Name: generating recombinant avian herpesvirus vectors with crispr/cas9 gene editing
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

Författarna vill tacka Pippa Hawes för att hjälpa med de confocal imaging. Projektet stöddes av bioteknik och biologiska vetenskaper forskning rådet (BBSRC) beviljar BBS/E/jag/00007034 och BB/L014262/1.

1. beredning av Cas9/gärna uttryck och givare konstruerar
<ol><li>
Byggandet av Cas9/gärna uttryck plasmider
	<ol>
<li>Designa en gärna sekvens inriktning intergenic regionen mellan UL45 och UL46 gener av HVT som tidigare beskrivits22. Justera sekvensen guide-RNA mål mot HVT genomet att utesluta eventuella potentiella off-target sekvenser i genomet HVT. Syntetisera och klona sekvensen gärna riktar sig UL45/46 regionen och sg-en sekvens från publicerade data23 till pX459-V2 som tidigare beskrivits22. Verifiera klonade gärna sekvensen Sanger sekvensering med U6-Fwd primer24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Byggandet av givare plasmid
	<ol>
<li>Generera en givare plasmid som innehåller VP2 uttryck kassett med en flyttbar GFP reporter kassett etiketten, designa oligos givare-F och givare-R som innehåller följande delar (figur 1A och figur 3A): en sg-A målet sekvens i båda ändar, en PacI webbplats flankerad med två LoxP sekvenser för god Jordbrukarsed reporter kassett kloning och excision, och två SfiI platser för kloning av VP2 uttryck kassett.</li>
		<li>Klona sekvensen i en pGEM-T-lätt vektor och sedan klona GFP och VP2 gen kassetter i den resulterande vektorn att generera givare plasmiden betecknas som pGEM-sgA-GFP-VP222. Obs: Varje kloning vektor kan användas för att konstruera givare plasmid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plasmid DNA förberedelse
	<ol>
<li>Förbereda både donator plasmid och Cas9/gärna uttryck plasmid DNAs med en kommersiell DNA extraktion enligt tillverkarens anvisningar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CRISPR/Cas9-medierad inpressning: Transfection och infektion
<ol><li>Dagen innan transfection, förbereda chick embryo fibroblaster (CEFs) för transfection/infektionen, använda 10 - dagar gamla embryon i M199 medium kompletteras med 5% fetalt bovint serum (FBS), 10% Tryptos fosfat buljong, 100 U/mL penicillin-streptomycin, och 0,25 µg/mL fungizone. Utsäde 1,3 x 106 celler per brunn i varje brunn 6-well platta i 2,5 mL medium. Obs: CEF celler kan förvaras i 3 d vid 4 ° C.</li>
	<li>Transfect CEF celler (beredd i steg 2.1) med 0,5 µg av UL45/46-gärna, 0,5 µg av sg-A och 1 µg av pGEM-sgA-GFP-VP2 med användande av lämpliga transfection reagens enligt tillverkarens anvisningar. Inkubera cellerna för 12 h i en inkubator (vid 38,5 ° C med 5% CO2).</li>
	<li>12 h posttransfection av Cas9/gärna och givare plasmider, späd HVT virus beståndet med M199 odlingsmedium till 1 x 105 pfu/mL. Tillsätt 130 µL utspädda viruset i varje brunn transfekterade celler och en väl untransfected celler som en negativ kontroll med samma kvantitet av virus. Inkubera transfekterade/smittade cellerna för 3 d på 38,5 ° C med 5% CO2. Utför alla procedurer använder gemensamma uppförandekoden (JCoPR) godkänd av finansiärerna.</li>
</ol>3. skörd och rening av HVT rekombinanta Virus
<ol><li>
Fluorescens-aktiverad cell sortering
	<ol>
<li>Förbered två 96 brunnar preseeded med 2 x 104 CEF celler per väl dagen före sortering.</li>
		<li>Trypsinize transfekterade/smittade CEFs 3 d angripen. Aspirera på medellång från varje brunn och skölj cellagret med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt 1 mL 0,05% trypsin-EDTA (0,48 mM) till trypsinize cellerna i inkubatorn 38,5 ° C under cirka 5 minuter.</li>
		<li>Omsuspendera och överföra cellerna i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör med 50 µL av FBS. Centrifugera vid 200 x g under 5 minuter.</li>
		<li>Att resuspendera cellerna i 1 mL PBS med 1% FBS. Räkna den cell nummer med hjälp av en hemocytometer och justera antalet celler till 1 x 106 celler/mL. Obs: Celler kan förvaras på is för 1-2 h.</li>
		<li>Överföra cellerna till en polystyren sortering slang genom sin SIL mössa. Sortera de enstaka celler som uttrycker GFP till 96 brunnar som ympats med CEFs använder cell Sorteraren enligt tillverkarens anvisning. Inkubera sorterade cellerna för 5 d på 38,5 ° C med 5% CO2. Obs: En passage av rekombinanta virus kan behövas före sortering om det finns alltför många singelcellerna av GFP-uttryck och några GFP-positiv plack i den ursprungliga väl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging av rekombinanta virus
	<ol>
<li>Laga 6 brunnar som ympats med 1,3 x 106 CEF celler per väl dagen innan passagen. 5 d postsorting, kontrollera 96 brunnar plattorna i fluorescens Mikroskop. Markera de brunnar som innehåller en enda GFP-positiv plack. Obs: Se figur 2A för en representativ GFP-positiv plack.</li>
		<li>Trypsinize varje GFP-positiv bra med 50 µL av trypsin-EDTA för 3 min, tillsätt 50 µL av odlingsmedium, Omsuspendera och överföra cellerna i en brunn 6-well platta med CEFs. Detta blir den första generationen av rekombinant HVT.</li>
		<li>Skörda den första generationen av rekombinanta virus 3 d senare, frysa ner en flaska av varje i 1 mL av frysning medium innehållande 10% fetalt kalvserum (FCS), 10% dimetyl sulfoxid (DMSO) och 80% odlingsmedium och lagra virus i flytande kväve. Obs: Skördetid varierar från 2-4 d beroende på belopp och spridning kapaciteten av viruset.</li>
		<li>Samla 1 x 105 celler i varje första generationen av virus, Centrifugera dem och kasta bort supernatanten. Lagra cellerna vid-20 ° C för DNA-extraktion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Påvisande av genomisk införande av polymeras-kedjereaktion
	<ol>
<li>För DNA-extraktion, avfrostning och resuspendera cellpelleten från steg 3.2.4 med 50 µL av mosa buffert (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1mM EDTA, 25 mM NaCl, och 200 µg/mL proteinas K) och lysera proverna vid 65 ° C i 30 min och , sedan, vid 95 ° C i 2 min att inaktivera den proteinas K.</li>
		<li>Utföra ett polymeras-kedjereaktion (PCR) med 3' junction grundfärger (tabell 1) använder 1 µL DNA-provet. För varje prov, förbereda de följande 20 µL reaktionsblandning på is: 2 x PCR Master Mix (10 µL), 10 µM uppströms primer (0,5 µL), 10 µM nedströms primer (0,5 µL), DNA-mall (1 µL) och nuclease-fritt vatten (8 µL). Förstärkning programmet är: 95 ° C under 2 min; 95 ° C i 30 s, 55 ° C för 30 s och 72 ° C under 40 s för 35 cykler; 72 ° C under 7 min. belastning 2 µL av produkterna som förstärkning till en brunn 1% agarosgel för gelelektrofores. Obs: Se figur 2A för representativa resultat av 3' korsningen PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. excision av fluorescerande Reporter gen via den Cre-lox systemet
<ol><li>Ta bort den GFP-genen från rekombinanta virus, transfect 2 µg av Cre recombinase uttryck plasmid i 6-väl plattan preseeded med CEF celler, använder en transfection reagens följa tillverkarens instruktioner.</li>
	<li>12 h posttransfection, Frosta en injektionsflaska med rekombinanta virus från flytande kväve, Omsuspendera försiktigt, utsäde 50 μl till varje brunn transfekterade celler och ange en brunn som den negativa kontrollen med samma mängd virus. Inkubera i 3 d på på 38,5 ° C med 5% CO2.</li>
</ol>5. plack rening
<ol><li>
Fluorescens-aktiverad cell sortering
	<ol>
<li>Utsäde två 96 brunnar plattor med 2 x 104 CEF celler per väl dagen före sortering.</li>
		<li>Följ procedurerna som beskrivs i steg 3.1 72 h angripen (från steg 4) för att förbereda de infektera cellerna för sortering. Sortera de enda nonfluorescence cellerna i 96 brunnar som ympats med CEFs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging av rekombinanta virus och PCR-bekräftelse
	<ol>
<li>Välj 5-10 enstaka nonfluorescence plack 5 d postsorting, trypsinize dem med 50 µL av trypsin-EDTA vid 38,5 ° C under 3 minuter och tillsätt 50 µL av odlingsmedium för att resuspendera cellerna. Obs: Se figur 2B för en representativ GFP-negativ plack.</li>
		<li>Passera hälften av cellerna i varje brunn 6-well platta preseeded med CEFs som den andra generationen.</li>
		<li>Centrifugera återstående cellerna i varje klon vid 200 x g i 5 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna med 50 µL av mosa buffert för DNA-extraktion.</li>
		<li>Utför PCR med 5' junction grundfärger (tabell 1) med 1 µL DNA mall med samma PCR-reaktion villkor som beskrivs i steg 3.3.2. Obs: Se figur 2B för representativa resultat av 5' junction PCR.</li>
		<li>Baserat på PCR-resultaten, välja tre till fem positiva kloner av rekombinant HVT för ytterligare passager och verifiering.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. kontroll av den rekombinanta HVT
<ol><li>
Indirekt immunofluorescens assay
	<ol>
<li>Infektera CEFs med den andra generationen av rekombinant HVT erhållits från steg 5.2 i den 24-väl plattan seedade med 2.5 x 105 CEFs dagen innan infektion. Ta bort den cell odlingsmedium 48 h angripen och tillsätt 500 µL av 4% PARAFORMALDEHYD i PBS fixar cellerna. Inkubera plattan i rumstemperatur i 30 min och ta sedan bort fixeringsvätskan och tvätta celllagrar 3 x med PBS. Obs: Cellerna kan lagras vid 4 ° C i detta steg i flera veckor.</li>
		<li>Ta bort PBS och tillsätt 500 µL 0,1% Triton x-100 till permeabilize cellerna för 15 min. Tvätta cellen layer 3 x med PBS.</li>
		<li>Blockera ospecifik bindning genom att lägga till blockerande buffert (5% bovint serum i PBS) för 1 h.</li>
		<li>Späd den primära antikropp anti-VP2 monoklonala antikroppen HH7 - eller HVT-infekterade kyckling serum på 1: 200 i blockerande buffert och tillsätt 200 µL per brunn Inkubera vid rumstemperatur för 1 h. Tvätta cellen layer 3 x med PBS.</li>
		<li>Späd den sekundära antikroppar get antimus IgG Alexa 568 eller get anti kyckling IgG Alexa 488 på 1: 200 i blockerande buffert, tillsätt 200 µL per brunn, inkubera i rumstemperatur i 1 h och tvätta cellerna 3 x med PBS. Kontrollera proteinuttryck i fluorescens Mikroskop. Obs: Se figur 4 för en representant VP2 färgning resultat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sekvensering av genen VP2
	<ol>
<li>Förstärka den DNA-sekvens som spänner över UL45 och UL46 intergenic regionen med HiFi-DNA-polymeras och primers UL45-F1 och UL46-R1 (tabell 1) för att upptäcka hela insättningspunkten.</li>
		<li>Förbereda de följande 50 µL reaktionsblandning: 5 µL 10 x Pfx reaktionsblandning, 1,5 µL 10 µM uppströms och nedströms primer mix, 1 µL 10 mM dNTP mix, 1 µL 50 mM MgSO4, 1 µL DNA mall och 0,5 µL Pfx DNA-polymeras , och tillsätt 50 µL nuclease-gratis vatten. Förstärkning programmet är: 95 ° C under 2 min; 95 ° C under 15 s, 55 ° C för 30 s och 68 ° C för 3 min för 35 cykler. Ladda alla av PCR-produkten till 1% agarosgel för gelelektrofores.</li>
		<li>Rena PCR-produkten efter anvisningen av ett DNA gel rening kit. Skicka 10 µL av PCR-produkten (30 ng/µL) till ett sekvensering företag att bekräfta inpressning av VP2 genen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. stabilitet av rekombinanta Virus
<ol><li>Utsäde 2.6 x 106 CEF celler i varje T25 kolv dagen innan viruset expansion.</li>
	<li>Tina upp minst tre positiva kloner från steg 5.2; lägga till en injektionsflaska med celler/virus i varje T25 kolv. Inkubera vid 38,5 ° C med 5% CO2 tills en 50% cytopatisk effekt observeras.</li>
	<li>Skörda cellerna i 2 mL odlingsmedium; infektera 50 µL till en ny T25-kolv preseeded med CEF celler för nästa generation. Hålla passaging rekombinanta virus för minst 15 generationer. Analysera varje generation av virus med PCR för förekomst av sekvensen VP2 och genom indirekt immunofluorescens assay (IFA) för VP2 uttryck att bedöma stabiliteten i de rekombinanta virus.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Witter, R. L., Solomon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+infection+of+turkeys+and+chickens+with+a+herpesvirus+of+turkeys+(HVT).">Experimental infection of turkeys and chickens with a herpesvirus of turkeys (HVT).</a> Avian Diseases. 16 (1), 34-44 (1972).</li><li>Baigent, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesvirus+of+turkey+reconstituted+from+bacterial+artificial+chromosome+clones+induces+protection+against+Marek's+disease.">Herpesvirus of turkey reconstituted from bacterial artificial chromosome clones induces protection against Marek's disease.</a> Journal of General Virology. 87, 769-776 (2006).</li><li>Messerle, M., Crnkovic, I., Hammerschmidt, W., Ziegler, H., Koszinowski, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+mutagenesis+of+a+herpesvirus+genome+as+an+infectious+bacterial+artificial+chromosome.">Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14759-14763 (1997).</li><li>Zhao, Y., Nair, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+the+repeat+regions+of+herpesviruses+cloned+as+bacterial+artificial+chromosomes.">Mutagenesis of the repeat regions of herpesviruses cloned as bacterial artificial chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 634, 53-74 (2010).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+rats+with+conditional+alleles+using+CRISPR/Cas9.">Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9.</a> Cell Research. 24 (1), 122-125 (2014).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+gene-modified+cynomolgus+monkey+via.+Cas9/RNA-mediated+gene+targeting+in+one-cell+embryos.">Generation of gene-modified cynomolgus monkey via. Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos.</a> Cell. 156 (4), 836-843 (2014).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype.">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nature Biotechnology. 32 (6), 551-553 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+chicken+Stra8+gene+knockout+and+inhibition+of+male+germ+cell+differentiation.">CRISPR/Cas9 mediated chicken Stra8 gene knockout and inhibition of male germ cell differentiation.</a> PLoS One. 12 (2), 0172207 (2017).</li><li>Bi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+targeted+editing+of+large+viral+genomes+by+RNA-guided+nucleases.">High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases.</a> PLoS Pathogens. 10 (5), 1004090 (2014).</li><li>Bierle, C. J., Anderholm, K. M., Wang, J. B., McVoy, M. A., Schleiss, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+of+guinea+pig+cytomegalovirus+using+CRISPR/Cas9-mediated+gene+editing.">Targeted mutagenesis of guinea pig cytomegalovirus using CRISPR/Cas9-mediated gene editing.</a> Journal of Virology. 90 (15), 6989-6998 (2016).</li><li>Suenaga, T., Kohyama, M., Hirayasu, K., Arase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+large+viral+DNA+genomes+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Engineering large viral DNA genomes using the CRISPR-Cas9 system.</a> Microbiology and Immunology. 58 (9), 513-522 (2014).</li><li>Xu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+approach+to+manipulate+pseudorabies+virus+genome+by+CRISPR/Cas9+system.">A simple and rapid approach to manipulate pseudorabies virus genome by CRISPR/Cas9 system.</a> Biotechnology Letters. 37 (6), 1265-1272 (2015).</li><li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiently+editing+the+vaccinia+virus+genome+by+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system.</a> Journal of Virology. 89 (9), 5176-5179 (2015).</li><li>Yuen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+of+Epstein-Barr+virus+in+human+cells.">CRISPR/Cas9-mediated genome editing of Epstein-Barr virus in human cells.</a> Journal of General Virology. 96, 626-636 (2015).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR/Cas9+and+Cre/Lox+system-based+express+vaccine+development+strategy+against+re-emerging+Pseudorabies+virus.">A CRISPR/Cas9 and Cre/Lox system-based express vaccine development strategy against re-emerging Pseudorabies virus.</a> Scientific Reports. 6, 19176 (2016).</li><li>Zou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+duck+enteritis+virus-based+vaccine+against+H5N1+avian+influenza+virus+and+duck+Tembusu+virus+infection.">Construction of a highly efficient CRISPR/Cas9-mediated duck enteritis virus-based vaccine against H5N1 avian influenza virus and duck Tembusu virus infection.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1478 (2017).</li><li>Peng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudorabies+virus+can+escape+from+CRISPR-Cas9-mediated+inhibition.">Pseudorabies virus can escape from CRISPR-Cas9-mediated inhibition.</a> Virus Research. 223, 197-205 (2016).</li><li>Tang, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+pseudorabies+virus+developed+using+the+CRISPR/Cas9+system.">Live attenuated pseudorabies virus developed using the CRISPR/Cas9 system.</a> Virus Research. 225, 33-39 (2016).</li><li>Yao, Y., Bassett, A., Nair, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+editing+of+avian+herpesvirus+vaccine+vector+using+CRISPR/Cas9+nucleases.">Targeted editing of avian herpesvirus vaccine vector using CRISPR/Cas9 nucleases.</a> Journal of Vaccine and Technologies. 1, (2016).</li><li>Tang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+approach+to+develop+recombinant+avian+herpesvirus+vectored+vaccines+using+CRISPR/Cas9+system.">A simple and rapid approach to develop recombinant avian herpesvirus vectored vaccines using CRISPR/Cas9 system.</a> Vaccine. 36 (5), 716-722 (2018).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knock-in+of+large+reporter+genes+in+human+cells+via.+CRISPR/Cas9-induced+homology-dependent+and+independent+DNA+repair.">Knock-in of large reporter genes in human cells via. CRISPR/Cas9-induced homology-dependent and independent DNA repair.</a> Nucleic Acids Research. 44 (9), 85 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Petherbridge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+Gallid+herpesvirus+3+(Marek's+disease+virus+serotype-2)+genome+as+infectious+bacterial+artificial+chromosomes+for+analysis+of+viral+gene+functions.">Cloning of Gallid herpesvirus 3 (Marek's disease virus serotype-2) genome as infectious bacterial artificial chromosomes for analysis of viral gene functions.</a> Journal of Virological Methods. 158 (1-2), 11-17 (2009).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li><li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+break+repair:+53BP1+comes+into+focus.">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway.">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

CRISPR/Cas9 systemet har blivit ett värdefullt verktyg i gen redigering. Den traditionella tekniken för rekombinant HVT vektor utveckling, såsom homolog rekombination13 och BAC mutagenes teknik25, innebära brukar flera omgångar av vektor kloning och urval, samt storskalig screening, som kan ta flera månader. Protokollet beskrivs här med ett NHEJ-CRISPR/Cas9-baserade strategi kombinerad med Cre-Lox system och encelliga sortering är mer en bekväm, effektiv och snabbare metod i rekombinant vaccin generation. Använd denna rörledning, rekombinanta virus kan erhållas inom endast 1-2 veckor24och plack reningssteg kan också reduceras till en enda-runda separation med fluorescens-aktiverad cell sortering17. Hela processen, från gärna design och givare konstruktion att erhålla renat rekombinant HVT viruset, kan uppnås inom 1 månad. De kritiska steg för lyckad rekombinant HVT generation inkluderar högeffektiv gärna markeringen för att rikta det virala genomet för att säkerställa effektiv klyvning för utländska gen införande, hög transfection effektivitet att maximera chansen för Cas9 / gRNAs och viruset att mötas i samma cell för redigering och 12 timmars intervall mellan transfection av givare och gärna plasmidsna och viral infektion att låta Cas9 och gärna uttryckas på en rimlig nivå innan viruset kommer in i cellerna.
Begränsningen för HVT rekombinant generation är komplexiteten i identifiering av GFP-positiva kloner av korsningen PCR. GFP-VP2 korgarna kunde infogas i antingen orientering. Korsningen PCR beskrivs här är endast för identifiering av skäret i avkänningen orientering. Vid skäret i antisense orientering, PCR använder primer paren beskrivs inte skulle fungera, och inre primers kan bytas för detta ändamål. Ett annat möjligt problem är att den givare bygga endast kan användas för en gen införande i samma virus på grund av förekomsten av återstående LoxP sekvensen efter GFP avlägsnande av Cre behandling. En ny givare konstruktion med en variant LoxP sekvens kan användas istället för flera införande syften.
NHEJ och HDR (homologi-regisserad reparation) är de två vägarna att reparera dubbelsträngat raster (DSBs) skapad av Cas926,27. NHEJ är effektivare eftersom det förekommer i den cell cyklar28, medan HDR är mindre effektiv och uppstår endast under S och G2 faser6,29,30. Vi utnyttjas effektivare NHEJ reparera vägen här för att införa främmande gener i de rikta platserna. Även om NHEJ reparera får införa indels genom att gå noncompatible eller skadad DNA-ändarna genom en homologi-oberoende slentrianmässigt flexibel process31,32 mellan klyvs givare sekvens och genomiskt DNA, indels endast kan ske vid klyvning platserna SGA och utländska genuttryck kassett påverkas inte. En annan fördel med denna metod är att NHEJ är fri från begränsningar av homologi arm konstruktion, vilket gör kloning steg mycket okomplicerad. Detta föranleder en stor potential för tillämpningen av NHEJ för utländska gen införande. Införandet av en universell gärna målstället både avslutas av utländska gen kassett gör processen snabbare eftersom mallen givare kan byggas genast utan behov för specifika gärna urval. Ryggraden i givaren plasmiden som innehåller sgA mål platser, LoxP platser och PacI och SfiI webbplatser kan också delas ofta mellan olika reporter gener, utländska genuttryck-kassetter och annat virusvektorer, vilket detta nya tillvägagångssätt medför anpassning.
HVT-härbärgerat VP2 skäret användes för att beskriva protokollet i detta manuskript; samma tillvägagångssätt kan dock användas för att infoga mer virala gener på genomisk orter HVT genomets använder den gärna inriktning önskad motsvarande sekvensen för utveckling av multivalenta vacciner mot rekombinant HVT vectored. Andra MDV vaccinstammar, till exempel SB-1 och CVI988, andra aviär herpesviruses, inklusive infektiös laryngotrakeit och anka enterit-virus, och även andra aviär DNA virus, till exempel pox virus och adenoviruses, kan också vara konstruerad med samma strategi för utveckling av multivalenta rekombinant vaccin. Utvecklingen av nya multivalenta vektoriserade vacciner använder CRISPR/Cas9-systemplattformen beskrivs här kommer vara mycket fördelaktigt för fjäderfänäringen att skydda mot flera fjäderfäsjukdomar.

Mareks sjukdom (MD) är en lymfoproliferativ sjukdom hos kycklingar som induceras av serotyp 1 (Gallid Herpesvirus 2 [GAHV-2]) av släktet Mardivirus i familjen av Alphaherpesvirinae. Mardivirus innehåller också två nonpathogenic serotyper: serotyp 2 (GaHV-3) och serotyp 3 (MeHV-1, historiskt känd som HVT) som används som vaccin mot MD. Levande HVT vaccin (FC-126 stam) är den första generationen MD vaccin används på tidiga 1970-talet och används fortfarande ofta i bivalent och polyvalent vaccin formuleringar för att ge ett utökat skydd mot MD. HVT används också ofta som en vaccin vektor för att inducera skydd mot ett antal fågelsjukdomar på grund av sin mångsidighet och säkerhet för både i ovo och subkutan kläckeri administration och möjlighet att ge en livslång immunitet. Strategin för att generera rekombinant HVT vacciner är baserad på antingen konventionell homolog rekombination i virus-infekterade celler, överlappande cosmid DNAs eller BAC mutagenes2. Dessa metoder är dock generellt tidskrävande och arbetsintensiva, kräver byggandet av överföring vektorer, upprätthållandet av det virala genomet i Escherichia coli, plack reningar, och avlägsnande av BAC sekvens och urval markör från redigerade virus3,4.
CRISPR/associerade (Cas9) är den mest populära genen redigerande redskap under de senaste åren på grund av sin mångsidighet och specificitet. CRISPR/Cas9 systemet har använts framgångsrikt i effektiv generering av genetiskt modifierade celler och djurmodeller5,6,7,8,9,10, som samt i manipulering av flera stora DNA-virus genomen11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20. Efter rapportering en enkel och effektiv metod med CRISPR/Cas9 systemet för att redigera de HVT genom21, utvecklade vi en pipeline för snabb och effektiv generering av rekombinant HVT22.
För att förlänga potentiella tillämpningen av denna metod, beskriver vi de detaljerade metoder för generering av rekombinant HVT vaccin uttrycker VP2 genen av IBDV på det UL45/46 locus i detta betänkande. Metoden kombinerar NHEJ-CRISPR/Cas9 för att infoga VP2 genen taggade med GFP reporter gen och ett Cre-LoxP system ta bort GFP uttryck kassetten senare. Jämfört med traditionella rekombination och BAC recombineering tekniker, visar vi att NHEJ-CRISPR/Cas9 tillsammans med ett Cre-Lox system är en snabb och effektiv metod att generera rekombinant HVT vaccin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:988px;" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">M199 medium, Earle&#39;s Salts</td>
			<td style="width:221px;">Life technology</td>
			<td style="width:163px;">11150059</td>
			<td style="width:235px;">cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140148</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fungizone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td>antifunigal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptose Phosphate Broth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8782</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HVT Fc126 strain</td>
			<td>Avian Disease and Oncology Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>wildtype HVT virus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pX459-v2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #62988</td>
			<td>Cas9 and gRNA expression vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-T Easy Vector Systems</td>
			<td>promega</td>
			<td>A1360</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Subcloning Efficiency DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td>transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PacI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>rR0547S</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SfiI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0123S</td>
			<td>donor vector cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>plasmid extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-X2</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR 6004</td>
			<td>transfection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture 6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Master Mixes</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7123</td>
			<td>junction PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum Pfx DNA Polymerase</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11708021</td>
			<td>PCR amplification of full insert</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>immunoflourescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td>immunoflourescence staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica TCS SP5 LASAF</td>
			<td>immunoflourescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS cell sorter</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>BD FACSAria</td>
			<td>single cell sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (4% in PBS)</td>
			<td>Santa cruz biotechnology</td>
			<td>SC-281692</td>
			<td>cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30960</td>
			<td>permeabilization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating recombinant avian herpesvirus vectors with crispr/cas9 gene editing

Herpesvirus kalkoner (HVT) är en idealisk virala vektorn för generering av rekombinant vaccin mot ett antal fågelsjukdomar, som aviär influensa (AI), Newcastle-sjukan (ND) och smittsam bursal sjukdom (IBD), med hjälp bakteriella artificiella kromosom ( BAC) mutagenes eller konventionella rekombination metoder. Den klustrade regelbundet mellanliggande palindromic repetitioner (CRISPR) / Cas9-system har framgångsrikt använts i många inställningar för genen redigering, inklusive manipulering av flera stora DNA-virus arvsmassa. Vi har utvecklat en snabb och effektiv CRISPR/Cas9-medierad genomet redigering rörledning för att generera rekombinant HVT. För att maximera den potentiella användningen av denna metod, presenterar vi här detaljerad information om metod generera rekombinant HVT uttrycker VP2 proteinet av IBDV. VP2 uttryck kassetten sätts in den HVT genom via en NHEJ (nonhomologous slutet-att gå)-beroende reparation väg. Ett grönt fluorescerande protein (GFP) uttryck kassett bifogas första insatsen för enkel visualisering och sedan tas bort via den Cre-LoxP system. Denna metod erbjuder ett effektivt sätt att införa andra virala antigener i HVT genomet för den snabba utvecklingen av rekombinant vaccin.

Den strategi som används för generering av rekombinant HVT vaccinet beskrivs i figur 1som innehåller hur givaren plasmiden är konstruerade (figur 1A) och förfaranden för att generera rekombinant HVT (figur 1B ). Fem till trettio GFP-positiv plack omgivet av vild typ plack kan observeras i gen knackar-i brunnar under fluorescens Mikroskop 3 d posttransfection och -infektion. Renat viruset erhållits efter encelliga sortering (figur 2A) analyserades av 3' junction PCR, som visar en PCR produkt av den förväntade storleken (figur 2A, nedre panelen). Efter excision av GFP reporter av Cre recombinase förlorade över 50% av plack sin GFP uttryck. Renat plack efter den GFP excision (figur 2B) av encelliga sortering bekräftades ytterligare 5' junction PCR, som visar rätt storlek PCR-produkten (figur 2B, nedre panelen). Figur 3 visar sekvensering resultaten både korsning av PCR-produkter med olika färgade element. I figur 4bekräftades proteinuttryck av IFA med VP2-specifik monoklonal antikropp och anti-HVT kyckling serum. Som förväntat, kan celler som smittats med den föräldra HVT endast färgas av anti-HVT serum (grön), medan rekombinant HVT-infekterade celler visade tydligt uttryck för VP2-genen (röd).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig1.jpg"> Figur 1: strategi för generering av ett rekombinant HVT-vectored vaccin. (A) denna panel visar en schematisk representation av kloning strategin för givare plasmid konstruktion. De viktigaste inslagen inkluderar två Cas9 mål platser (sgA) för att frigöra Infoga, en reporter GFP kassett flankerad med LoxP sekvenser för excision av god Jordbrukarsed och VP2 uttryck kassett. (B) denna panel visar en översikt över en två-stegs gen inpressning strategi. Den Infoga fragmentet av GFP och VP2 uttryck korgarna är släppt av Cas9/sgA klyvning och infogas i HVT genomet på UL45/46 lokus via NHEJ-CRISPR/Cas9. GFP-positiv rekombinanta virus sedan sorteras och renas av encelliga fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS). Därefter genen för GFP-reporter Bolts av Cre recombinase och rekombinanta virus renas och karakteriseras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig2.jpg"> Figur 2 : Kontroll av den rekombinanta HVT. (A) i denna panel visas en GFP-positiv plack (HVT-GFP-VP2) visualiseras under mikroskopet fluorescens (övre panelen) och PCR-kontroll av HVT-GFP-VP2 med primers VP2-F & UL46-R1 för korsningen 3'. ()B) i denna panel visas en plakett (HVT-VP2) visualiseras efter den GFP excision av HVT-GFP-VP2, Cre recombinase och PCR-kontroll av HVT-VP2 med primers UL45-F1 och VP2-R1 för korsningen 5'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig3.jpg"> Figur 3 : Sekvens analys av rekombinant HVT viruset. (A) sekvenserna av nyckelelementen i olika färger i den här panelen är HVT intergenic regionen mellan UL45/46 med gärna mål sekvens underströk och en pil som visar webbplatsen Cas9 klyvning, VP2 uttryck kassett med slutet sekvenser i kursiva gemener, sg-A target sekvensen med pilen visar webbplatsen Cas9 klyvning, LoxP webbplats sekvensen i grönt och två SfiI platser sekvenser i blått rött. (B) i denna panel visas sekvensering resultaten av 5' och 3' korsningar och en schematisk presentation av HVT-VP2 med viktiga inslag med motsvarande färger presenteras i sekvenser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig4.jpg"> Figur 4 : Karakterisering av den rekombinanta HVT-VP2. I denna panel visas bekräftelse av det framgångsrika uttrycket för VP2 i infekterade CEFs med indirekt immunofluorescens assay (IFA) med anti-VP2 monoklonal antikropp HH7 (röd). HVT infektion bekräftas av IFA med HVT-infekterade kyckling serum (grön). Skalstapeln = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Generera rekombinant aviär Herpesvirus vektorer med CRISPR/Cas9 gen redigering

Herpesvirus kalkoner (HVT) används allmänt som en vektor plattform för generering av rekombinant vaccin mot ett antal fågelsjukdomar. Denna artikel beskriver en enkel och snabb metod för generering av rekombinant HVT-vectored vacciner med hjälp av en integrerad NHEJ-CRISPR/Cas9 och Cre-Lox system.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Detta tillvägagångssätt erbjuder ett effektivt sätt att introducera andra virala antigener i HVT-genomet för snabb utveckling av rekombinanta vacciner. En viss fördel med denna teknik är att en GFP-uttryckskassett är fäst vid insatsen först för enkel visualisering och sedan tas bort av Cre-LoxP-systemet. Samma metod kan användas för att infoga fler virusgener på olika platser av HVT-genomet, eller andra aviär herpesvirus för utveckling av multivalenta rekombinanta vacciner.Demonstrera förfarandet kommer att Katy Moffat, en expert på cell sortering. Na Tang, Yaoyao Zhang och Guanggang Qu, forskare från mitt laboratorium. Dagen före transfection förbereda chick embryo fibroblaster som beskrivs i textprotokollet.Utsäde 1,3 miljoner celler i 2,5 milliliter medium i varje brunn av en sex brunn tallrik. TransfektE FSE-cellerna med 0, 5 mikrogram vardera av de två Cas9-guiden RNA plasmider, och ett mikrogram av donatorplasmiden med användning av ett lämpligt transfektionsreagens enligt tillverkarens anvisningar. Inkubera cellerna i 38,5 grader Celsius med 5%koldioxid i 12 timmar.12 timmar efter transfektion späda HVT-virusstocken med M199 odlingsmedium till en koncentration av 100, 000 plackbildande enheter per milliliter. Tillsätt 130 mikroliter av det utspädda viruset till varje brunn av transfekterade celler. Ställ in en brunn av oöversatta celler som en negativ kontroll och lägg till samma mängd virus.Inkubera cellerna i 38,5 grader Celsius med 5%koldioxid i tre dagar. Dagen före sortering förbereda två 96 brunn plattor genom sådd 20, 000 celler i varje brunn. Tre dagar efter infektion hämta de sex väl plattor som innehåller transfected och infekterade CEFs.Aspirera mediet från varje brunn och skölj cellarket med PBS. Tillsätt en milliliter på 0,05%trypsin-EDTA till varje brunn och inkubera cellerna i 38,5 grader Celsius med 5%koldioxid i cirka fem minuter. Sedan, resuspend cellerna med 50 mikroliter av FBS och överföra denna suspension till en 1,5 milliliter microcentrifug röret.Centrifugera vid 200 gånger gravitation i fem minuter. Resuspend cellerna i en milliliter av PBS som innehåller 1%FBS. Använd en hemocytometer för att räkna cellerna och justera celltätheten till en miljon celler per milliliter.Därefter överför cellerna till ett polystyren sorteringsrör genom sin sillock. Med hjälp av en cell sortera sortera de enstaka celler som uttrycker GFP i preseeded 96 väl plattor. Inkubera plattorna med de sorterade cellerna vid 38,5 grader Celsius med 5%koldioxid i fem dagar.Efter fem dagar använda fluorescens mikroskop för att kontrollera 96 brunn plattor och markera brunnar som innehåller en enda GFP positiv plack. Trypsinize varje GFP positiv väl med 50 mikroliter trypsin-EDTA i tre minuter. Tillsätt sedan 50 mikroliter av odlingsmedium för att återanvända cellerna och överföra denna suspension till en brunn av en sex brunnsplatta med CEFs.Efter tre dagar frysa ner en injektionsflaska av vardera av den första generationen av rekombinanta virus i frysmediet. Förvara dessa skördade virus i flytande kväve. Samla in 100, 000 celler från var och en av den första generationen av virus.Centrifugera cellerna vid 2, 000 rpm i fem minuter, och kasta supernatanten. Förvara cellerna på negativa 20 grader Celsius tills redo att utföra DNA-extraktion. När redo att utföra DNA-extraktion använda 50 mikroliter av squishing buffert för att tina upp och återanvända cellen pellets.Lysa proverna vid 65 grader Celsius i 30 minuter och sedan vid 95 grader Celsius i två minuter för att inaktivera Proteinase K.Utför en PCR-reaktion med tre prime junction primers med hjälp av en mikroliter av varje DNA-prov som beskrivs i textprotokollet. Ladda två mikroliter av förstärkningsprodukterna till en brunn på 1%agarosgel för gelelektrofores. För att ta bort GFP genen från rekombinantviruset, använd en transfektionsreagens för att transfekt två mikroliter av Cre rekombinera uttryck plasmid i de sex väl plattan som har preseeded med CEF celler.12 timmar efter transinfektion avfrostning en injektionsflaska med rekombinant virus från flytande kväve. Försiktigt resuspend viruset och utsäde 50 mikroliter i varje brunn av transfekterade celler, inställning en well as den negativa kontrollen med samma mängd virus. Inkubera vid 38,5 grader Celsius i tre dagar.72 timmar post infektion förbereda cellerna för sortering som tidigare beskrivits. Sortera den enda icke-fluorescerande celler i en 96 väl platta preseeded med CEFs. Därefter trypsinize de valda plack och resuspend motsvarande celler som beskrivs i textprotokollet.Passera hälften av cellerna i varje brunn av en 96 väl platta som har preseeded med CEFs som andra generationen. Centrifugera de återstående cellerna i varje klon vid 200 gånger gravitationen i fem minuter. Kassera supernatanten och återanvänd cellerna med 50 mikroliter av squishing buffert för DNA-extraktion.Utför sedan PCR med fem främsta knutpunkter primers med hjälp av en mikroliter DNA-mall som beskrivs i textprotokollet. Baserat på PCR-resultaten välja tre till fem positiva kloner av rekombinanta HVT för ytterligare passager och verifiering. Först infekterar CEFs med andra generationen av rekombinant HVT i en preseeded 24 väl platta.48 timmar efter infektion ta bort odlingsmediet och tillsätt 500 mikroliter av 4%paraformaldehyd i PBS för att fixera cellerna. Inkubera i rumstemperatur i 30 minuter. Därefter tar du bort fixativet och tvättar cellskiktet tre gånger med PBS.Ta bort PBS och lägg till 500 mikroliter på 0,1%Triton X-100 för att permeabilisera cellerna. Efter 15 minuter tvätta cellskiktet tre gånger med PBS. Lägg till blockerande buffert i en timme för att blockera ospecifik bindning.Späd sedan den primära antikroppen anti-VP2 monoklonal antikropp HH7 eller HVT-infekterade kyckling serum på en till 200 i blockerande buffert. Tillsätt 200 mikroliter av den utspädda primära antikroppen till varje brunn och inkubera i rumstemperatur i en timme. Tvätta cellskiktet tre gånger med PBS.Späd den sekundära antikroppen get anti-mus IgG Alexa 568 eller get anti-kyckling IgG Alexa 488 på en till 200 i blockerande buffert. Tillsätt 200 mikroliter av utspädd sekundär antikropp till varje brunn och inkubera i rumstemperatur i en timme. Sedan tvättar du cellerna tre gånger med PBS.Använd fluorescensmikroskopet för att kontrollera proteinuttrycket. Dagen innan viruset expansionsfrö 2,6 miljoner FSE-celler i varje T25 kolv. Tina minst tre positiva kloner och tillsätt en flaska celler eller virus till varje kolv.Inkubera kolvarna i 38,5 grader Celsius med 5%koldioxid tills en 50%cytopatisk effekt observeras. Nästa skörd cellerna i två milliliter av odlingsmedium. Infektera 50 mikroliter till en ny T25 kolv som var preseeded med CEF-celler för nästa generation.Håll passaging det rekombinanta viruset i minst 15 generationer. Använda PCR analysera varje generation av virus för förekomsten av VP2-sekvensen. Med hjälp av en indirekt immunofluorescens assay analysera varje generation av virus av VP2 uttryck.Efter single cell sortering den erhållna renade virus analyseras av tre främsta korsningen PCR, som visar en PCR produkt av den förväntade storleken. Efter excision av GFP reporter av Cre recombinase över 50%av plack förlorade sin GFP uttryck. Den renat plack efter GFP excision erhålls genom single cell sortering och bekräftas ytterligare av fem främsta korsningen PCR som visar produkt av den förväntade storleken.Proteinuttrycket bekräftas sedan av indirekt immunofluorescens analys med VP2 specifika monoklonala antikroppar och anti-HVT kyckling serum. Som väntat kan celler som är infekterade med föräldrarnas HVT endast färgas av anti-HVT-serum. Medan rekombinanta HVT infekterade celler visar tydligt uttrycket av VP2 gen.För att generera ett rekombinantvirus hög transfektionshastighet krävs för att maximera risken för viruset och insatsen att träffas i samma cell för redigering att äga rum. Efter detta förfarande kan man utföra djurförsök för att bedöma immunogeniciteten och effekten av de rekombinanta vaccinerna. Utvecklingen av nya multivalenta vektorvacciner med hjälp av CRISPR/Cas9-systemplattform som beskrivs här kommer att vara mycket fördelaktigt för fjäderfäindustrin att skydda mot flera fjäderfäsjukdomar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Identifiera oreglerad Gener som framkallas av Kaposis sarkom-associerat herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Övervakning av aviär influensa med FTA-kort: Metoder Field, biosäkerhet och frågor Transport Löste

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Analysera Host-virus interaktion i Lytisk Replikering av en modell Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion och Titering av rekombinanta Adeno-associerad virala vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Effektiv Rekombinant Parvovirus produktion med hjälp av adenovirus-härledda Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Engineering och evolution av syntetisk Adeno-associerat virus (AAV) Gene Therapy Vektorer via DNA Familj Skyffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

En enkel och effektiv strategi för att konstruera Mutant vacciniavirus vektorer

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

CRISPR-Cas9-baserade genomet Engineering att generera Jurkat Reporter modeller för HIV-1 infektion med valda Proviral Integration platser

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Tillämpning av konsekvent massage-liknande Perturbations på mus kalvar och övervaka de resulterande intramuskulärt tryckförändringar

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...