso approccio può essere usato per inserire più geni virali in diverse posizioni del genoma HVT, o altri virus dell'herpes aviario per lo sviluppo di vaccini ricombinanti multivalenti.A dimostrare la procedura sarà Katy Moffat, esperta nello smistamento delle celle. Na Tang, Yaoyao Zhang e Guanggang Qu, scienziati del mio laboratorio. Il giorno prima della trasfezione preparare i fibroblasti embrionale pulcino come delineato nel protocollo di testo.Semina 1,3 milioni di cellule in 2,5 millilitri di mezzo in ogni pozzo di una piastra di sei pozza. Trasfezionare le cellule CEF con 0,5 microgrammi ciascuno dei due plasmidi RNA guida Cas9 e un microgrammo del plasmide donatore utilizzando un reagente di trasfezione appropriato secondo le istruzioni del produttore. Incubare le cellule a 38,5 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 12 ore.12 ore dopo la trasfezione diluire lo stock di virus HVT con mezzo di coltura M199 a una concentrazione di 100.000 unità di formatura della placca per millilitro. Aggiungere 130 microlitri del virus diluito ad ogni pozzo di cellule trasfette. Impostare un pozzo di cellule non trasfette come controllo negativo e aggiungere la stessa quantità di virus.Incubare le cellule a 38,5 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per tre giorni. Il giorno prima dello smistamento preparare due 96 piastre di pozzo seminando 20.000 cellule in ogni pozzo. Tre giorni dopo l'infezione recuperano le sei piastre del pozzo contenenti i CEF trasfettato e infetto.Aspirare il mezzo da ogni pozzo e sciacquare il foglio cellulare con PBS. Aggiungere un millilitro dello 0,05% di tripside-EDTA a ciascun pozzo e incubare le cellule a 38,5 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per circa cinque minuti. Quindi, rimescolare le celle con 50 microlitri di FBS e trasferire questa sospensione in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.Centrifuga a 200 volte la gravità per cinque minuti. Rimospendare le celle in un millilitro di PBS contenente 1%FBS. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule e regolare la densità cellulare a un milione di cellule per millilitro.Quindi, trasferire le celle in un tubo di smistamento in polistirolo attraverso il tappo del filtro. Utilizzando uno smistatore di celle ordinare le singole celle che esprimono GFP nelle piastre prese 96 poggiasto. Incubare le piastre con le cellule ordinate a 38,5 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per cinque giorni.Dopo cinque giorni utilizzare il microscopio a fluorescenza per controllare le 96 piastre del pozzo e contrassegnare i pozzi che contengono una singola placca positiva GFP. Tripinare bene ogni GFP positivo con 50 microlitri di tripina-EDTA per tre minuti. Quindi, aggiungere 50 microlitri di mezzo di coltura per rimostrare le cellule e trasferire questa sospensione in un pozzo di una piastra a sei pozzi con CEF.Dopo tre giorni congelare una fiala di ciascuna della prima generazione di virus ricombinanti in mezzo di congelamento. Conservare questi virus raccolti in azoto liquido. Raccogli 100.000 cellule da ciascuna delle prime generazioni di virus.Centrifugare le cellule a 2.000 giri/min per cinque minuti e scartare il supernatante. Conservare le cellule a -20 gradi Celsius fino a quando non sono pronte per eseguire l'estrazione del DNA. Quando è pronto per eseguire l'estrazione del DNA, utilizzare 50 microlitri di tampone di schiacciamento per scongelare e rimpiorsi il pellet cellulare.Lisciviare i campioni a 65 gradi Celsius per 30 minuti e poi a 95 gradi Celsius per due minuti per inattivare la Proteinasi K.Eseguire una reazione PCR con tre primer di giunzione primaria utilizzando un microlitro di ogni campione di DNA come delineato nel protocollo di testo. Caricare due microlitri dei prodotti di amplificazione in un pozzo dell'1% di gel di agarosio per l'elettroforesi in gel. Per rimuovere il gene GFP dal virus ricombinante, utilizzare un reagente di trasfezione per trasfezionare due microlitri di cre recombinasi espressione plasmide nella piastra a sei pozzi che è stata presentata con cellule CEF.12 ore dopo la trasfezione scongelare una fiala di virus ricombinante dall'azoto liquido. Resosticcare delicatamente il virus e seminare 50 microlitri in ogni pozzo di cellule trasfette, impostandone uno così come il controllo negativo con la stessa quantità di virus. Incubare a 38,5 gradi Celsius per tre giorni.72 ore dopo l'infezione preparano le cellule per lo smistamento come descritto in precedenza. Ordinare le singole celle non fluorescenti in una piastra di 96 po 'prese con CEF. Quindi, tripinare le placche scelte e rimorsinare le celle corrispondenti come delineato nel protocollo di testo.Passare metà delle cellule in ogni pozzo di una piastra di pozzo 96 che è stata prese con CEF come seconda generazione. Centrifugare le cellule rimanenti di ogni clone a 200 volte la gravità per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule con 50 microlitri di tampone di schiacciamento per l'estrazione del DNA.Quindi, eseguire PCR con cinque primer di giunzione primaria utilizzando un microlitro di modello di DNA come delineato nel protocollo di testo. Sulla base dei risultati PCR scegli da tre a cinque cloni positivi di HVT ricombinante per ulteriori passaggi e verifiche. In primo luogo, infettare i CEF con la seconda generazione di HVT ricombinante in una piastra di pozzo da 24 prese.48 ore dopo l'infezione rimuovere il mezzo di coltura e aggiungere 500 microlitri di paraformaldeide al 4% nel PBS per fissare le cellule. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, rimuovere il fissatore e lavare lo strato cellulare tre volte con PBS.Rimuovere il PBS e aggiungere 500 microlitri dello 0,1%Triton X-100 per permeabilizzare le celle. Dopo 15 minuti lavare lo strato cellulare tre volte con PBS. Aggiungere il buffer di blocco per un'ora per bloccare l'associazione non specifica.Quindi, diluire l'anticorpo primario anti-VP2 anticorpo monoclonale HH7 o siero di pollo infettato da HVT a uno a 200 nel tampone di blocco. Aggiungere 200 microlitri dell'anticorpo primario diluito ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Lavare lo strato cellulare tre volte con PBS.Diluire l'anticorpo secondario capra anti-topo IgG Alexa 568 o capra anti-pollo IgG Alexa 488 a uno a 200 nel tampone di blocco. Aggiungere 200 microlitri di anticorpi secondari diluiti ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, lavare le cellule tre volte con PBS.Utilizzare il microscopio a fluorescenza per controllare l'espressione proteica. Il giorno prima dell'espansione del virus seme 2,6 milioni di cellule CEF in ogni pallone T25. Scongelare almeno tre cloni positivi e aggiungere una fiala di cellule o virus a ciascun pallone.Incubare i contenitori a 38,5 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica fino a quando non si osserva un effetto citopatico del 50%. Successivamente raccogliere le cellule in due millilitri di mezzo di coltura. Infettare 50 microlitri in un nuovo pallone T25 che è stato prese con cellule CEF per la prossima generazione.Continuare a far passare il virus ricombinante per almeno 15 generazioni. Utilizzando PCR analizzare ogni generazione di virus per la presenza della sequenza VP2. Utilizzando un saggio di immunofluorescenza indiretta analizzare ogni generazione di virus di espressione VP2.Dopo lo smistamento a singola cellula, il virus purificato ottenuto viene analizzato da tre PCR a giunzione primaria, che mostra un prodotto PCR delle dimensioni previste. Dopo l'escissione del reporter del GFP da parte di Cre ricombinasi oltre il 50% delle placche perse la loro espressione GFP. La placca purificata dopo l'escissione GFP è ottenuta mediante cernita a cella singola ed è ulteriormente confermata da cinque PCR a giunzione primaria che mostra il prodotto della dimensione prevista.L'espressione proteica è quindi confermata da un test indiretto di immunofluorescenza con anticorpo monoclonale specifico VP2 e siero di pollo anti-HVT. Come previsto, le cellule infettate dall'HVT parentale possono essere macchiate solo da siero anti-HVT. Mentre le cellule infettate da HVT ricombinante mostrano chiaramente l'espressione del gene VP2.Per generare un virus ricombinante è necessario un alto tasso di trasfezione per massimizzare la possibilità che il virus e l'inserto si incontrino nella stessa cella per la modifica. Seguendo questa procedura possono essere eseguiti esperimenti sugli animali per valutare l'immunogenicità e l'efficacia dei vaccini ricombinanti. Lo sviluppo di nuovi vaccini vettoriali multivalenti utilizzando la piattaforma di sistema CRISPR/Cas9 qui descritta sarà altamente vantaggioso per l'industria avicola per proteggersi da più malattie del pollame.

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