Name: generating recombinant avian herpesvirus vectors with crispr/cas9 gene editing
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

Forfatterne takker Pippa Hawes for å hjelpe med AC confocal avbilding. Dette prosjektet ble støttet av bioteknologi og Biological Sciences Research Council (BBSRC) gir BBS/E/jeg/00007034 og BB/L014262/1.

1. forberedelse av Cas9/gRNA uttrykk og Donor konstruksjoner
<ol><li>
Bygging av Cas9/gRNA uttrykk plasmider
	<ol>
<li>Utforme en gRNA sekvens målretting intergenisk regionen mellom UL45 og UL46 gener av HVT som beskrevet tidligere22. Juster guide-RNA målet sekvensen mot HVT genomet å utelukke noen potensielle off-målet sekvenser i HVT genomet. Syntetisere og klone gRNA sekvensen UL45/46 regionen og sg-en rekkefølge fra publiserte data23 i pX459-V2 som beskrevet tidligere22. Kontroller klonet gRNA sekvensen Sanger sekvensering bruker U6-Fwd primer24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Byggingen av donor plasmider
	<ol>
<li>Vil generere en donor plasmider inneholder VP2 uttrykk kassetten merket med en flyttbar GFP reporter kassett, design oligos Donor-F og Donor-R inneholder følgende elementer (figur 1A og Figur 3A): en sg-A målet rekkefølgen på både ender, et PacI område flankert med to LoxP sekvenser for GFP reporter kassett kloning og excision og to SfiI nettsteder for kloning av VP2 uttrykk kassetten.</li>
		<li>Klone sekvensen i en pGEM-T-enkel vektor og deretter klone GFP og VP2 gene kassettene i resultatet vektoren generere donor plasmider utpekt som pGEM-sgA-GFP-VP222. Merk: Enhver kloning vektor kan brukes til å konstruere donor plasmider.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plasmider DNA forberedelse
	<ol>
<li>Forberede både donor plasmider og Cas9/gRNA uttrykk plasmider DNAs bruker en kommersiell DNA utvinning utstyr i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CRISPR/Cas9-mediert Knock-i: Transfection og infeksjoner
<ol><li>Dagen før transfection, forberede kylling embryoet fibroblaster (CEFs) hva/infeksjon, bruker 10 - dagers gammel embryo i M199 middels med 5% fosterets bovin serum (FBS), 10% tryptose fosfat kjøttkraft, 100 U/mL penicillin-streptomycin, og 0,25 µg/mL fungizone. Frø 1,3 x 106 celler per brønn i hver brønn av en 6-vel plate i 2,5 mL av medium. Merk: CEF cellene kan holdes for 3 d på 4 ° C.</li>
	<li>Transfect CEF celler (forberedt i trinn 2.1) med 0,5 µg av UL45/46-gRNA og 0,5 µg av sg 1 µg av pGEM-sgA-GFP-VP2 ved hjelp av en passende transfection reagens i henhold til produsentens instruksjoner. Inkuber celler for 12 h i en inkubator (på 38,5 ° C med 5% CO2).</li>
	<li>12 h posttransfection av Cas9/gRNA og donor plasmider, fortynne HVT virus lager med M199 kultur medium til 1 x 105 pfu/mL. Legge til 130 µL av utvannet viruset i hver brønn transfekterte cellene og angi en brønn av untransfected celler som en negativ kontroll med samme antall av virus. Inkuber transfekterte/infisert celler for 3 d på 38,5 ° C med 5% CO2. Utfør alle prosedyrer som bruker felles anbefalingen (JCoPR) godkjent av fond.</li>
</ol>3. høsting og rensing av HVT rekombinant viruset
<ol><li>
Fluorescens-aktivert celle sortering
	<ol>
<li>Forberede to 96-brønns plater preseeded med 2 x 104 CEF celler per Vel dagen før du sorterer.</li>
		<li>Trypsinize transfekterte/infisert CEFs 3 d postinfection. Sug opp mediet fra hver brønn og skyll celle arket med fosfat-bufret saltvann (PBS). Legg 1 mL av 0,05% trypsin-EDTA (0.48 mM) til trypsinize cellene i inkubator 38,5 ° C i ca 5 min.</li>
		<li>Resuspend og overføre cellene i en 1,5 mL microcentrifuge rør med 50 µL av FBS. Sentrifuger 200 x g i 5 min.</li>
		<li>Resuspend cellene i 1 mL av PBS med 1% FBS. Telle celle tall ved hjelp av en hemocytometer og justere antall celler til 1 x 106 celler/mL. Merk: Cellene kan holdes på is 1-2 h.</li>
		<li>Overføre cellene til en polystyren sortering røret sin sil lua. Sortere enkeltceller uttrykke GFP i 96-brønnen platene plantet med CEFs bruker cellen sorter etter produsentens instruksjoner. Inkuber sorterte celler for 5 d på 38,5 ° C med 5% CO2. Merk: En passasje av rekombinant viruset kan være nødvendig før sortering hvis det er for mange enkeltceller GFP-uttrykket og få GFP-positive plaketter opprinnelige brønnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging av rekombinant virus
	<ol>
<li>Forberede 6-vel plater seeded med 1,3 x 106 CEF celler per Vel dagen før passering. 5 d postsorting, sjekk 96-brønns platene under fluorescens mikroskop. Merk brønnene som inneholder en enkelt GFP-positive plakk. Merk: Se figur 2A for en representant GFP-positive plakk.</li>
		<li>Trypsinize hver GFP-positive med 50 µL av trypsin-EDTA i 3 min, legge til 50 µL av kultur medium, resuspend og overføre cellene til en brønn av en 6-vel plate med CEFs. Dette vil være den første generasjonen av rekombinant HVT.</li>
		<li>Høste den første generasjonen av rekombinant virus 3 d senere, fryse ned en flaske av hver i 1 mL av frysing middels inneholder 10% fosterets kalv serum (FCS), 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) og 80% kultur medium og lagre virus i flytende nitrogen. Merk: Høstens tid varierer fra 2-4 d avhengig beløp og spredning av viruset.</li>
		<li>Samle 1 x 105 cellene i hver første generasjon av virus, sentrifuge dem, og forkaste nedbryting. Lagre cellene på 20 ° C for DNA utvinning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Påvisning av genomisk innsetting av polymerasekjedereaksjons
	<ol>
<li>For DNA utvinning, defrost og resuspend celle pellet fra trinn 3.2.4 med 50 µL av squishing buffer (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1mM EDTA, 25 mM NaCl, og 200 µg/mL proteinasen K) og lyse prøvene på 65 ° C i 30 min og , deretter på 95 ° C i 2 minutter å deaktivere proteinasen K.</li>
		<li>Utføre en polymerasekjedereaksjons (PCR) med 3 krysset primer (tabell 1) bruker 1 µL av DNA-prøve. For hver prøve, forberede følgende 20 µL reaksjonen blanding på is: 2 x PCR Master Mix (10 µL), 10 µM oppstrøms primer (0,5 µL), 10 µM nedstrøms primer (0,5 µL), DNA-mal (1 µL) og nuclease-fritt vann (8 µL). Forsterkning programmet er: 95 ° C i 2 min; 95 ° C for 30 s, 55 ° C for 30 s og 72 ° C i 40 s 35 sirkelstrukturer; 72 ° C i 7 min. laste 2 µL av forsterkning produktene til en godt av 1% agarose gel for gel geleelektroforese. Merk: Se figur 2A representant resultatet 3 krysset PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. excision av fluorescerende Reporter Gene via grobunn-lox systemet
<ol><li>Fjerne GFP genet fra rekombinant virus, transfect 2 µg av grobunn recombinase uttrykk plasmider inn i 6-vel plate preseeded med CEF celler, med en transfection reagens følger produsentens instruksjoner.</li>
	<li>12 h posttransfection, tine en flaske av rekombinant virus fra flytende nitrogen, resuspend forsiktig, frø 50 µL i hver brønn av transfekterte celler og angi en brønn som negative kontrollen med samme mengde virus. Inkuber for 3 d på 38,5 ° c med 5% CO2.</li>
</ol>5. plakk rensing
<ol><li>
Fluorescens-aktivert celle sortering
	<ol>
<li>Frø, to plater 96-brønnen med 2 x 104 CEF celler per Vel dagen før du sorterer.</li>
		<li>Følg fremgangsmåtene i trinn 3.1 72 h postinfection (fra trinn 4) for å forberede de infiserte cellene sortering. Sortere enkelt nonfluorescence cellene i 96-brønnen platene plantet med CEFs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging av rekombinant virus og PCR bekreftelse
	<ol>
<li>Velg 5-10 enkelt nonfluorescence plaketter 5 d postsorting, trypsinize dem med 50 µL av trypsin-EDTA ved 38,5 ° C i 3 minutter, og Legg til 50 µL av kultur medium til resuspend cellene. Merk: Se figur 2B for en representant GFP-negativ plakk.</li>
		<li>Pass halvparten av cellene i hver brønn av en 6-vel plate preseeded med CEFs som andre generasjon.</li>
		<li>Sentrifuge gjenværende cellene i hver klone 200 x g i 5 min, forkaste nedbryting og resuspend cellene med 50 µL av squishing buffer for DNA utvinning.</li>
		<li>Utføre PCR med 5' krysset primer (tabell 1) med 1 µL av DNA med samme PCR reaksjon betingelse som beskrevet i trinn 3.3.2. Merk: Se figur 2B 5' krysset PCR representant resultatet.</li>
		<li>Basert på PCR resultatene, velge tre til fem positiv kloner av rekombinant HVT for ytterligere passasjer og verifisering.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. verifisering av rekombinant HVT
<ol><li>
Indirekte immunofluorescence analysen
	<ol>
<li>Infisere CEFs med andre generasjon av rekombinant HVT hentet i trinn 5.2 i 24-vel platen seeded med 2.5 x 105 CEFs dagen før infeksjon. Fjern celle kultur medium 48t postinfection og legge 500 µL av 4% paraformaldehyde i PBS fikse cellene. Inkuber platen ved romtemperatur for 30 min, og deretter fjerne bindemiddel og vask celle lag 3 x med PBS. Merk: Cellene lagres på 4 ° C på dette trinnet i flere uker.</li>
		<li>Fjerne PBS og legge til 500 µL på 0,1% Triton X-100 å permeabilize celler for 15 min. vask cellen lag 3 x med PBS.</li>
		<li>Blokk uspesifikke bindingen ved å blokkere buffer (5% bovin serum i PBS) 1t.</li>
		<li>Fortynne det primære antistoff anti-VP2 monoklonalt antistoffet HH7 - eller HVT-infiserte kylling serum på 1:200 i blokkering buffer, legge til 200 µL per brønn og ruge ved romtemperatur for 1 h. vask cellen lag 3 x med PBS.</li>
		<li>Fortynne sekundære antistoff geit anti-musen IgG Alexa 568 eller geit anti-kylling IgG Alexa 488 på 1:200 i blokkering buffer, legge til 200 µL per brønn, ruge ved romtemperatur 1t og vaske cellene 3 x med PBS. Sjekk protein uttrykk under fluorescens mikroskop. Merk: Se Figur 4 for en representant VP2 flekker resultatet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sekvensering av VP2 genet
	<ol>
<li>Forsterke DNA sekvensen som spenner over UL45 og UL46 intergenisk regionen med Hi-Fi-DNA polymerase og primere UL45-F1 og UL46-R1 (tabell 1) oppdage hele innsetting.</li>
		<li>Klargjør følgende 50 µL reaksjon blandingen: 5 µL av 10 x Pfx reaksjonen blanding, 1,5 µL av 10 µM oppstrøms og nedstrøms primer mix, 1 µL av 10 mM dNTP mix, 1 µL av 50 mM MgSO4, 1 µL av DNA og 0,5 µL av Pfx DNA utvalg , og legge nuclease-fritt vann til 50 µL. Forsterkning programmet er: 95 ° C i 2 min; 95 ° C i 15 s, 55 ° C for 30 s og 68 ° C i 3 minutter for 35 sykluser. Last alle PCR produktet til 1% agarose gel for gel geleelektroforese.</li>
		<li>Rense PCR produktet følgende instruksjon av en DNA gel rensing kit. Sende 10 µL av PCR produktet (30 ng/µL) til en sekvensering selskapet å bekrefte det banke på VP2 genet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. stabilitet av rekombinant viruset
<ol><li>Frø 2.6 x 106 CEF celler i hver T25 kolbe dagen før viruset utvidelsen.</li>
	<li>Tine minst tre positiv kloner fra trinn 5.2; legge til en flaske av celler/virus i hver T25 kolbe. Ruge på 38,5 ° C med 5% CO2 til en 50% cytopathic effekten er observert.</li>
	<li>Høste cellene i 2 mL kultur medium; infisere 50 µL til en ny T25 kolbe preseeded med CEF celler for neste generasjon. Holde passaging rekombinant viruset i minst 15 generasjoner. Analysere hver generasjon av virus ved PCR etter VP2 sekvensen og indirekte immunofluorescence analysen (IFA) for VP2 uttrykket å vurdere stabiliteten av rekombinant virus.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Witter, R. L., Solomon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+infection+of+turkeys+and+chickens+with+a+herpesvirus+of+turkeys+(HVT).">Experimental infection of turkeys and chickens with a herpesvirus of turkeys (HVT).</a> Avian Diseases. 16 (1), 34-44 (1972).</li><li>Baigent, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesvirus+of+turkey+reconstituted+from+bacterial+artificial+chromosome+clones+induces+protection+against+Marek's+disease.">Herpesvirus of turkey reconstituted from bacterial artificial chromosome clones induces protection against Marek's disease.</a> Journal of General Virology. 87, 769-776 (2006).</li><li>Messerle, M., Crnkovic, I., Hammerschmidt, W., Ziegler, H., Koszinowski, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+mutagenesis+of+a+herpesvirus+genome+as+an+infectious+bacterial+artificial+chromosome.">Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14759-14763 (1997).</li><li>Zhao, Y., Nair, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+the+repeat+regions+of+herpesviruses+cloned+as+bacterial+artificial+chromosomes.">Mutagenesis of the repeat regions of herpesviruses cloned as bacterial artificial chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 634, 53-74 (2010).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+rats+with+conditional+alleles+using+CRISPR/Cas9.">Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9.</a> Cell Research. 24 (1), 122-125 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gene-modified+cynomolgus+monkey+via.+Cas9/RNA-mediated+gene+targeting+in+one-cell+embryos.">Generation of gene-modified cynomolgus monkey via. Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos.</a> Cell. 156 (4), 836-843 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype.">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nature Biotechnology. 32 (6), 551-553 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+chicken+Stra8+gene+knockout+and+inhibition+of+male+germ+cell+differentiation.">CRISPR/Cas9 mediated chicken Stra8 gene knockout and inhibition of male germ cell differentiation.</a> PLoS One. 12 (2), 0172207 (2017).</li><li>Bi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+targeted+editing+of+large+viral+genomes+by+RNA-guided+nucleases.">High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases.</a> PLoS Pathogens. 10 (5), 1004090 (2014).</li><li>Bierle, C. J., Anderholm, K. M., Wang, J. B., McVoy, M. A., Schleiss, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+of+guinea+pig+cytomegalovirus+using+CRISPR/Cas9-mediated+gene+editing.">Targeted mutagenesis of guinea pig cytomegalovirus using CRISPR/Cas9-mediated gene editing.</a> Journal of Virology. 90 (15), 6989-6998 (2016).</li><li>Suenaga, T., Kohyama, M., Hirayasu, K., Arase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+large+viral+DNA+genomes+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Engineering large viral DNA genomes using the CRISPR-Cas9 system.</a> Microbiology and Immunology. 58 (9), 513-522 (2014).</li><li>Xu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+approach+to+manipulate+pseudorabies+virus+genome+by+CRISPR/Cas9+system.">A simple and rapid approach to manipulate pseudorabies virus genome by CRISPR/Cas9 system.</a> Biotechnology Letters. 37 (6), 1265-1272 (2015).</li><li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+editing+the+vaccinia+virus+genome+by+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system.</a> Journal of Virology. 89 (9), 5176-5179 (2015).</li><li>Yuen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+of+Epstein-Barr+virus+in+human+cells.">CRISPR/Cas9-mediated genome editing of Epstein-Barr virus in human cells.</a> Journal of General Virology. 96, 626-636 (2015).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+and+Cre/Lox+system-based+express+vaccine+development+strategy+against+re-emerging+Pseudorabies+virus.">A CRISPR/Cas9 and Cre/Lox system-based express vaccine development strategy against re-emerging Pseudorabies virus.</a> Scientific Reports. 6, 19176 (2016).</li><li>Zou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+duck+enteritis+virus-based+vaccine+against+H5N1+avian+influenza+virus+and+duck+Tembusu+virus+infection.">Construction of a highly efficient CRISPR/Cas9-mediated duck enteritis virus-based vaccine against H5N1 avian influenza virus and duck Tembusu virus infection.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1478 (2017).</li><li>Peng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudorabies+virus+can+escape+from+CRISPR-Cas9-mediated+inhibition.">Pseudorabies virus can escape from CRISPR-Cas9-mediated inhibition.</a> Virus Research. 223, 197-205 (2016).</li><li>Tang, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+pseudorabies+virus+developed+using+the+CRISPR/Cas9+system.">Live attenuated pseudorabies virus developed using the CRISPR/Cas9 system.</a> Virus Research. 225, 33-39 (2016).</li><li>Yao, Y., Bassett, A., Nair, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+editing+of+avian+herpesvirus+vaccine+vector+using+CRISPR/Cas9+nucleases.">Targeted editing of avian herpesvirus vaccine vector using CRISPR/Cas9 nucleases.</a> Journal of Vaccine and Technologies. 1, (2016).</li><li>Tang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+approach+to+develop+recombinant+avian+herpesvirus+vectored+vaccines+using+CRISPR/Cas9+system.">A simple and rapid approach to develop recombinant avian herpesvirus vectored vaccines using CRISPR/Cas9 system.</a> Vaccine. 36 (5), 716-722 (2018).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knock-in+of+large+reporter+genes+in+human+cells+via.+CRISPR/Cas9-induced+homology-dependent+and+independent+DNA+repair.">Knock-in of large reporter genes in human cells via. CRISPR/Cas9-induced homology-dependent and independent DNA repair.</a> Nucleic Acids Research. 44 (9), 85 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Petherbridge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+Gallid+herpesvirus+3+(Marek's+disease+virus+serotype-2)+genome+as+infectious+bacterial+artificial+chromosomes+for+analysis+of+viral+gene+functions.">Cloning of Gallid herpesvirus 3 (Marek's disease virus serotype-2) genome as infectious bacterial artificial chromosomes for analysis of viral gene functions.</a> Journal of Virological Methods. 158 (1-2), 11-17 (2009).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+repair:+53BP1+comes+into+focus.">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway.">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

CRISPR/Cas9 systemet har blitt et verdifullt verktøy i genet redigering. De tradisjonelle teknologiene for rekombinant HVT vektor utvikling, som homologe rekombinasjon13 og BAC mutagenese teknologi25, innebære vanligvis flere runder med vektor kloning og utvalg, samt store screening, som kan ta flere måneder. Protokollen beskrevet her bruker en NHEJ-CRISPR/Cas9-basert strategi grobunn-Lox systemet og encellede sortering er mer en praktisk, effektiv og raskere tilnærming rekombinant vaksine generasjon. Bruker denne rørledningen, rekombinant viruset kan fås i bare 1-2 uker24, og plakk rensing trinnene kan også bli redusert til en enkelt-runde separasjon med fluorescens-aktivert cellen sortering17. Hele prosessen, fra gRNA design og donor byggingen å skaffe renset rekombinant HVT viruset, kan oppnås innen 1 måned. Kritisk trinnene for generasjon vellykket rekombinant HVT omfatter høyeffektive gRNA valg for målretting er viral genomet for å sikre effektiv cleavage for utenlandske genet innsetting, høy hva effektivitet å maksimere sjansen for Cas9 / gRNAs og virus å møte i samme celle for redigering, og 12-timers intervallet mellom transfection av giver og gRNA plasmider og virusinfeksjon slik at Cas9 og gRNA skal uttrykkes på et rimelig nivå før viruset kommer inn i cellene.
Begrensningen for HVT rekombinant generasjon er det innviklet beskaffenhet av identifikasjon av GFP-positive kloner av krysset PCR. GFP-VP2-kassetter kan settes i hver retning. Krysset PCR beskrevet her er bare for identifikasjon av sette i mening retning. Ved innsatsen i antisense retning, PCR bruker primer parene beskrives ikke ville fungere, og interne primerne kan byttes for dette formålet. Et annet potensielt problem er at den donor konstruere kan bare brukes for genet innsetting i samme viruset på grunn av eksistensen av den gjenværende LoxP etter GFP fjerning av grobunn behandling. En ny donor konstruksjon med en variant LoxP sekvens kan brukes i stedet for flere innsetting formål.
NHEJ og HDR (homologi-rettet reparasjon) er to veier å reparere double-strandet pausene (DSBs) opprettet av Cas926,27. NHEJ er mer effektivt som det skjer i cellen syklus28, mens HDR er mindre effektiv og bare oppstår under S og G2 faser6,29,30. Vi utnyttes til mer effektiv NHEJ reparasjon veien her for å innføre utenlandske genene i de målrettede stedene. Selv om NHEJ reparere kan introdusere indeler melder noncompatible eller skadet DNA endene gjennom en homologi-uavhengig mechanistically fleksible prosessen31,32 mellom kløyvde donor sekvensen og genomisk DNA, indeler kan bare forekomme ved spalting sgA og utenlandske genuttrykk kassetten påvirkes ikke. En annen fordel med denne tilnærmingen er at NHEJ er uten begrensning homologi arm konstruksjon, gjør kloning gå veldig grei. Dette ber om et stort potensial for bruk av NHEJ for utenlandske genet innsetting. Innføringen av en universell gRNA målområdet på begge ender av utenlandske genet kassett gjør prosessen raskere som malen giver kan være konstruert straks uten behov for spesielle gRNA valg. Ryggraden i donor plasmider inneholder sgA målområder, LoxP områder og PacI og SfiI områder kan også være delt mye mellom ulike reporter gener, utenlandske genuttrykk kassetter og annet virus vektorer, gir denne nye tilnærmingen fordelen av tilpasning.
Sett inn HVT-skjuler VP2 ble brukt til å beskrive protokollen i dette manuskriptet; samme tilnærming kan imidlertid brukes til å sette inn mer viral gener i genomisk steder i HVT genomet med gRNA målretting ønsket tilsvarende sekvensen for utvikling av multivalent rekombinant HVT vectored vaksiner. Andre MDV vaksine stammer, som SB-1 og CVI988, andre avian herpesviruses, inkludert smittsomme laryngotracheitis virus og duck enteritt virus, og også andre avian DNA virus, som vannkopper virus og adenoviruses, kan også integreres med samme tilnærming for multivalent rekombinant vaksineutvikling. Utviklingen av nye multivalent vectored vaksiner med CRISPR/Cas9 system plattform beskrevet her vil være svært gunstig for fjørfe industrien å beskytte mot flere fjørfe sykdommer.

Mareks sykdom (MD) er en lymphoproliferative sykdom av kyllinger indusert av serotype 1 (Gallid Herpesvirus 2 [GAHV-2]) i slekten Mardivirus på og av Alphaherpesvirinae. Mardivirus omfatter også to attenueres serotyper: serotype 2 (GaHV-3) og serotype 3 (MeHV-1, historisk kjent som HVT) som brukes som vaksiner mot MD. Live HVT vaksine (FC-126 belastning) er den første generasjonen av MD vaccine anvendt i 1970 og fremdeles brukes mye i bivalent og polyvalent vaksine formuleringer for å gi en forbedret beskyttelse mot MD. HVT er også mye brukt som en vaksine vektor for å indusere beskyttelse mot en rekke avian sykdommer på grunn av sin allsidighet og trygghet for både i ovo subkutan klekkeriet administrasjon og evne til å gi en livslang immunitet. Strategien for å generere rekombinant HVT vaksiner er basert på enten konvensjonelle homologe rekombinasjon i virus-infiserte celler, overlappende cosmid DNAs eller BAC mutagenese2. Disse metodene er imidlertid vanligvis tidkrevende og arbeidskrevende, krever bygging av overføring vektorer, vedlikehold av viral genomet i Escherichia coli plakk renselser, og fjerning av BAC sekvensen og utvalg markøren fra redigerte virus3,4.
CRISPR/assosiert (Cas9) er den mest populære genet redigeringsverktøy de siste årene på grunn av sin allsidighet og spesifisitet. CRISPR/Cas9 systemet har blitt brukt i effektiv generasjon av genmodifiserte celler og dyremodeller5,6,7,8,9,10, som vel som manipulering av flere store DNA virus genomer11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20. Etter rapportering en enkel og effektiv metode som bruker CRISPR/Cas9 systemet for å redigere HVT genomet21, utviklet vi en rørledning for rask og effektiv generasjon av rekombinant HVT22.
For å utvide den potensielle anvendelsen av denne metoden, beskriver vi detaljerte metodikken for generering av rekombinant HVT vaksine uttrykke VP2 genet av IBDV på UL45/46 locus i denne rapporten. Tilnærmingen kombinerer NHEJ-CRISPR/Cas9 sett VP2 genet merket med GFP reporter gene og en grobunn-LoxP system for å fjerne GFP uttrykk kassetten senere. Sammenlignet med tradisjonelle rekombinasjon og BAC recombineering teknikker, viser vi at NHEJ-CRISPR/Cas9 sammen med en grobunn-Lox system er en rask og effektiv tilnærming til å generere rekombinant HVT vaksine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:988px;" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">M199 medium, Earle&#39;s Salts</td>
			<td style="width:221px;">Life technology</td>
			<td style="width:163px;">11150059</td>
			<td style="width:235px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140148</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td>antifunigal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptose Phosphate Broth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8782</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HVT Fc126 strain</td>
			<td>Avian Disease and Oncology Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>wildtype HVT virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pX459-v2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #62988</td>
			<td>Cas9 and gRNA expression vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-T Easy Vector Systems</td>
			<td>promega</td>
			<td>A1360</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Subcloning Efficiency DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>rR0547S</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SfiI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0123S</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-X2</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 6004</td>
			<td>transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture 6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Master Mixes</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td>junction PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum Pfx DNA Polymerase</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11708021</td>
			<td>PCR amplification of full insert</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>immunoflourescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td>immunoflourescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica TCS SP5 LASAF</td>
			<td>immunoflourescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS cell sorter</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>BD FACSAria</td>
			<td>single cell sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (4% in PBS)</td>
			<td>Santa cruz biotechnology</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td>cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30960</td>
			<td>permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating recombinant avian herpesvirus vectors with crispr/cas9 gene editing

Herpesvirus av kalkuner (HVT) er en ideell viral vektor for generering av rekombinant vaksiner mot en rekke avian sykdommer, som fugleinfluensa (AI), Newcastle sykdom (ND) og bursal infeksjonssykdommer (IBD), ved hjelp av bakteriell kunstig kromosom ( BAC) mutagenese eller konvensjonelle rekombinasjon metoder. De klynget regelmessig interspaced palindromic gjentar (CRISPR) / Cas9 systemet har blitt brukt i mange innstillinger for genet redigering, inkludert manipulering av flere store DNA virus genomer. Vi har utviklet en rask og effektiv CRISPR/Cas9-mediert genomet redigering rørledning for å generere rekombinant HVT. For å maksimere den potensielle bruken av denne metoden, presenterer vi her detaljert informasjon om metoder for å generere rekombinant HVT uttrykke VP2 protein av IBDV. VP2 uttrykk kassetten settes inn i den HVT genom via en NHEJ (nonhomologous slutten-bli med)-avhengige reparasjon veien. En grønn fluorescens protein (GFP) uttrykk kassett er først knyttet til innsatsen for enkel visualisering og deretter fjernet via grobunn-LoxP systemet. Denne tilnærmingen gir en effektiv måte å introdusere andre viral antigener i HVT genomet for rask utvikling av rekombinant vaksiner.

Strategien som brukes for generering av rekombinant HVT vaksinen er skissert i figur 1, som inkluderer hvordan donor plasmider er konstruert (figur 1A) og prosedyrer for å generere rekombinant HVT (figur 1B ). Til tretti GFP-positive plaketter omgitt av vill-type plaketter kan observeres i genet banket i brønner under fluorescens mikroskop 3 d posttransfection og -infeksjon. Det renset viruset innhentet etter encellede sortering (figur 2A) ble analysert av 3 krysset PCR, som viser et PCR-produkt av den forventede størrelsen (figur 2A, nedre panelet). Etter excision av GFP reporteren av grobunn recombinase mistet over 50% av plaketter sine GFP uttrykk. Renset plakk etter GFP excision (figur 2B) av encellede sortering ble ytterligere bekreftet av 5' krysset PCR, som viser riktig størrelse PCR produktet (figur 2B, nedre panelet). Figur 3 viser sekvensering resultatet av begge krysset PCR produkter med forskjellige fargede elementer. I Figur 4, ble protein uttrykket bekreftet av IFA med VP2-spesifikke monoklonale antistoffer og anti-HVT kylling serum. Som forventet, kan celler infisert med det foreldre HVT bare være farget av anti-HVT serum (grønn), mens rekombinant HVT-infiserte celler tydelig viste uttrykket av VP2 genet (rød).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig1.jpg"> Figur 1: strategi for generering av en rekombinant HVT-vectored vaksine. (A) dette panelet viser en skjematisk fremstilling av kloning strategien for donor plasmider konstruksjon. Nøkkelelementene inkluderer to Cas9 målområder (sgA) for å slippe innsetting, en reporter GFP kassett flankert med LoxP sekvenser for excision av GFP og VP2 uttrykk kassetten. (B) dette panelet viser en oversikt over en to-trinns genet banke i strategi. Sett inn fragmentet av GFP og VP2 uttrykk kassetter er utgitt av Cas9/sgA cleavage og settes inn i HVT genomet på UL45/46 loci via NHEJ-CRISPR/Cas9. GFP-positive rekombinant viruset er deretter sortert og renset encellede fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). Deretter GFP reporter genet er forbrukeravgift av grobunn recombinase og rekombinant viruset er renset og preget. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig2.jpg"> Figur 2 : Verifisering av rekombinant HVT. (A) dette panelet viser en GFP-positive plakett (HVT-GFP-VP2) visualisert under fluorescens mikroskopet (topp panel) og PCR verifisering av HVT-GFP-VP2 med primer VP2-F & UL46-R1 for 3 krysset. (B) dette panelet viser en plakett (HVT-VP2) visualisert etter GFP excision av HVT-GFP-VP2, bruke grobunn recombinase og PCR verifisering av HVT-VP2 med primer UL45-F1 og VP2-R1 for 5' krysset. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig3.jpg"> Figur 3 : Sekvens analyse av rekombinant HVT viruset. (A) sekvenser av de viktigste elementene i forskjellige farger i dette panelet er HVT intergenisk regionen mellom UL45/46 gRNA målet sekvens understreket og en pil viser webområdet Cas9 cleavage, VP2 uttrykk kassetten med slutten sekvenser i kursiv små, den sg-A mål sekvensen i rødt med pilen viser Cas9 cleavage området, LoxP området sekvensen i grønt og to SfiI nettsteder sekvenser i blått. (B) dette panelet viser sekvensering resultatene av de 5' og 3 knutepunktene og en skjematisk fremstilling av HVT-VP2 med viktige elementer med tilsvarende farger i sekvenser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig4.jpg"> Figur 4 : Karakterisering av rekombinant HVT-VP2. Dette panelet viser bekreftelse av vellykket uttrykk for VP2 i infiserte CEFs av indirekte immunofluorescence analysen (IFA) med anti-VP2 monoklonalt antistoff HH7 (rød). HVT infeksjon bekreftes av IFA med HVT-infiserte kylling serum (grønn). Baren skala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Generere rekombinant Avian Herpesvirus vektorer med CRISPR/Cas9 Gene redigering

Herpesvirus av kalkuner (HVT) er mye brukt som en vektor plattform for generering av rekombinant vaksiner mot en rekke avian sykdommer. Denne artikkelen beskriver en enkel og rask tilnærming for generering av rekombinant HVT-vectored vaksiner med en integrert NHEJ-CRISPR/Cas9 og grobunn-Lox system.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Denne tilnærmingen gir en effektiv måte å introdusere andre virale antigener i HVT-genomet for rask utvikling av rekombinante vaksiner. Noen fordel med denne teknikken er at en GFP uttrykk kassett er festet til innsatsen først for enkel visualisering og deretter fjernet av Cre-LoxP system. Den samme tilnærmingen kan brukes til å sette inn flere virale gener på forskjellige steder av HVT-genomet, eller andre fugle herpesvirus for utvikling av multivalente rekombinante vaksiner.Demonstrere prosedyren vil være Katy Moffat, en ekspert på celle sortering. Na Tang, Yaoyao Zhang og Guanggang Qu, forskere fra laboratoriet mitt. Dagen før transfection forberede chick embryo fibroblasts som beskrevet i tekstprotokollen.Seed 1,3 millioner celler i 2,5 milliliter medium i hver brønn av en seks brønnplate. Transfect CEF cellene med 0,5 mikrogram hver av de to Cas9 guide RNA plasmids, og ett mikrogram av donor plasmid ved hjelp av en passende transfection reagens i henhold til produsentens instruksjoner. Inkuber cellene ved 38,5 grader Celsius med 5% karbondioksid i 12 timer.12 timer etter transfeksjon fortynne HVT virus lager med M199 kultur medium til en konsentrasjon på 100,000 plakk forming enheter per milliliter. Tilsett 130 mikroliter av det fortynnede viruset til hver brønn av trans infiserte celler. Angi en brønn av uovers infiserte celler som en negativ kontroll og legg til samme antall virus.Inkuber cellene ved 38,5 grader Celsius med 5% karbondioksid i tre dager. Dagen før sortering forberede to 96 brønnplater ved å så 20,000 celler i hver brønn. Tre dager etter infeksjon hente de seks brønnplatene som inneholder de trans infiserte og infiserte CEFs.Aspirer mediet fra hver brønn og skyll cellearket med PBS. Tilsett en milliliter på 0,05% trypsin-EDTA til hver brønn og inkuber cellene ved 38,5 grader Celsius med 5% karbondioksid i ca fem minutter. Deretter bruker cellene på nytt med 50 mikroliter FBS og overfører denne suspensjonen til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Sentrifuge på 200 ganger tyngdekraften i fem minutter. Bruk cellene på en milliliter PBS som inneholder 1%FBS. Bruk et hemocytometer for å telle cellene og justere celletettheten til en million celler per milliliter.Deretter overfører du cellene til et polystyrensorteringsrør gjennom silhetten. Ved hjelp av en cellesorter sortere enkeltcellene som uttrykker GFP i de preseeded 96 brønnplater. Inkuber platene med de sorterte cellene ved 38,5 grader Celsius med 5% karbondioksid i fem dager.Etter fem dager bruker fluorescensmikroskopet til å kontrollere de 96 brønnplatene og markere brønnene som inneholder en enkelt GFP-positiv plakk. Prøv hver GFP positivt godt med 50 mikroliter trypsin-EDTA i tre minutter. Deretter legger du til 50 mikroliter kulturmedium for å gjenbruke cellene og overføre denne suspensjonen til en brønn av en seks brønnplate med CEFs.Etter tre dager fryse ned ett hetteglass av hver av den første generasjonen av rekombinante virus i frysemediet. Oppbevar disse høstede virusene i flytende nitrogen. Samle 100 000 celler fra hver av den første generasjonen av virus.Sentrifuge cellene ved 2000 rpm i fem minutter, og kast supernatanten. Oppbevar cellene ved negative 20 grader Celsius til de er klare til å utføre DNA-ekstraksjon. Når du er klar til å utføre DNA ekstraksjon bruk 50 mikroliter squishing buffer for å tine og gjenbruke cellepellets.Lyse prøvene på 65 grader Celsius i 30 minutter og deretter på 95 grader Celsius i to minutter for å inaktivere Proteinase K.Utfør en PCR-reaksjon med tre førsteklasses veikryss primere ved hjelp av en mikroliter av hver DNA-prøve som beskrevet i tekstprotokollen. Legg to mikroliter av forsterkningsproduktene til en brønn på 1% agarose gel for gelelektroforese. For å fjerne GFP-genet fra rekombinantviruset, bruk en transfeksjonsreagens til å transfisere to mikroliter av Cre rekombineruttrykk plasmid inn i seks brønnplaten som er preseeded med CEF-celler.12 timer etter transfeksjon tine ett hetteglass med rekombinant virus fra flytende nitrogen. Forsiktig resuspend viruset og frø 50 mikroliter i hver brønn av trans infiserte celler, sette en samt den negative kontrollen med samme mengde virus. Inkuber på 38,5 grader Celsius i tre dager.72 timer etter infeksjon forberede cellene for sortering som tidligere beskrevet. Sorter enkelt ikke-fluorescerende celler i en 96 brønnplate preseeded med CEFs. Deretter prøver du å infisere de valgte plakkene og gjenbruke de tilsvarende cellene som beskrevet i tekstprotokollen.Send halvparten av cellene inn i hver brønn av en 96 brønnplate som har blitt preseeded med CEFs som andre generasjon. Sentrifuge de resterende cellene i hver klone på 200 ganger tyngdekraften i fem minutter. Kast de overnaturante og gjenoppuspend cellene med 50 mikroliter squishing buffer for DNA ekstraksjon.Deretter utfører du PCR med fem prime junction primere ved hjelp av en mikroliter av DNA-mal som beskrevet i tekstprotokollen. Basert på PCR-resultatene velger du tre til fem positive kloner av rekombinant HVT for videre passasjer og verifisering. Infisere cefs med andre generasjon rekombinant HVT i en preseeded 24 brønnplate.48 timer etter infeksjon fjerne kulturmediet og legge til 500 mikroliter på 4% paraformaldehyd i PBS for å fikse cellene. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Deretter fjerner du fikseringen og vasker cellelaget tre ganger med PBS.Fjern PBS og legg til 500 mikroliter på 0,1% Triton X-100 for å gjennomsyre cellene. Etter 15 minutter vask cellelaget tre ganger med PBS. Legg til blokkeringsbuffer i én time for å blokkere uspesifikk binding.Deretter fortynner du det primære antistoffantistoffet anti-VP2 monoklonalt antistoff HH7 eller HVT-infisert kyllingserum på ett til 200 i blokkerende buffer. Tilsett 200 mikroliter av det fortynnede primære antistoffet til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i en time. Vask cellelaget tre ganger med PBS.Fortynn den sekundære antistoff geit anti-mus IgG Alexa 568 eller geit anti-kylling IgG Alexa 488 på en til 200 i blokkerende buffer. Tilsett 200 mikroliter fortynnet sekundært antistoff til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i en time. Vask deretter cellene tre ganger med PBS.Bruk fluorescensmikroskopet til å kontrollere proteinuttrykket. Dagen før viruset ekspansjon frø 2,6 millioner CEF celler i hver T25 kolbe. Tin minst tre positive kloner og tilsett ett hetteglass med celler eller virus i hver kolbe.Inkuber kolben ved 38,5 grader Celsius med 5% karbondioksid til en 50% cytopatisk effekt observeres. Deretter høster cellene i to milliliter kulturmedium. Infisere 50 mikroliter til en ny T25 kolbe som var preseeded med CEF-celler for neste generasjon.Fortsett å passere det rekombinante viruset i minst 15 generasjoner. Ved hjelp av PCR analysere hver generasjon av virus for tilstedeværelse av VP2 sekvensen. Ved hjelp av en indirekte immunofluorescence analyse analysere hver generasjon av virus av VP2 uttrykk.Etter enkeltcellesortering analyseres det oppnådde rensede viruset av tre prime junction PCR, som viser et PCR-produkt av forventet størrelse. Etter eksisjonen av GFP reporter av Cre recombinase over 50% av plakkene mistet sitt GFP uttrykk. Den rensede plakk etter GFP excision er oppnådd ved enkeltcellesortering og er ytterligere bekreftet av fem prime junction PCR som viser produktet av forventet størrelse.Proteinuttrykket bekreftes deretter av indirekte immunofluorescence analyse med VP2 spesifikt monoklonalt antistoff og anti-HVT kyllingserum. Som forventet kan celler infisert med foreldreHVT bare farges av anti-HVT serum. Mens rekombinante HVT-infiserte celler tydelig viser uttrykket av VP2-genet.For å generere et rekombinant virus er det nødvendig med høy transfeksjonshastighet for å maksimere sjansen for viruset og innsatsen for å møte i samme celle for redigering for å finne sted. Etter denne prosedyren kan dyreforsøk utføres for å vurdere immunogeniteten og effekten av rekombinante vaksiner. Utviklingen av nye multivalente vektorvaksiner ved hjelp av CRISPR/Cas9 systemplattform beskrevet her vil være svært gunstig for fjærfeindustrien å beskytte mot flere fjærfesykdommer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produksjon og Titering av rekombinant Adeno-assosiert virale vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Effektiv Rekombinant Parvovirus Produksjonen ved hjelp av Adenovirus deriverte Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-assosiert virus (AAV) genterapi vektorer via DNA Family shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel og effektiv tilnærming til Konstruer Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse av lymfocytt-ekstravasasjon ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det menneskelige blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

CRISPR-Cas9-baserte genomet Engineering generere Jurkat Reporter modeller for HIV-1 smitte med valgte Proviral integrasjon nettsteder

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Anvendelse av konsekvent massasje-lignende forstyrrelser på mus kalver og overvåking av resulterende intramuskulær trykk endringer

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...