Name: methods for evaluating the role of c-fos and dusp1 in oncogene dependence
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Gli autori sono grati a G. Q. Daley per fornire le cellule BaF3 e WEHI e Reya T. per la MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP costruisce. Gli autori sono grati a Carroll M. per la fornitura dei campioni da crisi di scoppio CML. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni a M.A. da NCI (1RO1CA155091), la leucemia Research Foundation e Fondazione V e da NHLBI (R21HL114074-01).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida della cura degli animali istituzionali e uso Committee (IACUC) a di Cincinnati Children Hospital Medical Center (CCHMC). Esemplari umani (BM normale e che da CML (p210-BCR-ABL +) leucemia) sono stati ottenuti attraverso protocolli approvati Institutional Review Board (Institutional Review Board: Hospital Medical Center di Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati Children) e consenso informato donatore da CCHMC e l'Università di Cincinnati.<...

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	<li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247, 824-830 (1990).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).</li><li>Mahon, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuation+of+imatinib+in+patients+with+chronic+myeloid+leukaemia+who+have+maintained+complete+molecular+remission+for+at+least+2+years:+the+prospective,+multicentre+Stop+Imatinib+(STIM)+trial.">Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial.</a> Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).</li><li>O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+limits+of+targeted+therapy+in+chronic+myeloid+leukaemia.">Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).</li><li>Rousselot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+mesylate+discontinuation+in+patients+with+chronic+myelogenous+leukemia+in+complete+molecular+remission+for+more+than+2+years.">Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years.</a> Blood. 109, 58-60 (2007).</li><li>Krause, D. S., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinases+as+targets+for+cancer+therapy.">Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).</li><li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+balance+between+life+and+death:+targeted+cancer+therapy+and+"oncogenic+shock".">Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock".</a> Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).</li><li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+addiction:+setting+the+stage+for+molecularly+targeted+cancer+therapy.">Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy.</a> Genes &amp; Development. 21, 3214-3231 (2007).</li><li>Weinstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer.+Addiction+to+oncogenes--the+Achilles+heal+of+cancer.">Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer.</a> Science. 297, 63-64 (2002).</li><li>Corbin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chronic+myeloid+leukemia+stem+cells+are+insensitive+to+imatinib+despite+inhibition+of+BCR-ABL+activity.">Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li><li>Wilson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+potential+for+growth-factor-driven+resistance+to+anticancer+kinase+inhibitors.">Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors.</a> Nature. 487, 505-509 (2012).</li><li>Kesarwani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+c-FOS+and+DUSP1+abrogates+intrinsic+resistance+to+tyrosine-kinase+inhibitor+therapy+in+BCR-ABL-induced+leukemia.">Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-fos+regulates+neuronal+excitability+and+survival.">c-fos regulates neuronal excitability and survival.</a> Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).</li><li>Dorfman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+erp/mkp-1+gene+does+not+affect+mouse+development:+normal+MAP+kinase+activity+in+ERP/MKP-1-deficient+fibroblasts.">Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts.</a> Oncogene. 13, 925-931 (1996).</li><li>Padhye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocurcumins+as+cyclooxygenase-2+inhibitor:+molecular+docking,+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+in+mice.">Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice.</a> Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).</li><li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages.">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeting+of+quiescent+chronic+myelogenous+leukemia+stem+cells+by+histone+deacetylase+inhibitors+in+combination+with+imatinib+mesylate.">Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate.</a> Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).</li><li>Koschmieder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+chronic+phase+of+myeloid+leukemia+with+expansion+of+hematopoietic+stem+cells+in+a+transgenic+model+of+BCR-ABL+leukemogenesis.">Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis.</a> Blood. 105, 324-334 (2005).</li><li>Abraham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+targeting+of+p53+and+c-MYC+selectively+eliminates+leukaemic+stem+cells.">Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells.</a> Nature. 534, 341-346 (2016).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+p53+by+SIRT1+inhibition+enhances+elimination+of+CML+leukemia+stem+cells+in+combination+with+imatinib.">Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib.</a> Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).</li><li>. 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Per la maggior parte delle cellule tumorali, la risposta terapeutica a TKI è mediata da un blocco di tirosina-chinasi-oncoproteina segnali a cui il tumore è assuefatto. Tuttavia, relativamente poco è conosciuto circa come una minoranza delle cellule tumorali, contribuendo alla MRD escape l'oncogene dipendenza e terapia4. Studi recenti hanno rivelato che la segnalazione di fattore di crescita media farmacoresistenza in leucemia e tumori solidi dell'organo. Ciò suggerisce che vari meccanismi mol...

Attività della chinasi della tirosina costitutiva dell'oncogene di fusione BCR-ABL1 provoca CML, che fornisce una spiegazione razionale per indirizzare l'attività della chinasi di piccole molecole inibitrici. Il successo di TKI nel trattamento di pazienti affetti da LMC ha rivoluzionato il concetto di terapia mirata1,2. Successivamente, la terapia anti-chinasi come medicina di precisione è stata sviluppata per parecchie altre malignità, compreso i tumori solidi. Finora, più di trenta gli inibitori della chinasi sono stati approvati dalla FDA stato Uniti per il trattamento di vari tumori maligni. Mentre TKI trattamento è molto efficace nel sopprimere la malattia, non è curativo. Inoltre, una piccola popolazione di cellule tumorali persiste durante il trattamento: il MRD3,4,5. Anche i pazienti che hanno mostrato la remissione completa sono lasciati con MRD, che alla fine risultati nella ricaduta se non continuamente repressa. Di conseguenza, l'eliminazione delle cellule MRD è necessario per raggiungere una risposta durevole o curativa. CML rappresenta un paradigma prezioso per definire il concetto di medicina di precisione, meccanismi di oncogenesi, la terapeutica razionale destinazione-diretto, progressione di malattia e resistenza ai farmaci. Tuttavia, ancora oggi, il meccanismo di guida morte TKI-indotta delle cellule in cellule di cancro non è pienamente compreso, né perché sono intrinsecamente resistenti a TKI4,6celle MRD (costituite da cellule staminali leucemiche [LSCs]). Tuttavia, il fenomeno della "dipendenza dell'oncogene" chinasi mutante oncoproteina è implicato nell'efficacia TKI dove l'inibizione acuta dell'oncogene mirati da TKI provoca uno shock oncogeno che conduce a una risposta massiccia proapoptotic o quiescenza in cella contesto-dipendente6,7,8,9. Tuttavia, la base meccanicistica della dipendenza dell'oncogene è carente. Studi recenti hanno implicato che fattore di crescita di segnalazione abroga la dipendenza dell'oncogene e di conseguenza conferisce resistenza al TKI terapia10,11,12. Di conseguenza, per comprendere il meccanismo di dipendenza dell'oncogene, abbiamo effettuato delineamento di espressione intero genoma da BCR-ABL1 addicted e cellule nonaddicted (sviluppate con fattori di crescita), che ha rivelato che il c-Fos e Dusp1 sono mediatori critici di oncogene dipendenza13. La delezione genetica di c-Fos e Dusp1 è letale per BCR-ABL1-espressione sintetiche cellule e i topi utilizzati nell'esperimento non hanno sviluppato la leucemia. Inoltre, l'inibizione di c-Fos e DUSP1 di piccole molecole inibitrici curata LMC BCR-ABL1-indotta in topi. I risultati mostrano che i livelli di espressione di c-Fos e Dusp1 definiscono la soglia apoptotica in cellule tumorali, tale che i livelli più bassi conferiscono sensibilità ai farmaci, mentre livelli più elevati causano resistenza alla terapia13.
Per identificare i geni che guida la dipendenza dell'oncogene, abbiamo effettuato diversi esperimenti in presenza di fattore di crescita e un TKI (imatinib) utilizzo del mouse - e cellule di derivazione paziente CML (K562) del profilo di espressione di intero genoma. Questi dati sono stati analizzati in parallelo con CML paziente set di dati ottenuti da CD34+ cellule staminali ematopoietiche prima e dopo il trattamento con imatinib. Questa analisi ha rivelato tre geni (un fattore di trascrizione [c-Fos], specificità dual fosfatasi 1 [Dusp1] e una proteina di legame al RNA [Zfp36]) che comunemente sono sovraregolati in cellule TKI-resistenti. Per convalidare l'importanza di questi geni che conferiscono resistenza ai farmaci, abbiamo effettuato la dettagliata analisi in vitro e in vivo . I livelli di espressione di questi geni sono stati confermati mediante qPCR in tempo reale (RT-qPCR) e western blotting in cellule resistenti alla droga. Ulteriormente, la sovraespressione di cDNA e atterramento di shRNA forcine di c-Fos, Dusp1, e Zfp36 ha rivelato che elevati c-Fos e Dusp1 espressioni sono sufficienti e necessarie per conferire resistenza TKI. Di conseguenza, abbiamo effettuato una convalida in vivo utilizzando modelli murini con c-Fos e Dusp1 solo. Per la validazione genetica di c-Fos e Dusp1, abbiamo creato ROSACreERT-inducible c-Fosfl/fl topi (knockout condizionale)14 e li ha attraversato con Dusp1- / - (dritto knockout)15 per rendere ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1- / - topi transgenici doppio. Cellule derivate da midollo osseo c-Kit+ (da c-Fosfl/fl-, Dusp1- / -- e c-Fosfl/flDusp1- / -) che esprimono BCR-ABL1 sono stati analizzati in vitro in un saggio di formazione di colonie unit (CFU) e in vivo da trapianto di midollo osseo in topi irradiati letalmente, per testare il requisito di c-Fos e Dusp1 da soli o insieme a sviluppo di leucemia. Allo stesso modo, le inibizioni chimiche di c-Fos di DFC (difluorinated curcumina)16 e Dusp1 di BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 sono stati testati in vitro e in vivo usando BCR-ABL1-esprimendo, osso cellule derivate dal midollo c-Kit+ dal mouse wild type (WT). Per confermare la richiesta di c-Fos e Dusp1 in cellule staminali leucemiche, abbiamo utilizzato un modello murino CML dove BCR-ABL1 specificamente è stata indotta in sue cellule staminali di doxiciclina (esprime Tet-transactivator sotto cellule staminali murine leucemia (SCL) gene 3' enhancer regolamento)18,19. Abbiamo usato il midollo osseo Lin–cellule c-Kit di Sca++ (TSS) da questi topi in un'analisi di trapianto in vivo. Inoltre, abbiamo stabilito i livelli di phopsho-p38 e l'espressione di IL-6 come biomarcatori di farmacodinamica per Dusp1 e l'inibizione di c-Fos, rispettivamente, in vivo. Infine, di estendere lo studio per rilevanza umana, CD34 paziente-derivati+ cellule (equivalente alle cellule c-Kit+ da topi) sono stati sottoposti a lungo termine saggi in vitro d'inizio coltura cellulare (LTCIC) e un modello di topo umanizzato in vivo di CML20,21. I topi immunodeficienti sono stati trapiantati con cellule di CML CD34 +, seguite da trattamento farmacologico e l'analisi di sopravvivenza delle cellule leucemiche umane.
In questo progetto, sviluppiamo metodi per l'identificazione del target e convalide utilizzando strumenti sia genetici e chimici, utilizzando diversi modelli preclinici. Questi metodi possono essere applicati con successo per convalidare altri obiettivi lo sviluppo di modalità di chimica per lo sviluppo terapeutico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:948px;" width="946">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:424px;">Biological Materials</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-016-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>3434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>4434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Hydroxytamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DFC</td>
			<td>LKT Laboratories Inc.</td>
			<td>D3420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCI</td>
			<td>Chemzon Scientific</td>
			<td>NZ-06-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imatinib</td>
			<td>LC Laboratory</td>
			<td>I-5508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458-37-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NDGA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>500-38-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penn/Strep</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1XPBS</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-005-CL</td>
			<td style="width:131px;">5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3369</td>
			<td style="width:131px;">5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45uM acro disc filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70um nylon cell stariner</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)</td>
			<td>Simga</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>CO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocullulose Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45R (B220)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>553092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45.1-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0453-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45.2-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0454-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hCD45-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Biotin-FITC</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-857&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-7-4</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>MA5-16539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ter-119</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>558612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD117 APC&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>553356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharm Lyse</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">BD Perm/Wash&#160; (permeabilization and wash solution for phospho flow)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phospho p38</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4511S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">total p38</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse IgG control</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Flour 488 conjugated&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K278001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X HBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K278002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood Capillary Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-260-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood Collection Tube</td>
			<td>Giene Bio-One</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Newborn Calf Serum</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erythropoiein</td>
			<td>Amgen</td>
			<td>5513-267-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human IL-3</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">G-SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GM-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyeloCult (media for LTCIC assay)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mortor pestle</td>
			<td>Coor tek&#160;</td>
			<td>60316 and 60317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflorane (Isothesia TM)</td>
			<td>Butler Schien</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B90920s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td style="width:131px;">100mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto agar (agar)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E-3119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Doxycycline chow</td>
			<td>TestDiet.com</td>
			<td>52662</td>
			<td style="width:131px;">modified RMH1500, Autoclavable 5LK8&#160; with 0.0625% Doxycycline&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodonitrotetrazolium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I10406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dneasy Blood &#38; tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">miRNeasy Mini Kit&#160; (RNA isolation kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)</td>
			<td>Ambion, Life Technologies</td>
			<td>AM1906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD117 MicroBead Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay</td>
			<td>Stemp Cell Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing bucket rotor cetrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TC-10 automated cell counter</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C-1000 Thermal cycler</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mastercycler Real Plex 2</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemavet ( boold counter)</td>
			<td>Drew-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSR II ( FACS analyzer)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fortessa I ( FACS analyzer)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSAriaII ( FACS Sorter)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnet Stand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Irradiator</td>
			<td style="width:247px;">&#160;J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA</td>
			<td>Mark I Model 68A</td>
			<td>source Cs 137</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSACreERT2</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scl-tTA&#160;</td>
			<td>Dr. Claudia Huettner&#8217;s lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BoyJ&#160;</td>
			<td>mouse core facility at CCHMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57Bl/6&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NSGS</td>
			<td>mouse core facility at CCHMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-&#160;</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSACreERT2/c-Fosfl/fl</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">BaF3</td>
			<td style="width:247px;">Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">WEHI</td>
			<td style="width:247px;">Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">CML-CD34+ and Normal CD34+ cells</td>
			<td style="width:247px;">University Hospital, University of Cincinnati</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for evaluating the role of c-fos and dusp1 in oncogene dependence

La dimostrazione di inibitori della tirosina chinasi (TKI) nel trattamento della leucemia mieloide cronica (CML) ha segnato una nuova era nella terapeutica del cancro. Tuttavia, una piccola popolazione di cellule non risponde al trattamento TKI, con conseguente malattia minima residua (MRD); anche il più potente TKI non riescono a sradicare queste cellule. Queste cellule MRD servono come un serbatoio di sviluppare una resistenza alla terapia. Non è noto perché TKI trattamento è inefficace contro le cellule MRD. Segnalazione di fattore di crescita è implicato nel sostenere la sopravvivenza delle cellule MRD durante il trattamento TKI, ma una comprensione meccanicistica è carente. Studi recenti hanno dimostrato che un elevato c-Fos e Dusp1 espressione come risultato di convergenti oncogeno e segnalazione in cellule di MRD di fattore di crescita mediano resistenza TKI. L'inibizione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 rende squisitamente sensibile a TKI CML e cure CML in entrambi i modelli genetici e umanizzato del mouse. Abbiamo identificato questi geni bersaglio usando i microarrays multiple da TKI-sensibile e - cellule resistenti. Qui, mettiamo a disposizione metodi per la convalida di destinazione utilizzando modelli murini in vitro e in vivo. Questi metodi possono essere applicati facilmente a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.

Dipendenza dell'oncogene è stato implicato nell'efficacia terapeutica di TKI. Tuttavia, i meccanismi che guidano la dipendenza dell'oncogene non sono capiti. Abbiamo effettuato l'analisi dell'espressione genica imparziale multipli per identificare la componente genetica coinvolta nell'orchestrare la dipendenza. Queste analisi hanno rivelato il upregulation di tre geni, c-Fos, Dusp1 e Zfp36, in cellule tumorali che non sono dipendenti da oncogeno di segnalazione per la sopravvivenza e, qu...

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Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Metodi per valutare il ruolo di c-Fos e Dusp1 nella dipendenza dell'Oncogene

Qui, descriviamo i protocolli per la validazione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 come un obiettivo della droga nella leucemia utilizzando modelli in vitro e in vivo genetica e umanizzato del topo. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi terapeutici del cancro, come l'identificazione di geni chiave coinvolti nella dipendenza da idrogeno. Il principale vantaggio di questa tecnica è che utilizza la dipendenza da oncogene che è comune a molti tumori guidati dalla chinasi, quindi è applicabile a più tipi di tumore. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla leucemia, può anche essere applicato ad altri sistemi, come tumori solidi come il cancro ai polmoni, tumori cerebrali e tumori pancreatici.Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa della mancanza di esperienza in biologia molecolare e fisiologia cellulare. Per iniziare, raccogli le ossa delle gambe da un topo eutanasiato. Pulire i tessuti dalle ossa con un bisturi.Quindi mettere le ossa in PBS freddo sul ghiaccio e schiacciare le ossa con un pestello. Successivamente, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a celle da 70 micrometri in un tubo del tappo a vite da 50 millilitri con una pipetta da 10 millilitri. Lavare la malta e il pestello più volte con PBS freddo e aggiungere la sospensione cellulare al tubo da 50 millilitri.Successivamente centrifugare il midollo osseo e rimuovere il supernatante con pipetta sottovuoto e vetro. Resuspend il pellet cellulare in 5 millilitri di PBS. Utilizzando una pipetta, aggiungere lentamente il midollo osseo sospeso nella parte superiore del poli-saccarosio a temperatura ambiente.Successivamente, ruotare il poli-saccarosio a 400 G per 20 minuti con il freno spento. Dopo la centrifugazione, raccogli l'interfaccia nuvolosa totale della cella mononucleare con una pipetta e trasferiscila in un nuovo tubo da 15 millilitri. Portare il volume a 10 millilitri con PBS e rimuovere 20 microlitri per il conteggio.Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e posizionare il pellet sul ghiaccio. Successivamente, resuspend il pellet di cellule in PBS con EDTA e BSA. Aggiungere microperline CD117 alla sospensione cellulare e vortice da mescolare.Dopo questo, incubare la sospensione per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Quindi portare il volume fino a 10 millilitri con più PBS con EDTA e BSA e centrifugare a 1200 G a 4 gradi Celsius per 5 minuti. Utilizzare un vuoto per rimuovere il supernatante e sospendere il pellet di cellule in PBS con EDTA e BSA.Quindi aggiungere 3 millilitri di PBS con EDTA e BSA a un supporto magnetico con una colonna magnetica e consentirgli di fluire in un tubo di raccolta. Al termine del buffer che scorre attraverso la colonna, aggiungere la sospensione della cella e consentirgli di fluire attraverso la colonna nel tubo di raccolta. Aggiungere quindi altri 5 millilitri di PBS con EDTA e BSA alla colonna e sciacquarlo immediatamente con lo stantuffo.Rimuovere lo stantuffo e ripetere lo scarico prima di contare le celle. Dopo aver centrifugato le cellule, rimuovere il supernatante e sospendere il pellet di cella in IMDM completo per la coltura. Coltura delle cellule durante la notte a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.In primo luogo, combinare il DNA plasmide retrovirale con il plasmide di imballaggio, il cloruro di calcio e l'acqua in un tubo da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere 500 microlitri di HBS ad un altro tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere la miscela di trasfezione per quanto riguarda la goccia al tubo contenente HBS mescolando contemporaneamente con il vortice impostato sull'impostazione più bassa.Incubare la miscela di trasfezione a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Durante il periodo di incubazione, aggiungere clorochina alle cellule HEK e tenerle nell'incubatrice. Dopo aver aggiunto il mix di trasfezione, incubare le cellule per 8 ore in un incubatore di 37 gradi Celsius 5%CO2 cambiando il supporto cellulare aggiungendo 14 millilitri di supporti DMEM10 freschi molto lentamente.Pipeggiare lentamente contro la parete del piatto aiuta a prevenire qualsiasi stripping delle cellule HEK. Quindi incubare le cellule durante la notte nell'incubatore di CO2 37 gradi Celsius 5%.. Utilizzare una siringa da 10 millilitri per raccogliere il supernatante virale.Quindi attaccare un filtro siringa da 0,45 micrometri alla siringa. Immergete il supernatante virale in un nuovo tubo di raccolta. Raccogli il supernatante virale circa 16 ore dopo.Successivamente, aggiungere due millilitri di frammento di fibronectina umana ricombinante in PBS a piastre di coltura di 6 pozzi non trattate. Il giorno successivo, utilizzare una pipetta per rimuovere la fibronectina dalle piastre. Bloccare le piastre con 2%BSA in PBS e incubare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti.Utilizzare un vuoto per rimuovere BSA e lavare le piastre con PBS prima di rimuoverlo con un vuoto. Successivamente, aggiungere immediatamente il supernatante virale filtrato e centrifugare la piastra per due ore. Utilizzare un vuoto per rimuovere il supernatante e ruotare di nuovo la piastra.Successivamente rimuovere il supernatante con un vuoto e lavare i pozzi rivestiti viralmente con PBS. Rimuovere il PBS con un vuoto, aggiungere il c-Kip precedentemente coltivato più le cellule del mouse ai pozzi rivestiti viralmente. Dopo la centrifugazione, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.48 ore dopo la trasduzione, pelletare le cellule tramite centrifugazione e rimornerne nel tampone FACS 1. Prima scongelare la cellulosa metile con citochine per topi a temperatura ambiente. Quindi aliquota 3 millilitri di cellulosa metile in un tubo FACS.Aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare con gli inibitori appropriati a 3 millilitri di cellulosa metile. Quindi vortice la sospensione in alto per 10-30 secondi. Dopo che la maggior parte delle bolle d'aria fuoriesci, utilizzare una siringa da 1 millilitro per placcare 1 millilitro del supporto in tre piastre replicate.Mettere i piatti in una grande piastra di Petri insieme a una piastra aperta contenente acqua sterile. Quindi coprire la grande piastra di Petri e incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Preparare la macchia di cloruro di iodonitrotetrazolo sciogliendo 10 milligrammi del cloruro di iodonitrotetrazolo in 10 millilitri di acqua.Il filtro sterilizza la soluzione di colorazione con una siringa di blocco Luer dotata di un filtro da 0,2 micrometri. Nella cappa di coltura tissutale, aggiungere 100 microlitri della soluzione di colorazione a goccia intorno alla piastra CFU. Quindi incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura cellulare.Infine, dopo che le colonie hanno trasformato un colore marrone rosso scuro, usa uno sfondo bianco nel cappuccio sterile per la coltura tissutale per scattare foto della piastra CFU macchiata. In questo protocollo, sono state utilizzate molteplici analisi imparziali dell'espressione genica per identificare la componente genetica che orchestra la dipendenza da oncogene. Per convalidare il ruolo di c-Fos e e Dusp1 come bersaglio terapeutico nella leucemia, la loro sovraespressione è stata confermata con cellule che esprimono l'oncogene BCR-ABL1.L'analisi tramite RT-qPCR e western blotting ha confermato che entrambi sono stati indotti da BCR-ABL1 e che la loro espressione è aumentata dal fattore di crescita IL-3. YFP più cellule esprimenti sono state ordinate tramite FACS per ulteriori saggi in vitro e in vivo. I risultati hanno dimostrato che la cancellazione di c-Fos e Dusp1 da sola ha inibito i numeri CFU.Le cellule prive sia di c-Fos che di Dusp1 sono state significativamente compromesse nella loro capacità di formare colonie e il trattamento con Imatinib ha spazzato via tutti i CFC indicando che la perdita di c-Fos e Dusp1 è sinteticamente letale per l'espressione BCR-ABL1. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo del cancro per esplorare le reti genetiche e i geni che guidano la dipendenza da idrogeno e come questi geni influenzano la loro particolare risposta nei modelli di topo e nei pazienti umani. Non dimenticare che lavorare con retrovirus e campioni di pazienti può essere estremamente pericoloso e le pratiche di laboratorio sicure dovrebbero essere osservate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Cancer Research

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