Name: methods for evaluating the role of c-fos and dusp1 in oncogene dependence
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence at JoVE.com

Forfatterne er taknemmelige at G. Q. Daley for at levere BaF3 og WEHI cellerne og T. Reya for MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP konstruktioner. Forfatterne er taknemmelige at M. Carroll for at levere patientprøver fra CML blast krise. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud til M.A. fra NCI (1RO1CA155091), leukæmi Research Foundation og V Foundation og fra NHLBI (R21HL114074-01).

Alle dyreforsøg blev foretaget efter retningslinjerne i de institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på Cincinnati children's Hospital medicinsk Center (CCHMC). Humant prøvemateriale (Normal BM og der fra CML (p210-BCR-ABL +) leukæmi) blev modtaget gennem institutionelle Review Board-godkendte protokoller (institutionelle Review Board: Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati children's Hospital Medical Center), og donor-informeret samtykke fra CCHMC og University of Cincinnati.
1...

<ol>
	<li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247, 824-830 (1990).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).</li><li>Mahon, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuation+of+imatinib+in+patients+with+chronic+myeloid+leukaemia+who+have+maintained+complete+molecular+remission+for+at+least+2+years:+the+prospective,+multicentre+Stop+Imatinib+(STIM)+trial.">Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial.</a> Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).</li><li>O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+limits+of+targeted+therapy+in+chronic+myeloid+leukaemia.">Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).</li><li>Rousselot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+mesylate+discontinuation+in+patients+with+chronic+myelogenous+leukemia+in+complete+molecular+remission+for+more+than+2+years.">Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years.</a> Blood. 109, 58-60 (2007).</li><li>Krause, D. S., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinases+as+targets+for+cancer+therapy.">Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).</li><li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+balance+between+life+and+death:+targeted+cancer+therapy+and+"oncogenic+shock".">Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock".</a> Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).</li><li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+addiction:+setting+the+stage+for+molecularly+targeted+cancer+therapy.">Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy.</a> Genes &amp; Development. 21, 3214-3231 (2007).</li><li>Weinstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer.+Addiction+to+oncogenes--the+Achilles+heal+of+cancer.">Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer.</a> Science. 297, 63-64 (2002).</li><li>Corbin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chronic+myeloid+leukemia+stem+cells+are+insensitive+to+imatinib+despite+inhibition+of+BCR-ABL+activity.">Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li><li>Wilson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+potential+for+growth-factor-driven+resistance+to+anticancer+kinase+inhibitors.">Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors.</a> Nature. 487, 505-509 (2012).</li><li>Kesarwani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+c-FOS+and+DUSP1+abrogates+intrinsic+resistance+to+tyrosine-kinase+inhibitor+therapy+in+BCR-ABL-induced+leukemia.">Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-fos+regulates+neuronal+excitability+and+survival.">c-fos regulates neuronal excitability and survival.</a> Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).</li><li>Dorfman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+erp/mkp-1+gene+does+not+affect+mouse+development:+normal+MAP+kinase+activity+in+ERP/MKP-1-deficient+fibroblasts.">Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts.</a> Oncogene. 13, 925-931 (1996).</li><li>Padhye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocurcumins+as+cyclooxygenase-2+inhibitor:+molecular+docking,+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+in+mice.">Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice.</a> Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).</li><li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages.">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeting+of+quiescent+chronic+myelogenous+leukemia+stem+cells+by+histone+deacetylase+inhibitors+in+combination+with+imatinib+mesylate.">Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate.</a> Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).</li><li>Koschmieder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+chronic+phase+of+myeloid+leukemia+with+expansion+of+hematopoietic+stem+cells+in+a+transgenic+model+of+BCR-ABL+leukemogenesis.">Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis.</a> Blood. 105, 324-334 (2005).</li><li>Abraham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+targeting+of+p53+and+c-MYC+selectively+eliminates+leukaemic+stem+cells.">Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells.</a> Nature. 534, 341-346 (2016).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+p53+by+SIRT1+inhibition+enhances+elimination+of+CML+leukemia+stem+cells+in+combination+with+imatinib.">Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib.</a> Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).</li><li>. Qiagen-miRNAeasy kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources">https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources</a> (2018)</li><li>. DNA-free DNA removal kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&amp;s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&amp;ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&amp;s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&amp;ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s</a> (2018)</li><li>. SuperScript&#8482; III First-Strand Synthesis System Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051</a> (2018)</li><li>. Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html">https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html</a> (2018)</li><li>Abarrategi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+human+bone+marrow+niche+in+mice:+From+host+bone+marrow+engraftment+to+bioengineering+approaches.">Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches.</a> Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).</li><li>Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+screening+and+validation+of+resistant+mutations+against+kinase+inhibitors.">A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li></ol>

For hovedparten af kræftceller, er den terapeutiske svar TKI medieret af en blokade af tyrosin-kinase-oncoprotein signaler som tumor er afhængige af. Imidlertid er relativt lidt kendt om hvordan et mindretal af kræftceller bidrager til MRD undslippe onkogen afhængighed og terapi4. Nylige undersøgelser afslørede, at vækstfaktor signalering medierer resistens i både leukæmi og solid orgel tumorer. Dette tyder på, at forskellige molekylære mekanismer kan ligge til grund for iboende modstan...

Konstituerende tyrosin kinase aktivitet i BCR-ABL1 fusion onkogen forårsager CML, som giver et rationale for at målrette kinase aktivitet af lille molekyle hæmmere. TKIs succes i behandling af CML patienter revolutioneret begrebet målrettet behandling1,2. Efterfølgende, anti-kinase terapi som præcision medicin blev udviklet for flere andre maligniteter, herunder solide tumorer. Indtil videre er er mere end tredive kinase hæmmere blevet godkendt af United State FDA til behandling af forskellige maligniteter. Mens TKI behandling er meget effektiv til at undertrykke sygdommen, er det ikke helbredende. Desuden en lille population af kræftceller fortsætter under behandling: MRD3,4,5. Selv patienter, der viste komplet remission er tilbage med MRD, som til sidst resultater i tilbagefald, hvis ikke løbende undertrykt. Derfor, udryddelse af MRD celler er nødvendige for at opnå en holdbar eller helbredende reaktion. CML repræsenterer en værdifuld paradigme for at definere begrebet præcision medicin, oncogenesis og rationelle mål-rettet therapeutics, sygdomsprogression og resistens over for lægemidler. Men selv i dag, mekanisme kørsel TKI-induceret celledød i cancerceller er ikke fuldt forstået, eller hvorfor MRD celler (består af leukemic stamceller [LSCs]) er uløseligt resistente over for TKIs4,6. Ikke desto mindre er fænomenet "onkogen afhængighed" til mutant kinase oncoprotein impliceret i TKI effekten hvor akut hæmning af målrettede onkogen af TKIs forårsager en muterede chok, der fører til en massiv proapoptotic svar eller ubevægelighed i celle kontekst-afhængige måde6,7,8,9. Men den mekanistiske understøttelse af onkogen afhængighed mangler. Nylige undersøgelser har impliceret at vækstfaktor signalering ophæver onkogen afhængighed og dermed giver resistens over for TKI terapi10,11,12. Derfor, for at få indsigt i mekanismen af onkogen afhængighed, vi udførte hele-genom udtryk profilering fra BCR-ABL1 afhængige og nonaddicted celler (vokset med vækstfaktorer), som viste, at c-Fos og Dusp1 er vigtige formidlere af onkogen afhængighed13. Den genetiske sletning af c-Fos og Dusp1 er syntetiske dødelige at BCR-ABL1-udtrykker celler og mus bruges i eksperimentet udvikle ikke leukæmi. Derudover helbredt hæmning af c-Fos og DUSP1 af lille molekyle hæmmere BCR-ABL1-induceret CML i mus. Resultaterne viser, at udtrykket niveauer af c-Fos og Dusp1 definerer den apoptotiske tærskel i kræftceller, således at lavere niveauer giver drug følsomhed, mens højere niveauer forårsage resistens over for terapi13.
For at identificere de gener kørsel onkogen afhængighed, udført vi flere hele-genom udtryk profilering eksperimenter vækst faktor og en TKI (imatinib) ved hjælp af både mus- og CML patient-afledte celler (K562). Disse data blev analyseret parallelt med CML patient datasæt fra CD34+ hæmatopoietisk stamceller før og efter behandling med imatinib. Denne analyse viste tre gener (en transkriptionsfaktor [c-Fos], dobbelt specificitet fosfatase 1 [Dusp1], og et RNA-bindende protein [Zfp36]) er almindeligt upregulated i TKI-resistente celler. For at validere betydningen af disse gener i giver resistens over for lægemidler, foretog vi en trinvis i in vitro og i vivo analyse. Udtrykket niveauer af disse gener er blevet bekræftet af real-time qPCR (RT-qPCR) og western blotting i resistente celler. Yderligere, cDNA overekspression og knockdown af shRNA Hårnåle af c-Fos, Dusp1, og Zfp36 viste, at forhøjet c-Fos og Dusp1 udtryk er tilstrækkeligt og nødvendigt at overdrage TKI modstand. Derfor, vi udføres en in vivo validering ved hjælp af musen modeller med c-Fos og Dusp1 kun. For genetiske validering af c-Fos og Dusp1, vi skabt ROSACreERT-inducerbar c-Fosfl/fl mus (betinget knockout)14 og krydsede dem med Dusp1- / - (lige knockout)15 at gøre ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1- / - dobbelt-Transgene mus. Knoglemarv-afledte c-Kit+ celler (fra c-Fosfl/fl-, Dusp1- / --, og c-Fosfl/flDusp1- / -) udtrykker BCR-ABL1 blev analyseret i vitro i en kolonidannende enhed (CFU) analyse, og i vivo af knoglemarvstransplantation i lethally bestrålede mus, at teste kravet om c-Fos og Dusp1 alene eller sammen i udvikling af leukæmi. Ligeledes, de kemiske hæmninger af c-Fos af DFC (difluorinated curcumin)16 og Dusp1 af BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 blev testet in vitro- og in vivo, ved hjælp af BCR-ABL1-udtrykker, knogle marv-afledte c-Kit+ celler fra wild-type (WT) mus. For at bekræfte kravet om c-Fos og Dusp1 i leukemic stamceller, udnyttede vi en CML musen model hvor BCR-ABL1 var specielt induceret i sin stamceller af doxycyclin (Tet-transaktivatoren udtrykker under murine stem cell leukæmi (SCL) gen 3' enhancer forordning)18,19. Vi brugte knoglemarv Lin-Sca+c-Kit+ (LSK) celler fra disse mus i en in vivo transplantation assay. Desuden, vi etableret phopsho-p38 niveauer og udtryk af IL-6 som farmakodynamiske biomarkører for Dusp1 og c-Fos hæmning, henholdsvis, i vivo. Endelig, for at udvide undersøgelsen for menneskelige relevans, patient-afledte CD34+ celler (svarende til c-Kit+ celler fra mus) blev underkastet en langsigtet in vitro-kultur-indlede celle assays (LTCIC) og en in vivo humaniseret musemodel af CML20,21. Immundefekte musene blev transplanteret med CML CD34 + celler, efterfulgt af behandling og analyse af menneskers leukemic celle overlevelse.
I dette projekt udvikler vi metoder til målet identifikation og validering ved hjælp af både genetiske og kemiske værktøjer, ved hjælp af forskellige prækliniske modeller. Disse metoder kan anvendes med succes for at validere andre mål udvikle kemiske modaliteter for terapeutisk udvikling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:948px;" width="946">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:424px;">Biological Materials</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-016-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>3434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>4434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Hydroxytamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DFC</td>
			<td>LKT Laboratories Inc.</td>
			<td>D3420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCI</td>
			<td>Chemzon Scientific</td>
			<td>NZ-06-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imatinib</td>
			<td>LC Laboratory</td>
			<td>I-5508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458-37-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NDGA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>500-38-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penn/Strep</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1XPBS</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-005-CL</td>
			<td style="width:131px;">5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3369</td>
			<td style="width:131px;">5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45uM acro disc filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70um nylon cell stariner</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)</td>
			<td>Simga</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>CO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocullulose Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45R (B220)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>553092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45.1-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0453-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45.2-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0454-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hCD45-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Biotin-FITC</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-857&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-7-4</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>MA5-16539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ter-119</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>558612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD117 APC&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>553356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharm Lyse</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">BD Perm/Wash&#160; (permeabilization and wash solution for phospho flow)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phospho p38</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4511S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">total p38</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse IgG control</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Flour 488 conjugated&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K278001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X HBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K278002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood Capillary Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-260-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood Collection Tube</td>
			<td>Giene Bio-One</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Newborn Calf Serum</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erythropoiein</td>
			<td>Amgen</td>
			<td>5513-267-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human IL-3</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">G-SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GM-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyeloCult (media for LTCIC assay)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mortor pestle</td>
			<td>Coor tek&#160;</td>
			<td>60316 and 60317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflorane (Isothesia TM)</td>
			<td>Butler Schien</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B90920s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td style="width:131px;">100mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto agar (agar)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E-3119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Doxycycline chow</td>
			<td>TestDiet.com</td>
			<td>52662</td>
			<td style="width:131px;">modified RMH1500, Autoclavable 5LK8&#160; with 0.0625% Doxycycline&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodonitrotetrazolium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I10406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dneasy Blood &#38; tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">miRNeasy Mini Kit&#160; (RNA isolation kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)</td>
			<td>Ambion, Life Technologies</td>
			<td>AM1906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD117 MicroBead Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay</td>
			<td>Stemp Cell Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing bucket rotor cetrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TC-10 automated cell counter</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C-1000 Thermal cycler</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mastercycler Real Plex 2</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemavet ( boold counter)</td>
			<td>Drew-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSR II ( FACS analyzer)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fortessa I ( FACS analyzer)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSAriaII ( FACS Sorter)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnet Stand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Irradiator</td>
			<td style="width:247px;">&#160;J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA</td>
			<td>Mark I Model 68A</td>
			<td>source Cs 137</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSACreERT2</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scl-tTA&#160;</td>
			<td>Dr. Claudia Huettner&#8217;s lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BoyJ&#160;</td>
			<td>mouse core facility at CCHMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57Bl/6&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NSGS</td>
			<td>mouse core facility at CCHMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-&#160;</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSACreERT2/c-Fosfl/fl</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">BaF3</td>
			<td style="width:247px;">Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">WEHI</td>
			<td style="width:247px;">Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">CML-CD34+ and Normal CD34+ cells</td>
			<td style="width:247px;">University Hospital, University of Cincinnati</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for evaluating the role of c-fos and dusp1 in oncogene dependence

Demonstration af tyrosin kinase hæmmere (TKIs) til behandling af kronisk myeloid leukæmi (CML) har indvarslet en ny æra i kræft therapeutics. Men en lille population af celler ikke reagerer på TKI behandling, hvilket resulterer i minimal residual sygdom (MRD); selv de mest potente TKIs undlader at udrydde disse celler. Disse MRD celler fungerer som et reservoir til at udvikle resistens over for behandling. Hvorfor TKI behandling er ineffektive mod MRD celler er ikke kendt. Vækstfaktor signalering er impliceret i støtte MRD celler kan overleve under TKI behandling, men en mekanistisk forståelse, der mangler. Nylige undersøgelser viste, at et forhøjet c-Fos og Dusp1 udtryk som følge af konvergerende mutationer og vækstfaktor signalering i MRD celler mægle TKI modstand. Den genetiske og kemiske hæmning af c-Fos og Dusp1 gengiver CML udsøgt følsomme over for TKIs og hærder CML i både genetiske og humaniseret musemodeller. Vi identificeret disse mål gener ved hjælp af flere microarrays fra TKI-følsomme og -resistente celler. Her, leverer vi metoder til target validering ved hjælp af in vitro- og in vivo musemodeller. Disse metoder kan nemt anvendes på enhver mål for genetiske validering og terapeutisk udvikling.

Onkogen afhængighed har været impliceret i den terapeutiske virkning af TKIs. Men de mekanismer, der driver onkogen afhængighed er ikke forstået. Vi udførte flere uvildige gen expression analyser for at identificere den genetiske komponent involveret i iscenesætte afhængighed. Disse analyser viste opregulering af tre gener, c-Fos, Dusp1 og Zfp36, i kræftceller, der er ikke afhængige muterede signalering for overlevelse, og således er ufølsom over for TKI behandling. Downregulat...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence at JoVE.com

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Metoder til evaluering af c-Fos rolle og Dusp1 i onkogen afhængighed

Her beskriver vi protokoller for genetiske og kemiske validering af c-Fos og Dusp1 som en drug target i leukæmi ved hjælp af in vitro- og in vivo genetiske og humaniseret musemodeller. Denne metode kan anvendes på ethvert mål for genetiske validering og terapeutisk udvikling.

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i kræft terapeutiske områder, såsom identifikation af centrale gener, der er involveret i oncogene afhængighed. Den største fordel ved denne teknik er, at det udnytter oncogene afhængighed, der er fælles for mange kinase drevet kræft derfor er det gældende for flere tumortyper. Selv om denne metode kan give indsigt i leukæmi, Det kan også anvendes til andre systemer, ligesom solide tumorer såsom lungekræft, hjernetumorer, og pancreas tumorer.Generelt, personer nye til denne metode vil kæmpe på grund af manglende erfaring i molekylær biologi og cellulær fysiologi. Til at begynde, høste benet knogler fra en aflivet mus. Rengør væv fra knoglerne med en skalpel.Derefter placere knoglerne i koldt PBS på is og knuse knoglerne med en støder. Derefter filtreres celleophænget gennem en 70 mikrometercelles si i et 50 milliliter skruedækselrør med en 10 milliliterpipette. Morter og støder flere gange med kold PBS og tilsæt cellesuspensionen til 50 milliliterrøret.Næste centrifuge knoglemarven og fjern supernatant med vakuum og glas pipette. Opsplit cellepellet i 5 milliliter PBS. Ved hjælp af en pipette, langsomt tilføje suspenderet knoglemarv til toppen af stuetemperatur poly-saccharose.Derefter drejes polysucrosen ved 400 Gs i 20 minutter med bremsen slukket. Efter centrifugering indsamles den overskyede samlede mono-nukleare cellegrænseflade med en pipette og overføres den til et nyt 15 milliliterrør. Bring volumen til 10 milliliter med PBS og fjern 20 mikroliter til optælling.Efter centrifugering kasseres supernatanten og pellets på is. Dernæst resuspenderet celle pellet i PBS med EDTA og BSA. Tilføj CD117 mikroperler til celle suspension, og vortex at blande.Efter dette, inkubere suspensionen i 10 minutter ved 4 grader Celsius. Derefter bringes volumen op til 10 milliliter med mere PBS med EDTA og BSA og centrifuge ved 1200 G's ved 4 grader Celsius i 5 minutter. Brug et vakuum til at fjerne supernatanten og suspendere cellepellet i PBS med EDTA og BSA.Derefter tilsættes 3 milliliter PBS med EDTA og BSA til en magnetholder med en magnetisk søjle og lad den flyde ind i et opsamlingsrør. Når bufferen er færdig med at strømme gennem kolonnen, skal du tilføje cellesuspensionen og lade den flyde gennem kolonnen ind i samlingsrøret. Dernæst tilsættes 5 milliliter PBS med EDTA og BSA til kolonnen og skyl den straks med stemplet.Fjern stemplet, og gentag flugten, før cellerne tælles. Efter centrifugering af cellerne fjernes supernatanten og cellepellet suspenderes i komplet IMDM til kultur. Kultur cellerne natten over ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Først kombinere retroviral plasmid DNA med emballagen plasmid, calciumchlorid og vand i en 1,5 milliliter rør. Derefter tilsættes 500 mikroliter HBS til et andet 1,5 milliliterrør. Tilsæt transfektionsblandingen drop-wise til røret, der indeholder HBS, samtidig med at den blandes med vortexeren indstillet til den laveste indstilling.Transfektionsblandingen inkuberes ved stuetemperatur i 20 til 30 minutter. I inkubationstiden tilsættes chloroquin til HEK-cellerne og opbevares i inkubatoren. Efter tilsætning af transfektionsblandingen inkuberes cellerne i 8 timer i en 37 grader Celsius 5% CO2-inkubator, der ændrer cellemediet ved at tilføje 14 milliliter friske DMEM10-medier meget langsomt.Pipettering langsomt mod væggen af skålen hjælper med at forhindre enhver stripning af HEK celler. Derefter inkubere cellerne natten over i 37 grader Celsius 5% CO2 inkubator. Brug en 10 milliliter sprøjte til at indsamle den virale supernatant.Derefter sættes et 0,45 mikrometersprøjtefilter fast på sprøjten. den virale supernatant ind i et nyt samlingsrør. Indsamle viral supernatant ca 16 timer senere.Efter dette tilsættes to milliliter rekombinant humant fibronectinfragment i PBS til ubehandlede 6 brøndkulturplader. Den næste dag, bruge en pipette til at fjerne fibronectin fra pladerne. Bloker pladerne med 2% BSA i PBS og inkuber pladerne ved stuetemperatur i 30 minutter.Brug et vakuum til at fjerne BSA og vask pladerne med PBS, før du fjerner det med et vakuum. Derefter tilsættes straks den filtrerede virale supernatant og centrifuge pladen i to timer. Brug et vakuum til at fjerne supernatanten og drej pladen igen.Fjern derefter supernatanten med et vakuum og vask de virale belagte brønde med PBS. Fjern PBS med et vakuum, tilsæt tidligere dyrkede c-Kip plus museceller til de virale belagte brønde. Efter centrifugering inkuberes cellerne ved 37 grader Celsius og 5 % kuldioxid.48 timer efter transduktion pellets cellerne via centrifugering og opslæmmede dem i FACS buffer 1. Tø først methylcellulose op med cytokiner til mus ved stuetemperatur. Derefter aliquot 3 milliliter methyl cellulose i et FACS rør.Der tilsættes 100 mikroliter af cellesuspensionen med de relevante inhibitorer til 3 milliliter methylcellulose. Så vortex suspensionen på høj i 10 til 30 sekunder. Når de fleste luftbobler er flygtet, skal du bruge en 1 millilitersprøjte til at plade 1 milliliter af mediet i tre replikatplader.Læg pladerne i en stor petriskål sammen med en åben skål, der indeholder sterilt vand. Derefter dække den store petriskål og inkubere cellerne ved 37 grader Celsius. Der forbered iodonitrotetrazoliumchloridplet ved at opløse 10 mg iodonitrotetrazolchlorid i 10 milliliter vand.Filter sterilisere farvningsopløsningen med en Luer-låsesprøjte udstyret med et 0,2 mikrometerfilter. I vævskulturhætten tilsættes 100 mikroliter af farvningsopløsningen drop-wise omkring CFU-pladen. Derefter inkubere pladerne natten over ved 37 grader Celsius i en cellekultur inkubator.Endelig, efter kolonierne har vendt en mørk rød brun farve, skal du bruge en hvid baggrund i det sterile væv kultur hætte til at tage billeder af den farvede CFU plade. I denne protokol blev flere upartiske genudtryksanalyser brugt til at identificere den genetiske komponent, der orkestrerer oncogene afhængighed. For at validere c-Fos' rolle og dusp1 som det terapeutiske mål i leukæmi blev deres overekspression bekræftet med celler, der udtrykker BCR-ABL1 oncogene.Analyse via RT-qPCR og vestlige blotting bekræftede, at begge blev induceret af BCR-ABL1, og at deres udtryk er forstærket af vækstfaktor IL-3. YFP plus udtrykkende celler blev sorteret via FACS for yderligere in vitro og in vivo assays. Resultaterne viste, at sletning af c-Fos og Dusp1 alene hæmmet CFU numre.Celler, der manglede både c-Fos og Dusp1 blev væsentligt kompromitteret i deres evne til at danne kolonier og Imatinib behandling udslettet alle CFUs angiver, at tabet af c-Fos og Dusp1 er syntetisk dødelig til BCR-ABL1 udtryk. Efter denne udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for kræft til at udforske de genetiske netværk og gener, der driver oncogene afhængighed, og hvordan disse gener påvirker deres særlige reaktion i musemodeller og menneskelige patienter. Glem ikke, at arbejde med retrovirus og patientprøver kan være yderst farligt og sikkert laboratoriepraksis bør overholdes, mens du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cokultur Analyser til Undersøgelse makrofag og Mikroglia Stimulering af glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Det<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginære Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantificering af genekspression og tumorindtrængen Brug Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluering af In Vitro DNA skader med Comet Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

To-dimensionelle gelelektroforese kombineret med massespektrometri metoder til analyse af menneskelige hypofyseadenom væv proteom

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Evaluering af rollen mitokondriel funktion i Cancer-relaterede træthed

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3D-celle kultur System for at studere Invasion og evaluere Therapeutics i blærekræft

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Karakterisere sygdomsrelaterede mutanter af RAF-familie kinaser ved hjælp af et sæt praktiske og gennemførlige metoder

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluering af differentierings kapaciteten af mus prostata Epiteliale celler ved hjælp af Organoid kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

Integrering af Bioinformatik tilgange og eksperimentelle valideringer for at forstå rollen af notch signalering i kræft i æggestokkene

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering cell død ved hjælp af cellefri supernatant af probiotika i tre-dimensionelle sfæroid kulturer colorectal cancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...