Name: methods for evaluating the role of c-fos and dusp1 in oncogene dependence
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence at JoVE.com

الكتاب ممتنون لدالي س. غ. لتوفير خلايا BaF3 و WEHI و "ريا ت." مسكف-المركز-ABL-آيريس--يفب بنيات. الكتاب ممتنون كارول م. لتوفير عينات المرضى من أزمة انفجار التضليل. هذه الدراسة وأيد منح للماجستير من لجنة التحقيق الوطنية (1RO1CA155091) ومؤسسة أبحاث سرطان الدم ومؤسسة الخامس، ومن نهلبي (R21HL114074-01).

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في المستشفى الطبي مركز (كتشمك سينسيناتي الأطفال). العينات البشرية (BM عادي وأنه من التضليل (p210-المركز-ABL +) اللوكيميا) تم الحصول عليها عن طريق البروتوكولات التي وافق عليها "مجلس المراجعة ...

<ol>
	<li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247, 824-830 (1990).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).</li><li>Mahon, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuation+of+imatinib+in+patients+with+chronic+myeloid+leukaemia+who+have+maintained+complete+molecular+remission+for+at+least+2+years:+the+prospective,+multicentre+Stop+Imatinib+(STIM)+trial.">Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial.</a> Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).</li><li>O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+limits+of+targeted+therapy+in+chronic+myeloid+leukaemia.">Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).</li><li>Rousselot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+mesylate+discontinuation+in+patients+with+chronic+myelogenous+leukemia+in+complete+molecular+remission+for+more+than+2+years.">Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years.</a> Blood. 109, 58-60 (2007).</li><li>Krause, D. S., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinases+as+targets+for+cancer+therapy.">Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).</li><li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+balance+between+life+and+death:+targeted+cancer+therapy+and+"oncogenic+shock".">Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock".</a> Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).</li><li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+addiction:+setting+the+stage+for+molecularly+targeted+cancer+therapy.">Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy.</a> Genes &amp; Development. 21, 3214-3231 (2007).</li><li>Weinstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer.+Addiction+to+oncogenes--the+Achilles+heal+of+cancer.">Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer.</a> Science. 297, 63-64 (2002).</li><li>Corbin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chronic+myeloid+leukemia+stem+cells+are+insensitive+to+imatinib+despite+inhibition+of+BCR-ABL+activity.">Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li><li>Wilson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+potential+for+growth-factor-driven+resistance+to+anticancer+kinase+inhibitors.">Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors.</a> Nature. 487, 505-509 (2012).</li><li>Kesarwani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+c-FOS+and+DUSP1+abrogates+intrinsic+resistance+to+tyrosine-kinase+inhibitor+therapy+in+BCR-ABL-induced+leukemia.">Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-fos+regulates+neuronal+excitability+and+survival.">c-fos regulates neuronal excitability and survival.</a> Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).</li><li>Dorfman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+erp/mkp-1+gene+does+not+affect+mouse+development:+normal+MAP+kinase+activity+in+ERP/MKP-1-deficient+fibroblasts.">Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts.</a> Oncogene. 13, 925-931 (1996).</li><li>Padhye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocurcumins+as+cyclooxygenase-2+inhibitor:+molecular+docking,+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+in+mice.">Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice.</a> Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).</li><li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages.">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeting+of+quiescent+chronic+myelogenous+leukemia+stem+cells+by+histone+deacetylase+inhibitors+in+combination+with+imatinib+mesylate.">Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate.</a> Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).</li><li>Koschmieder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+chronic+phase+of+myeloid+leukemia+with+expansion+of+hematopoietic+stem+cells+in+a+transgenic+model+of+BCR-ABL+leukemogenesis.">Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis.</a> Blood. 105, 324-334 (2005).</li><li>Abraham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+targeting+of+p53+and+c-MYC+selectively+eliminates+leukaemic+stem+cells.">Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells.</a> Nature. 534, 341-346 (2016).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+p53+by+SIRT1+inhibition+enhances+elimination+of+CML+leukemia+stem+cells+in+combination+with+imatinib.">Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib.</a> Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).</li><li>. Qiagen-miRNAeasy kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources">https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources</a> (2018)</li><li>. DNA-free DNA removal kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&amp;s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&amp;ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&amp;s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&amp;ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s</a> (2018)</li><li>. SuperScript&#8482; III First-Strand Synthesis System Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051</a> (2018)</li><li>. Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html">https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html</a> (2018)</li><li>Abarrategi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+human+bone+marrow+niche+in+mice:+From+host+bone+marrow+engraftment+to+bioengineering+approaches.">Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches.</a> Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).</li><li>Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+screening+and+validation+of+resistant+mutations+against+kinase+inhibitors.">A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li></ol>

الجزء الأكبر من الخلايا السرطانية، هو توسط الاستجابة العلاجية ل TKI حصار تيروزين-كيناز-أونكوبروتين الإشارات التي الورم مدمن. ومع ذلك، يعرف سوى القليل نسبيا هو حول كيفية الهروب أقلية خلايا السرطانية التي تساهم الاعتماد والعلاج السرطاني4. كشفت الدراسات الأخيرة أن يشير إلى عامل ...

يؤدي النشاط كيناز تيروزين التأسيسي للمركز-ABL1 الانصهار السرطاني التضليل، الذي يوفر الأساس منطقي لاستهداف النشاط كيناز بمثبطات جزيء صغير. نجاح تكيس في علاج مرضى CML أحدثت ثورة في مفهوم العلاج المستهدفة1،2. وفي وقت لاحق، قد وضعت كيناز المضادة العلاج كدواء الدقة لعدة الأورام الخبيثة الأخرى، بما في ذلك الأورام الصلبة. وحتى الآن، أكثر من ثلاثين kinase مثبطات أقرها "المتحدة الدولة إدارة الأغذية والعقاقير" لعلاج الأورام الخبيثة المختلفة. بينما TKI العلاج فعالة جداً في القضاء على هذا المرض، إلا أنها ليست العلاجية. وعلاوة على ذلك، استمر عدد صغير من الخلايا السرطانية أثناء فترة العلاج:4،3،5. وبقي حتى المرضى الذين أظهر مغفرة كاملة مع MRD، التي قمعت في نهاية المطاف نتائج في الانتكاس إذا لم يكن بشكل مستمر. ولذلك، يلزم القضاء على الخلايا MRD لتحقيق استجابة دائمة أو العلاجية. التضليل يمثل نموذجا قيماً لتعريف مفهوم الطب الدقة، وآليات أونكوجينيسيس والعلاجات الموجهة الهدف الرشيد، وتطور المرض والمقاومة للعقاقير. ومع ذلك، وحتى اليوم، إليه القيادة موت الخلايا المستحثة TKI في الخلايا السرطانية ليست مفهومة تماما، ولا لماذا MRD الخلايا (التي تتألف من الخلايا الجذعية ليوكيميك []) مقاومة جوهريا تكيس4،6. على الرغم من ذلك، هو ظاهرة "السرطاني الاعتماد" إلى أونكوبروتين كيناز متحولة المتورطين في فعالية TKI حيث يسبب تثبيط السرطاني المستهدفة تكيس الحاد حدوث صدمة النمطان التي تؤدي إلى استجابة بروابوبتوتيك ضخمة أو التتابع في الخلية طريقة تعتمد على السياق6،7،،من89. ومع ذلك، تفتقر إلى الأساس آليا للاعتماد السرطاني. وقد تورط الدراسات الأخيرة أن إشارات عامل النمو ويلغي الاعتماد السرطاني ويضفي عليه مقاومة TKI العلاج10،،من1112. ولذلك، للحصول على نظرة ثاقبة إليه الاعتماد السرطاني، أجرينا التعبير كل الجينوم التنميط من المركز-ABL1 مدمن والخلايا نوناديكتيد (نمت مع عوامل النمو)، التي كشفت عن أن ج-المنحدر و Dusp1 من الوسطاء الحرجة من إدمان السرطاني13. حذف الوراثية ج-المنحدر و Dusp1 الخلايا القاتلة للتعبير عن ABL1 بنك الاصطناعية والفئران استخدمت في التجربة لم يطور سرطان الدم. وعلاوة على ذلك، شُفي تثبيط ج-المنحدر و DUSP1 بمثبطات جزيء صغير التضليل التي يسببها ABL1 بنك في الفئران. وتبين النتائج أن مستويات التعبير ج-المنحدر و Dusp1 بتحديد عتبة أبوبتوتيك في الخلايا السرطانية، حيث أن المستويات الأدنى يضفي حساسية المخدرات بينما تسبب ارتفاع مستويات مقاومة للعلاج13.
تحديد الجينات القيادة الاعتماد السرطاني، أجرينا عدة التعبير كل الجينوم التنميط تجارب حضور عامل النمو و TKI (imatinib) باستخدام كلا الماوس-والتضليل المستمدة من المريض خلايا (K562). وجرى تحليل هذه البيانات بالتوازي مع التضليل المريض مجموعات البيانات التي تم الحصول عليها من CD34+ الخلايا الجذعية المكونة للدم قبل وبعد العلاج مع imatinib. كشف هذا التحليل عن ثلاثة جينات (عامل النسخ [ج-المنحدر]، وخصوصية المزدوج الفوسفاتيز 1 [Dusp1]، والحمض النووي الريبي ملزمة بروتين [Zfp36]) الذي يشيع أوبريجولاتيد في خلايا مقاومة TKI. للتحقق من أهمية هذه الجينات في منح المقاومة للعقاقير، قمنا بتنفيذ التحليل في المختبر و في فيفو خطوة بخطوة. وأكدت مستويات التعبير هذه الجينات قبكر في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) وغربي النشاف في خلايا مقاومة للأدوية. علاوة على ذلك، كدنا overexpression وضربه قاضية بدبابيس الشعر شرنا من ج-المنحدر، Dusp1، و Zfp36 كشفت أن مرتفعة ج-المنحدر والتعبيرات Dusp1 الكافية واللازمة لمنح المقاومة TKI. ولذلك، أجرينا المجراة في التحقق من صحة باستخدام نماذج الماوس مع ج-المنحدر و Dusp1 فقط. للتحقق من الصحة الوراثية ج-المنحدر و Dusp1، ونحن إنشاء روساكريرت-إيندوسيبلي ج-المنحدرfl/fl الفئران (خروج المغلوب الشرطي)14 وعبرت لهم مع Dusp1-/- (خروج المغلوب على التوالي)15 جعل ROSACreERT2-ج--المنحدرfl/fl Dusp1-/- الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة. الخلايا المشتقة من نخاع العظم ج-كيت+ (من ج-المنحدرfl/فلوريدا-، Dusp1--/----، وج-المنحدرfl/flDusp1--/--) معربا عن المركز-ABL1 قد تم تحليلها في المختبر في تشكيل مستعمرة المقايسة وحدة (زيمبابوي)، و في فيفو بزرع نخاع العظام في الفئران المشععة قاتلة، لاختبار شرط ج-المنحدر و Dusp1 منفردة أو مجتمعة في تطور سرطان الدم. وبالمثل، الموانع الكيميائية ج-المنحدر من DFC (ديفلوريناتيد الكركمين)16 و Dusp1 من BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 تم اختبارها في المختبر والمجراه في استخدام المركز-ABL1-الإعراب عن، العظام الخلايا المشتقة من نخاع ج-كيت+ من الماوس (WT) البرية من نوع. لتأكيد شرط ج-المنحدر و Dusp1 في الخلايا الجذعية ليوكيميك، نحن تستخدم نموذج ماوس التضليل حيث حملت ABL1 المركز على وجه التحديد في خلاياه الجذعية الدوكسي (تعرب عن ترانساكتيفاتور تيت تحت الخلايا الجذعية موريني اللوكيميا (SCL) الجين 3 ' محسن لائحة)18،19. قمنا باستخدام نخاع العظام لين–الخلايا Sca++ (LSK) ج-مجموعة من هذه الفئران في مقايسة المجراة في زرع. وعلاوة على ذلك، أنشأنا مستويات فوبشو-p38 والتعبير عن إيل-6 كالمؤشرات الحيوية الديناميكية دراسة معمقة من العقاقير Dusp1 وتثبيط ج-المنحدر، على التوالي، في فيفو. وأخيراً، توسيع نطاق الدراسة للبشرية أهمية، المستمدة من المريض CD34+ الخلايا (ما يعادل الخلايا ج-كيت+ من الفئران) كانت تعرض على المدى الطويل في المختبر الشروع في ثقافة الخلية فحوصات (لتسيك) ونموذج ماوس أنسنة المجراة في التضليل20،21. تم زرع الفئران العوز مع التضليل CD34 + الخلايا، متبوعاً بالعلاج من تعاطي المخدرات وتحليل لبقاء الخلية ليوكيميك البشرية.
في هذا المشروع، نقوم بوضع أساليب لتحديد الهدف وعمليات التحقق من الصحة باستخدام الأدوات الجينية والكيميائية على حد سواء، باستخدام نماذج الإكلينيكية المختلفة. يمكن تطبيق هذه الأساليب بنجاح التحقق من صحة الأهداف الأخرى تطوير الطرائق الكيميائية للتنمية العلاجية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:948px;" width="946">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:424px;">Biological Materials</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-016-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>3434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>4434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Hydroxytamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DFC</td>
			<td>LKT Laboratories Inc.</td>
			<td>D3420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCI</td>
			<td>Chemzon Scientific</td>
			<td>NZ-06-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imatinib</td>
			<td>LC Laboratory</td>
			<td>I-5508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458-37-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NDGA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>500-38-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penn/Strep</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1XPBS</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-005-CL</td>
			<td style="width:131px;">5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3369</td>
			<td style="width:131px;">5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45uM acro disc filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70um nylon cell stariner</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)</td>
			<td>Simga</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>CO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocullulose Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45R (B220)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>553092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45.1-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0453-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45.2-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0454-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hCD45-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Biotin-FITC</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-857&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-7-4</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>MA5-16539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ter-119</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>558612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD117 APC&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>553356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharm Lyse</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">BD Perm/Wash&#160; (permeabilization and wash solution for phospho flow)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phospho p38</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4511S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">total p38</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse IgG control</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Flour 488 conjugated&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K278001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X HBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K278002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood Capillary Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-260-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood Collection Tube</td>
			<td>Giene Bio-One</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Newborn Calf Serum</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erythropoiein</td>
			<td>Amgen</td>
			<td>5513-267-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human IL-3</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">G-SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GM-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyeloCult (media for LTCIC assay)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mortor pestle</td>
			<td>Coor tek&#160;</td>
			<td>60316 and 60317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflorane (Isothesia TM)</td>
			<td>Butler Schien</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B90920s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td style="width:131px;">100mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto agar (agar)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E-3119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Doxycycline chow</td>
			<td>TestDiet.com</td>
			<td>52662</td>
			<td style="width:131px;">modified RMH1500, Autoclavable 5LK8&#160; with 0.0625% Doxycycline&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodonitrotetrazolium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I10406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dneasy Blood &#38; tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">miRNeasy Mini Kit&#160; (RNA isolation kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)</td>
			<td>Ambion, Life Technologies</td>
			<td>AM1906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD117 MicroBead Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay</td>
			<td>Stemp Cell Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing bucket rotor cetrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TC-10 automated cell counter</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C-1000 Thermal cycler</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mastercycler Real Plex 2</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemavet ( boold counter)</td>
			<td>Drew-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSR II ( FACS analyzer)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fortessa I ( FACS analyzer)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSAriaII ( FACS Sorter)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnet Stand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Irradiator</td>
			<td style="width:247px;">&#160;J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA</td>
			<td>Mark I Model 68A</td>
			<td>source Cs 137</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSACreERT2</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scl-tTA&#160;</td>
			<td>Dr. Claudia Huettner&#8217;s lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BoyJ&#160;</td>
			<td>mouse core facility at CCHMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57Bl/6&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NSGS</td>
			<td>mouse core facility at CCHMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-&#160;</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSACreERT2/c-Fosfl/fl</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">BaF3</td>
			<td style="width:247px;">Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">WEHI</td>
			<td style="width:247px;">Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">CML-CD34+ and Normal CD34+ cells</td>
			<td style="width:247px;">University Hospital, University of Cincinnati</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for evaluating the role of c-fos and dusp1 in oncogene dependence

مظاهرة تيروزين كيناز مثبطات (تكيس) في علاج سرطان الدم النقوي المزمن (CML) وقد يبشر بعهد جديد في علاجات السرطان. ومع ذلك، عدد صغير من الخلايا لا تستجيب ل TKI العلاج، أسفر عن الأمراض المتبقية الحد الأدنى (MRD)؛ فشل تكيس حتى أقوى للقضاء على هذه الخلايا. هذه الخلايا MRD بمثابة مستودع تطوير مقاومة للعلاج. ولا يعرف لماذا غير فعال ضد الخلايا MRD TKI العلاج. عامل النمو مما يشير إلى تورط في دعم بقاء الخلايا MRD أثناء TKI العلاج، ولكنها تفتقر إلى فهم ميكانيكية. الدراسات التي أجريت مؤخرا أظهرت أن المنحدر ج مرتفعة وتعبير Dusp1 نتيجة متقاربة النمطان وعامل النمو الإشارات في الخلايا MRD التوسط المقاومة TKI. يجعل التضليل الحساسة رائع تكيس تثبيط الوراثية والكيميائية ج-المنحدر و Dusp1 ويشفي التضليل في كلا النموذجين الوراثي وأنسنة الماوس. وقد حددنا هذه الجينات المستهدفة باستخدام عدة [ميكروارس] من TKI-حساسة-وخلايا مقاومة. هنا، نحن نقدم طرق للتحقق من صحة الهدف باستخدام الماوس في المختبر والمجراه في النماذج. يمكن بسهولة تطبيق هذه الأساليب على أي هدف للتحقق من الصحة الوراثية والتنمية العلاجية.

إدمان السرطاني قد تورطت في الفعالية العلاجية تكيس. ومع ذلك، ليست مفهومة آليات القيادة الاعتماد السرطاني. ونحن أداء متعددة تحليلات التعبير الجيني غير متحيزة لتحديد المكون الوراثي المتورطين في تدبير الإدمان. وكشفت هذه التحاليل upregulation من ثلاثة جينات، ج-المنحدر و Dusp1 و Zfp36، ...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence at JoVE.com

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

أساليب لتقييم دور ج-المنحدر و Dusp1 في الاعتماد على السرطاني

هنا، يمكننا وصف بروتوكولات المصادقة الوراثية والكيميائية ج-المنحدر و Dusp1 كهدف المخدرات في سرطان الدم باستخدام الماوس الوراثية وأنسنة في المختبر والمجراه في نماذج. يمكن تطبيق هذا الأسلوب لأي هدف للتحقق من الصحة الوراثية والتنمية العلاجية.

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علاجات السرطان ، مثل تحديد الجينات الرئيسية المشاركة في الاعتماد على الـ oncogene. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يستخدم الاعتماد على الولكوجين التي هي مشتركة لكثير من أنواع السرطان التي يحركها كيناز ولذلك فإنه ينطبق على أنواع متعددة من الأورام. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في سرطان الدم، ويمكن أيضا أن تطبق على أنظمة أخرى، مثل الأورام الصلبة مثل سرطان الرئة، وأورام الدماغ، وأورام البنكرياس.عموما، سوف الأفراد جديدة لهذه الطريقة النضال بسبب نقص الخبرة في علم الأحياء الجزيئية وعلم وظائف الأعضاء الخلوية. للبدء، حصاد عظام الساق من فأر القتل الرحيم. تنظيف الأنسجة من العظام مع مشرط.ثم ضع العظام في PBS الباردة على الجليد وسحق العظام مع الحشرات. بعد هذا، تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70 في أنبوب قبعة المسمار 50 ملليلتر مع ماصة 10 ملليلتر. غسل هاون وحشرات عدة مرات مع برنامج تلفزيوني الباردة وإضافة تعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر.المقبل الطرد المركزي نخاع العظام وإزالة عظمى مع فراغ وماصة زجاجية. Resuspend بيليه الخلية في 5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. باستخدام ماصة، ببطء إضافة نخاع العظام المعلقة إلى الجزء العلوي من درجة حرارة الغرفة بولي السكروز.بعد ذلك، تدور بولي السكروز في 400 GS لمدة 20 دقيقة مع الفرامل إيقاف. بعد الطرد المركزي، وجمع واجهة خلية أحادية النووية مجموع غائم مع ماصة ونقلها إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. جلب وحدة التخزين إلى 10 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني وإزالة 20 ميكرولترات للعد.بعد الطرد المركزي، والتخلص من عظمى ووضع بيليه على الجليد. المقبل ، resuspend بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني مع EDTA وBSA. أضف ميكروبات CD117 إلى تعليق الخلية، ودوامة للمزج.بعد هذا، احتضان تعليق لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. ثم جلب حجم يصل إلى 10 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني أكثر مع EDTA وBSA والطرد المركزي في 1200 G في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. استخدام فراغ لإزالة عظمى وتعليق بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني مع EDTA وBSA.ثم إضافة 3 ملليلتر من برنامج تلفزيوني مع EDTA وBSA إلى موقف المغناطيس مع عمود مغناطيسي والسماح لها بالتدفق إلى أنبوب جمع. بعد انتهاء المخزن المؤقت المتدفقة خلال العمود، إضافة تعليق الخلية والسماح لها بالتدفق خلال العمود في أنبوب التجميع. أضف بعد ذلك 5 ملليلترات إضافية من PBS مع EDTA و BSA إلى العمود ومسحها على الفور مع المكبس.إزالة المكبس وتكرار تدفق قبل عد الخلايا. بعد الطرد المركزي للخلايا، وإزالة supernatant وتعليق بيليه الخلية في IMDM كاملة للثقافة. ثقافة الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.أولا، الجمع بين الحمض النووي البلازميد الفيروسي مع بلازميد التعبئة والتغليف، كلوريد الكالسيوم والماء في أنبوب 1.5 ملليلتر. ثم إضافة 500 ميكرولترات من HBS إلى آخر 1.5 ملليلتر أنبوب. إضافة الخليط transfection قطرة الحكمة إلى أنبوب يحتوي على HBS في حين الاختلاط في وقت واحد مع دوامة تعيين إلى أدنى الإعداد.احتضان خليط transfection في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة. خلال فترة الحضانة، إضافة الكلوروكين إلى خلايا HEK والاحتفاظ بها في الحاضنة. بعد إضافة مزيج transfection، احتضان الخلايا لمدة 8 ساعات في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون تغيير وسائط الخلية عن طريق إضافة 14 ملليلتر من وسائل الإعلام DMEM10 الطازجة ببطء شديد.الأنابيب ببطء ضد جدار الطبق يساعد على منع أي تجريد من خلايا HEK. ثم احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استخدام حقنة 10 ملليلتر لجمع افرا فيروسية.ثم قم بتوصيل فلتر حقنة ميكرومتر 0.45 إلى الحقنة. يغرق المابير الفيروسية في أنبوب جمع جديد. جمع المابير الفيروسية ما يقرب من 16 ساعة في وقت لاحق.بعد هذا، إضافة ملليلتر اثنين من جزء الليفية البشرية المؤتلف في برنامج تلفزيوني إلى غير المعالجة 6 لوحات ثقافة جيدا. في اليوم التالي، استخدم ماصة لإزالة الليفي من الأطباق. كتلة لوحات مع 2٪ BSA في برنامج تلفزيوني واحتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.استخدام فراغ لإزالة BSA وغسل لوحات مع برنامج تلفزيوني قبل إزالته مع فراغ. بعد هذا، على الفور إضافة مصفاة الفيروسية الفائقة والطرد المركزي لوحة لمدة ساعتين. استخدام فراغ لإزالة افرانح وتدور لوحة مرة أخرى.بعد إزالة supernatant مع فراغ وغسل الآبار المغلفة الفيروسية مع برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني مع فراغ، إضافة إلى زراعة سابقا ج كيب بالإضافة إلى خلايا الماوس إلى الآبار المغلفة الفيروسية. بعد الطرد المركزي، احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.بعد 48 ساعة من النقل، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في FACS العازلة 1. أولاً ذوبان السليلوز الميثيل مع السيتوكينات للفئران في درجة حرارة الغرفة. ثم aliquot 3 ملليلتر من السليلوز الميثيل في أنبوب FACS.إضافة 100 ميكرولترات من تعليق الخلية مع مثبطات مناسبة ل3 ملليلتر من السليلوز الميثيل. ثم دوامة تعليق على ارتفاع لمدة 10 إلى 30 ثانية. بعد معظم فقاعات الهواء الهروب، واستخدام حقنة 1 ملليلتر لوحة 1 ملليلتر من وسائل الإعلام في ثلاث لوحات تكرار.ضع الأطباق في طبق بيتري كبير مع طبق مفتوح واحد يحتوي على مياه معقمة. ثم تغطية طبق بيتري كبيرة واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية. إعداد ايودونتروتترازوليوم وصمة عار كلوريد عن طريق حل 10 ملليغرام من كلوريد iodonitrotetrazolium في 10 ملليلتر من الماء.تصفية تعقيم حل تلطيخ مع حقنة قفل Luer مجهزة مرشح 0.2 ميكرومتر. في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة، إضافة 100 ميكرولترات من حل تلطيخ قطرة الحكمة حول لوحة CFU. ثم احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الخلية.وأخيرا، بعد أن تحولت المستعمرات لون بني أحمر داكن، واستخدام خلفية بيضاء في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة العقيمة لالتقاط صور للوحة CFU الملون. في هذا البروتوكول، تم استخدام العديد من تحليلات التعبير الجيني غير المتحيزة لتحديد المكون الجيني الذي ينسق إدمان الـ oncogene. للتحقق من دور c-Fos وDusp1 كهدف علاجي في سرطان الدم ، تم تأكيد فرط التعبير عنهما مع الخلايا التي تعبر عن BCR-ABL1 oncogene.وأكد التحليل عن طريق RT-qPCR وغرب النشاف أن كلا من تم الناجمة عن BCR-ABL1 وأن يتم زيادة التعبير عن طريق عامل النمو IL-3. تم فرز YFP بالإضافة إلى الخلايا المعبرة عن طريق FACS لمزيد من المختبر وفي مقايسات الجسم الحي. وأظهرت النتائج أن حذف ج-فوس ودوسب 1 وحده يمنع أرقام الاتحاد.وقد تعرضت الخلايا التي تفتقر إلى كل من C-Fos وDusp1 للخطر بشكل كبير في قدرتها على تشكيل مستعمرات، كما أن علاج Imatinib قضى على جميع وحدات CFUs التي تشير إلى أن فقدان C-Fos وDusp1 قاتل اصطناعيًا للتعبير BCR-ABL1. بعد هذا التطور، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال السرطان لاستكشاف الشبكات الجينية والجينات التي تقود الاعتماد على البكوجين وكيف تؤثر هذه الجينات على استجابتها الخاصة في نماذج الماوس والمرضى البشريين. لا تنس أن العمل مع الفيروسات الرجعية وعينات المرضى يمكن أن تكون خطرة للغاية ويجب مراعاة ممارسات المختبرات آمنة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture فحوصات لدراسة البلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة تحفيز من ورم أرومي دبقي الغزو

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

تقييم أضرار الحمض النووي في المختبر باستخدام مقايسة المذنب

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

هلام ثنائي الأبعاد التفريد مقترنة بأساليب الطيف الكتلي لتحليل البروتين الأنسجة البشرية الورم الحميد الغدة النخامية

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

تقييم دور الوظيفة المتقدرية في التعب المتصلة بالسرطان

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

نظام الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد لدراسة الغزو وتقييم المداواة في سرطان المثانة

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

تميز المسوخ ذات الصلة بالأمراض من Kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني باستخدام مجموعة من الأساليب العملية والممكنة

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

تقييم قدره التمايز من الخلايا الظهاريه البروستاتا الماوس باستخدام الثقافة Organoid

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

دمج نهج المعلوماتية الحيوية والتحقق التجريبي لفهم دور الإشارات الدرجة في سرطان المبيض

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

تقييم موت الخلية باستخدام الخلايا الخالية من البروبيوتيك في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية القولون والمستقيم

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...