Name: methods for evaluating the role of c-fos and dusp1 in oncogene dependence
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence at JoVE.com

Die Autoren sind dankbar für G. Q. Daley für die Bereitstellung der BaF3 und WEHI-Zellen und T. Reya für MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP konstruiert. Die Autoren sind dankbar, M. Carroll für die Bereitstellung der Patientenproben aus der CML-Explosion-Krise. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse zu M.A von NCI (1RO1CA155091), die Leukämie Research Foundation und V-Stiftung und von der NHLBI (R21HL114074-01).

Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) in Cincinnati Children Hospital Medical Center (CCHMC) durchgeführt. Menschliche Exemplare (Normal BM und von CML (p210-BCR-ABL +) Leukämie) wurden durch Institutional Review Board genehmigt Protokolle erhalten (Institutional Review Board: Federalwide Qualitätssicherung #00002988 Cincinnati Children Hospital Medical Center) und Spender-informierten Einwilligung von CCHMC und der University of Cincinnati.
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	<li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247, 824-830 (1990).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).</li><li>Mahon, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuation+of+imatinib+in+patients+with+chronic+myeloid+leukaemia+who+have+maintained+complete+molecular+remission+for+at+least+2+years:+the+prospective,+multicentre+Stop+Imatinib+(STIM)+trial.">Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial.</a> Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).</li><li>O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+limits+of+targeted+therapy+in+chronic+myeloid+leukaemia.">Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).</li><li>Rousselot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+mesylate+discontinuation+in+patients+with+chronic+myelogenous+leukemia+in+complete+molecular+remission+for+more+than+2+years.">Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years.</a> Blood. 109, 58-60 (2007).</li><li>Krause, D. S., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinases+as+targets+for+cancer+therapy.">Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).</li><li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+balance+between+life+and+death:+targeted+cancer+therapy+and+"oncogenic+shock".">Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock".</a> Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).</li><li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+addiction:+setting+the+stage+for+molecularly+targeted+cancer+therapy.">Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy.</a> Genes &amp; Development. 21, 3214-3231 (2007).</li><li>Weinstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer.+Addiction+to+oncogenes--the+Achilles+heal+of+cancer.">Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer.</a> Science. 297, 63-64 (2002).</li><li>Corbin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chronic+myeloid+leukemia+stem+cells+are+insensitive+to+imatinib+despite+inhibition+of+BCR-ABL+activity.">Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li><li>Wilson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+potential+for+growth-factor-driven+resistance+to+anticancer+kinase+inhibitors.">Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors.</a> Nature. 487, 505-509 (2012).</li><li>Kesarwani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+c-FOS+and+DUSP1+abrogates+intrinsic+resistance+to+tyrosine-kinase+inhibitor+therapy+in+BCR-ABL-induced+leukemia.">Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-fos+regulates+neuronal+excitability+and+survival.">c-fos regulates neuronal excitability and survival.</a> Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).</li><li>Dorfman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+erp/mkp-1+gene+does+not+affect+mouse+development:+normal+MAP+kinase+activity+in+ERP/MKP-1-deficient+fibroblasts.">Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts.</a> Oncogene. 13, 925-931 (1996).</li><li>Padhye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocurcumins+as+cyclooxygenase-2+inhibitor:+molecular+docking,+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+in+mice.">Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice.</a> Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).</li><li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages.">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeting+of+quiescent+chronic+myelogenous+leukemia+stem+cells+by+histone+deacetylase+inhibitors+in+combination+with+imatinib+mesylate.">Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate.</a> Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).</li><li>Koschmieder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+chronic+phase+of+myeloid+leukemia+with+expansion+of+hematopoietic+stem+cells+in+a+transgenic+model+of+BCR-ABL+leukemogenesis.">Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis.</a> Blood. 105, 324-334 (2005).</li><li>Abraham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+targeting+of+p53+and+c-MYC+selectively+eliminates+leukaemic+stem+cells.">Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells.</a> Nature. 534, 341-346 (2016).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+p53+by+SIRT1+inhibition+enhances+elimination+of+CML+leukemia+stem+cells+in+combination+with+imatinib.">Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib.</a> Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).</li><li>. 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Für den Großteil der Krebszellen ist die therapeutische Reaktion zu TKI durch eine Blockade der Tyrosin-Kinase-Oncoprotein Signale vermittelt, bei denen der Tumor süchtig ist. Jedoch ist relativ wenig bekannt über wie eine Minderheit von Krebszellen, die einen Beitrag zur MRD escape das Onkogen Abhängigkeit und Therapie4. Neuere Studien gezeigt, dass Wachstumsfaktor Signalisierung Resistenzen in Leukämie und solide Orgel Tumoren vermittelt. Dies deutet darauf hin, dass verschiedene molekular...

Konstitutive Tyrosin-Kinase-Aktivität von BCR-ABL1 Fusion Onkogen verursacht CML, sorgt für eine Begründung um die Kinase-Aktivität von niedermolekularer Hemmer ansprechen. Der Erfolg von TKIs bei der Behandlung von CML-Patienten revolutioniert das Konzept der gezielten Therapie1,2. Anschließend entwickelte Anti-Kinase-Therapie als Präzisionsmedizin für mehrere andere Malignome, einschließlich der solide Tumoren. Bisher sind mehr als dreißig Kinase-Inhibitoren von der United State FDA für die Behandlung von verschiedenen malignen Erkrankungen zugelassen. TKI-Behandlung ist, zwar sehr effektiv bei der Bekämpfung der Krankheitsbildes ist es nicht heilende. Außerdem besteht eine kleine Population von Krebszellen während der Behandlung: die MRD3,4,5. Selbst Patienten, die eine kompletten Remission zeigte bleiben MRD, die schließlich Ergebnisse in Rückfall, wenn nicht ständig unterdrückt. Daher ist die Beseitigung der MRD-Zellen benötigt, um eine dauerhafte oder heilende Reaktion zu erreichen. CML ist eine wertvolle Paradigma für das Konzept der Präzisionsmedizin, Mechanismen der Onkogenese, rationale Ziel gerichtete Therapie, Krankheitsverlauf und Resistenzen zu definieren. Aber auch heute noch die TKI-induzierte Zelltod bei Krebszellen zu fahren ist nicht vollständig geklärt, noch warum MRD Zellen (bestehend aus leukämischen Stammzellen [LSCs]) sind intrinsisch resistent gegen TKIs4,6. Dennoch ist das Phänomen der "Onkogen Abhängigkeit von" mutierten Kinase Oncoprotein TKI Wirksamkeit beteiligt wo die akuten Hemmung der gezielten Onkogen von TKIs einen onkogenen Schock verursacht, der zu einer massiven Proapoptotic Antwort oder Ruhe in Zelle führt Kontext-abhängigen Weise6,7,8,9. Es fehlen jedoch die mechanistische Onkogen Abhängigkeit zu untermauern. Jüngste Studien haben verwickelt, dass Onkogen Abhängigkeit hebt Wachstumsfaktor Signal- und folglich Resistenz zu TKI-Therapie10,11,12 verleiht. Daher durchgeführt, um einen Einblick in den Mechanismus der Onkogen Abhängigkeit, wir Vollständiggenom Expression profiling von BCR-ABL1 süchtig und nonaddicted Zellen (gewachsen mit Wachstumsfaktoren), die ergab, dass c-Fos und Dusp1 wichtige Mediatoren der sind Onkogen sucht13. Die genetische Löschung von c-Fos und Dusp1 ist synthetischen tödlich für BCR-ABL1 mit dem Ausdruck Zellen und die Mäuse im Experiment nicht Leukämie entwickeln. Darüber hinaus geheilt die Hemmung der c-Fos und DUSP1 von niedermolekularer Hemmer BCR-ABL1-induzierte CML bei Mäusen. Die Ergebnisse zeigen, dass Ausdruck Niveaus von c-Fos und Dusp1 in Krebszellen, die Apoptotic Schwellenwert definieren, so dass niedrigere Medikament Empfindlichkeit verleihen, während höhere Resistenz gegen Therapie13führen.
Um die Fahrt der Onkogen Abhängigkeit Gene zu identifizieren, haben wir mehrere Vollständiggenom Expressions-profiling Experimente im Beisein von Wachstumsfaktor und einem TKI (Imatinib) mit Maus und CML Patienten gewonnenen Zellen (K562) durchgeführt. Diese Daten wurden analysiert, parallel mit CML Patienten Datensätze CD34 gewonnenen+ Blutstammzellen vor und nach der Behandlung mit Imatinib. Diese Analyse ergab drei Gene (ein Transkriptionsfaktor [c-Fos], duale Spezifität Phosphatase 1 [Dusp1], und ein RNA-bindende Protein [Zfp36]) sind häufig in TKI-resistenten Zellen hochreguliert. Um die Bedeutung dieser Gene in Übertragung Resistenzen zu validieren, werden Schritt für Schritt in Vitro und in Vivo -Analyse durchgeführt. Der Ausdruck Niveaus dieser Gene wurden durch Echtzeit-qPCR (RT-qPCR) und westliche Beflecken in resistenten Zellen bestätigt. Weitere, cDNA-Überexpression und Zuschlag von ShRNA Haarnadeln von c-Fos, Dusp1, und Zfp36 ergab, dass erhöhte c-Fos und Dusp1 Ausdrücke sind ausreichende und notwendige zu TKI-Resistenz verleihen. Daher führten wir eine in-vivo Validierung mithilfe von Mausmodellen mit c-Fos und Dusp1 nur. Für die genetische Validierung von c-Fos und Dusp1 wir ROSACreERT-induzierbaren c-Fosfl/fl Mäuse (conditional Knockout)14 geschaffen und kreuzten sie mit Dusp1- / - (gerade Knockout)15 zu ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1- / - Doppel-transgener Mäuse. Knochenmark stammenden c-Kit+ Zellen (von c-Fosfl/fl-, Dusp1- / -- und c-Fosfl/flDusp1- / -) auszudrücken BCR-ABL1 analysierten in Vitro in einer Kolonie-bildende Einheit (KBE) Assay und in waren Vivo durch Knochenmark-Transplantation bei letal bestrahlten Mäusen, die Anforderung von c-Fos und Dusp1 allein oder zu zweit in Leukämie Entwicklung zu testen. Ebenso die chemische Hemmungen von c-Fos von DFC (Difluorinated Curcumin)16 und Dusp1 von BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 getestet wurden in vitro und in vivo mit BCR-ABL1-mit dem Ausdruck, Knochen Knochenmark stammenden c-Kit+ Zellen von der Wildtyp (WT) Maus. Um die Anforderung des c-Fos und Dusp1 in leukämischen Stammzellen zu bestätigen, haben wir eine CML-Maus-Modell wo BCR-ABL1 speziell in seiner Stammzellen durch Doxycyclin (Tet-Transaktivator drückt unter murinen Stammzellen Leukämie (SCL) Gen 3' Enhancer induziert wurde verwendet Verordnung)18,19. Wir verwendeten Knochenmark Lin–Sca+c-Kit+ (LSK) Zellen aus diesen Mäusen in einer in-vivo-Transplantation-Assay. Darüber hinaus wir Phopsho-p38 Ebenen und den Ausdruck von IL-6 als Pharmako-Dynamik Biomarker für Dusp1 und c-Fos Hemmung bzw. geschaffen, in Vivo. Zu guter Letzt, die Studie zur Relevanz für den Menschen, Patienten abgeleitet CD34 auszudehnen+ Zellen (entspricht der c-Kit+ -Zellen von Mäusen) wurden langfristige unterzogen in-vitro-Kultur-Einleitung Zelle Assays (LTCIC) und eine in-vivo humanisierten Mausmodell der CML20,21. Die immungeschwächte Mäuse wurden mit CML CD34 + Zellen, gefolgt von medikamentöse Behandlung und Analyse der menschlichen leukämischen Zellen überleben transplantiert.
In diesem Projekt entwickeln wir Methoden für Zielkennzeichnung und Validierungen mit genetischen und chemischen Werkzeugen mit verschiedenen präklinischen Modellen. Diese Methoden können erfolgreich angewendet werden, um andere Ziele entwickeln chemische Modalitäten für die therapeutische Entwicklung zu überprüfen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:948px;" width="946">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:424px;">Biological Materials</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-016-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>3434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>4434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Hydroxytamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DFC</td>
			<td>LKT Laboratories Inc.</td>
			<td>D3420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCI</td>
			<td>Chemzon Scientific</td>
			<td>NZ-06-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imatinib</td>
			<td>LC Laboratory</td>
			<td>I-5508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458-37-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NDGA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>500-38-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penn/Strep</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1XPBS</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-005-CL</td>
			<td style="width:131px;">5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3369</td>
			<td style="width:131px;">5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45uM acro disc filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70um nylon cell stariner</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)</td>
			<td>Simga</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>CO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocullulose Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45R (B220)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>553092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45.1-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0453-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45.2-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0454-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hCD45-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Biotin-FITC</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-857&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-7-4</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>MA5-16539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ter-119</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>558612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD117 APC&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>553356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharm Lyse</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">BD Perm/Wash&#160; (permeabilization and wash solution for phospho flow)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phospho p38</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4511S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">total p38</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse IgG control</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Flour 488 conjugated&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K278001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X HBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K278002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood Capillary Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-260-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood Collection Tube</td>
			<td>Giene Bio-One</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Newborn Calf Serum</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erythropoiein</td>
			<td>Amgen</td>
			<td>5513-267-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human IL-3</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">G-SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GM-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyeloCult (media for LTCIC assay)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mortor pestle</td>
			<td>Coor tek&#160;</td>
			<td>60316 and 60317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflorane (Isothesia TM)</td>
			<td>Butler Schien</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B90920s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td style="width:131px;">100mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto agar (agar)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E-3119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Doxycycline chow</td>
			<td>TestDiet.com</td>
			<td>52662</td>
			<td style="width:131px;">modified RMH1500, Autoclavable 5LK8&#160; with 0.0625% Doxycycline&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodonitrotetrazolium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I10406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dneasy Blood &#38; tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">miRNeasy Mini Kit&#160; (RNA isolation kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)</td>
			<td>Ambion, Life Technologies</td>
			<td>AM1906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD117 MicroBead Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay</td>
			<td>Stemp Cell Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing bucket rotor cetrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TC-10 automated cell counter</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C-1000 Thermal cycler</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mastercycler Real Plex 2</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemavet ( boold counter)</td>
			<td>Drew-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSR II ( FACS analyzer)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fortessa I ( FACS analyzer)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSAriaII ( FACS Sorter)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnet Stand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Irradiator</td>
			<td style="width:247px;">&#160;J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA</td>
			<td>Mark I Model 68A</td>
			<td>source Cs 137</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSACreERT2</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scl-tTA&#160;</td>
			<td>Dr. Claudia Huettner&#8217;s lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BoyJ&#160;</td>
			<td>mouse core facility at CCHMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57Bl/6&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NSGS</td>
			<td>mouse core facility at CCHMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-&#160;</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSACreERT2/c-Fosfl/fl</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">BaF3</td>
			<td style="width:247px;">Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">WEHI</td>
			<td style="width:247px;">Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">CML-CD34+ and Normal CD34+ cells</td>
			<td style="width:247px;">University Hospital, University of Cincinnati</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for evaluating the role of c-fos and dusp1 in oncogene dependence

Die Demonstration der Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKIs) bei der Behandlung von chronisch-myeloischer Leukämie (CML) hat eine neue Ära in der Krebstherapie eingeläutet. Jedoch reagiert eine kleine Population von Zellen nicht auf TKI Behandlung, was zu minimaler Resterkrankung (MRD); auch die potenten TKIs scheitern, diese Zellen zu beseitigen. Diese MRD-Zellen dienen als Reservoir Resistenz gegen Therapie entwickeln. Warum TKI Behandlung gegen MRD Zellen unwirksam ist, ist nicht bekannt. Growth Factor Signalisierung unterstützt das Überleben der MRD-Zellen während der TKI Behandlung verwickelt ist, aber ein mechanistisches Verständnis fehlt. Jüngste Studien gezeigt, dass erhöhte c-Fos und Dusp1 Ausdruck durch konvergente onkogenen und Wachstumsfaktor Signalisierung in MRD Zellen TKI-Resistenz zu vermitteln. Die genetische und chemische Hemmung der c-Fos und Dusp1 CML exquisit empfindlich auf TKIs macht und heilt CML in beide genetischen und humanisierte Mausmodelle. Wir identifizieren dieser Zielgene mit mehreren Microarrays von TKI-empfindlichen und -resistente Zellen. Hier bieten wir Methoden zur Target-Validierung mit in vitro und in vivo Mausmodellen. Diese Methoden können leicht auf jedes Ziel für genetische Validierung und therapeutische Entwicklung angewendet werden.

Onkogen sucht hat bei der therapeutischen Wirksamkeit von TKIs verwickelt. Allerdings sind die Mechanismen, die fahren der Onkogen Abhängigkeit nicht verstanden. Wir führten mehrere unvoreingenommene Genexpressionsanalysen um die genetische Komponente beteiligt orchestrieren die sucht zu identifizieren. Diese Analysen ergaben die Hochregulation von drei Genen, c-Fos, Dusp1 und Zfp36, in Krebszellen, die sind nicht abhängig von onkogenen Signalisierung für überleben und sind daher une...

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Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in Abhängigkeit der Onkogen

Hier beschreiben wir Protokolle für die genetischen und chemischen Validierung von c-Fos und Dusp1 als Medikament Ziel bei Leukämie mit in vitro und in vivo genetische und humanisierte Mausmodelle. Diese Methode kann auf jedes beliebige Ziel für genetische Validierung und therapeutische Entwicklung angewendet werden.

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselweisen Fragen in Krebstherapeutika-Bereichen zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung von Schlüsselgenen, die an der Onkogenabhängigkeit beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Onkogenabhängigkeit nutzt, die vielen Kinase-getriebenen Krebsarten gemeinsam ist, daher ist sie auf mehrere Tumortypen anwendbar. Obwohl diese Methode Einblick in Leukämie geben kann, Kann es auch auf andere Systeme angewendet werden, wie solide Tumoren wie Lungenkrebs, Hirntumoren, und Bauchspeicheldrüsentumoren.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund mangelnder Erfahrung in der Molekularbiologie und Zellphysiologie kämpfen. Zu Beginn ernten Sie die Beinknochen von einer eingeschläferten Maus. Reinigen Sie das Gewebe von den Knochen mit einem Skalpell.Dann legen Sie die Knochen in kalten PBS auf Eis und zerkleinern Sie die Knochen mit einem Stößel. Danach filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Schraubverschlussrohr mit einer 10-Milliliter-Pipette. Waschen Sie den Mörtel und Stößel mehrmals mit kalten PBS und fügen Sie die Zellsuspension auf die 50 Milliliter Rohr.Nächste Zentrifuge das Knochenmark und entfernen Sie den Überstand mit Vakuum und Glaspipette. Setzen Sie das Zellpellet in 5 Milliliter PBS wieder auf. Mit einer Pipette, fügen Sie langsam das hängende Knochenmark an der Oberseite der Raumtemperatur Polysukrose.Danach drehen Sie die Polysaccharose bei 400 Gs für 20 Minuten mit ausgeschalteter Bremse. Nach der Zentrifugation die trübe gesamte mono-nukleare Zellschnittstelle mit einer Pipette sammeln und in ein neues 15-Milliliter-Rohr übertragen. Bringen Sie das Volumen auf 10 Milliliter mit PBS und entfernen Sie 20 Mikroliter zum Zählen.Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet auf Eis legen. Als nächstes setzen Sie das Zellpellet in PBS mit EDTA und BSA wieder aus. Fügen Sie CD117 Mikroperlen zur Zellsuspension hinzu und mischen Sie wirbeln.Danach die Suspension für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius inkubieren. Dann bringen Sie das Volumen bis zu 10 Milliliter mit mehr PBS mit EDTA und BSA und Zentrifuge bei 1200 G bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten. Verwenden Sie ein Vakuum, um den Überstand zu entfernen und das Zellpellet in PBS mit EDTA und BSA aufzuhängen.Dann fügen Sie 3 Milliliter PBS mit EDTA und BSA zu einem Magnetständer mit einer Magnetsäule hinzu und lassen Sie ihn in ein Sammelrohr fließen. Nachdem der Puffer beendet ist, fügen Sie die Zellsuspension hinzu, und lassen Sie sie durch die Spalte in das Auflistungsrohr fließen. Als nächstes fügen Sie 5 weitere Milliliter PBS mit EDTA und BSA in die Säule und spülen Sie sie sofort mit dem Kolben.Entfernen Sie den Kolben und wiederholen Sie den Flush, bevor Sie die Zellen zählen. Nach dem Zentrifugieren der Zellen, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in vollständig IMDM für Kultur. Kultur die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Kombinieren Sie zunächst die retrovirale Plasmid-DNA mit dem Verpackungsplasmid, Calciumchlorid und Wasser in einer 1,5-Milliliter-Röhre. Dann 500 Mikroliter HBS zu einem weiteren 1,5 Milliliter Rohr hinzufügen. Fügen Sie das Transfektionsgemisch tropfenweise in das Rohr, das HBS enthält, und mischen Sie gleichzeitig mit dem Wirbelwirbel, der auf die niedrigste Einstellung eingestellt ist.Inkubieren Sie das Transfektionsgemisch bei Raumtemperatur für 20 bis 30 Minuten. Während der Inkubationszeit chloroquin in die HEK-Zellen geben und im Inkubator aufbewahren. Nach Zugabe des Transfektionsmixes inkubieren Sie die Zellen 8 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius 5%CO2-Inkubator, der die Zellmedien verändert, indem 14 Milliliter frische DMEM10-Medien sehr langsam hinzugefügt werden.Das langsame Pipettieren an der Wand der Schale hilft, ein Abstreifen von HEK-Zellen zu verhindern. Dann inkubieren Sie die Zellen über Nacht im 37 Grad Celsius 5%CO2-Inkubator. Verwenden Sie eine 10 Milliliter Spritze, um den viralen Überstand zu sammeln.Befestigen Sie dann einen 0,45 Mikrometer Spritzenfilter an der Spritze. Tauchen Sie den viralen Überstand in eine neue Sammlungsröhre. Sammeln Sie den viralen Überstand etwa 16 Stunden später.Danach zwei Milliliter rekombinantes humanes Fibronectin-Fragment in PBS zu unbehandelten 6 Brunnenkulturplatten hinzufügen. Verwenden Sie am nächsten Tag eine Pipette, um das Fibronectin von den Platten zu entfernen. Blockieren Sie die Platten mit 2%BSA in PBS und inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur für 30 Minuten.Verwenden Sie ein Vakuum, um BSA zu entfernen und die Platten mit PBS zu waschen, bevor Sie es mit einem Vakuum entfernen. Danach sofort den gefilterten viralen Überstand hinzufügen und die Platte für zwei Stunden zentrifugieren. Verwenden Sie ein Vakuum, um den Überstand zu entfernen und die Platte wieder zu drehen.Als nächstes entfernen Sie den Überstand mit einem Vakuum und waschen Sie die viral beschichteten Brunnen mit PBS. Entfernen Sie die PBS mit einem Vakuum, fügen Sie die zuvor kultivierten c-Kip plus Mauszellen zu den viral beschichteten Brunnen hinzu. Nach der Zentrifugation die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bebrüten.48 Stunden nach der Transduktion die Zellen per Zentrifugation pellet und im FACS-Puffer 1 wieder aufsetzen. Zuerst die Methylcellulose mit Zytokinen für Mäuse bei Raumtemperatur auftauen. Dann aliquot 3 Milliliter Methylcellulose in einem FACS-Rohr.100 Mikroliter der Zellsuspension mit den entsprechenden Inhibitoren zu 3 Millilitermethylcellulose hinzufügen. Dann wirbeln Sie die Federung auf hoch für 10 bis 30 Sekunden. Nachdem die meisten Luftblasen entweichen, verwenden Sie eine 1 Milliliter Spritze, um 1 Milliliter der Medien in drei Replizienplatten zu verzieren.Legen Sie die Teller in eine große Petrischale zusammen mit einer offenen Schale mit sterilem Wasser. Dann bedecken Sie die große Petrischale und bebrüten die Zellen bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie Iodonitrotetrazoliumchlorid Fleck durch Lösen 10 Milligramm des Iodonitrotetrazoliumchlorid in 10 Milliliter Wasser.Filter sterilisieren die Färbelösung mit einer Luer-Sperrspritze, die mit einem 0,2-Mikrometer-Filter ausgestattet ist. In der Gewebekulturhaube fügen Sie 100 Mikroliter der Färbelösung tropfenweise um die KBE-Platte herum. Dann bebrüten die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Zellkultur-Inkubator.Schließlich, nachdem die Kolonien eine dunkel-rot-braune Farbe gedreht haben, verwenden Sie einen weißen Hintergrund in der sterilen Gewebekultur Haube, um Fotos von der gebeizten CFU-Platte zu machen. In diesem Protokoll wurden mehrere unvoreingenommene Genexpressionsanalysen verwendet, um die genetische Komponente zu identifizieren, die die Onkogensucht orchestriert. Um die Rolle von c-Fos und Dusp1 als therapeutisches Ziel bei Leukämie zu validieren, wurde ihre Überexpression mit Zellen bestätigt, die das BCR-ABL1-Onkogen exemitzen.Die Analyse über RT-qPCR und Western Blotting bestätigte, dass beide durch BCR-ABL1 induziert wurden und dass ihre Expression durch den Wachstumsfaktor IL-3 verstärkt wird. YFP plus Exstesszellen wurden über FACS für weitere In-vitro- und In-vivo-Assays sortiert. Die Ergebnisse zeigten, dass das Löschen von c-Fos und Dusp1 allein die KBE-Zahlen hemmte.Zellen, denen sowohl c-Fos als auch Dusp1 fehlten, wurden in ihrer Fähigkeit, Kolonien zu bilden, erheblich beeinträchtigt, und die Imatinib-Behandlung löschte alle KBE aus, was darauf hindeutet, dass der Verlust von c-Fos und Dusp1 synthetisch tödlich für den BCR-ABL1-Ausdruck ist. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet des Krebses den Weg, um die genetischen Netzwerke und Gene zu erforschen, die die Onkogenabhängigkeit antreiben und wie diese Gene ihre besondere Reaktion bei Mausmodellen und menschlichen Patienten beeinflussen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Retroviren und Patientenproben extrem gefährlich sein kann und sichere Laborpraktiken sollten während der Durchführung dieses Verfahrens beobachtet werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Forschung

Krebsforschung

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Bewertung von In-vitro- DNA-Schäden mit Comet-Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Zweidimensionaler Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie Methoden für eine Analyse der menschlichen Hypophyse Adenom Gewebe Proteom

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Bewertung der Rolle der mitochondrialen Funktion in krebsbedingte Fatigue

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Charakterisieren Sie krankheitsbedingte Mutanten der Kinases der RAF-Familie durch die Verwendung einer Reihe praktischer und machbarer Methoden

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Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

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Integration von Bioinformatik-Ansätzen und experimentellen Validierungen, um die Rolle der Notch-Signalisierung bei Eierstockkrebs zu verstehen

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Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

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