Name: methods for evaluating the role of c-fos and dusp1 in oncogene dependence
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence at JoVE.com

저자 BaF3 및 WEHI 세포를 제공 하기 위한 G. Q. 데일리 감사 이며 T. Reya MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP에 대 한 구성. 저자는 M. 캐롤 감사 CML 폭발 위기에서 환자 샘플을 제공 합니다. 이 연구 NCI (1RO1CA155091), 백혈병 연구 재단 및 V 재단, 그리고 NHLBI (R21HL114074-01)에서 석사를 교부 금에 의해 지원 되었다.

모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 신시내티 아동 병원 의료 센터 (CCHMC)의 지침에 따라 실시 했다. 인간의 표본 (일반 BM 그리고 CML에서 (p210-BCR-ABL +) 백혈병) 기관 검토 위원회 승인 프로토콜을 통해 얻은 했다 (기관 검토 위원회: Federalwide 보증 #00002988 신시내티 아동 병원 의료 센터) 및 CCHMC, 신시내티 대학에서 기부자 정보 동의.
1. 실시간 정량 분석
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<ol>
	<li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247, 824-830 (1990).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).</li><li>Mahon, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuation+of+imatinib+in+patients+with+chronic+myeloid+leukaemia+who+have+maintained+complete+molecular+remission+for+at+least+2+years:+the+prospective,+multicentre+Stop+Imatinib+(STIM)+trial.">Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial.</a> Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).</li><li>O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+limits+of+targeted+therapy+in+chronic+myeloid+leukaemia.">Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).</li><li>Rousselot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+mesylate+discontinuation+in+patients+with+chronic+myelogenous+leukemia+in+complete+molecular+remission+for+more+than+2+years.">Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years.</a> Blood. 109, 58-60 (2007).</li><li>Krause, D. S., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinases+as+targets+for+cancer+therapy.">Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).</li><li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+balance+between+life+and+death:+targeted+cancer+therapy+and+"oncogenic+shock".">Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock".</a> Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).</li><li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+addiction:+setting+the+stage+for+molecularly+targeted+cancer+therapy.">Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy.</a> Genes &amp; Development. 21, 3214-3231 (2007).</li><li>Weinstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer.+Addiction+to+oncogenes--the+Achilles+heal+of+cancer.">Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer.</a> Science. 297, 63-64 (2002).</li><li>Corbin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chronic+myeloid+leukemia+stem+cells+are+insensitive+to+imatinib+despite+inhibition+of+BCR-ABL+activity.">Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li><li>Wilson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+potential+for+growth-factor-driven+resistance+to+anticancer+kinase+inhibitors.">Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors.</a> Nature. 487, 505-509 (2012).</li><li>Kesarwani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+c-FOS+and+DUSP1+abrogates+intrinsic+resistance+to+tyrosine-kinase+inhibitor+therapy+in+BCR-ABL-induced+leukemia.">Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-fos+regulates+neuronal+excitability+and+survival.">c-fos regulates neuronal excitability and survival.</a> Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).</li><li>Dorfman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+erp/mkp-1+gene+does+not+affect+mouse+development:+normal+MAP+kinase+activity+in+ERP/MKP-1-deficient+fibroblasts.">Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts.</a> Oncogene. 13, 925-931 (1996).</li><li>Padhye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocurcumins+as+cyclooxygenase-2+inhibitor:+molecular+docking,+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+in+mice.">Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice.</a> Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).</li><li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages.">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeting+of+quiescent+chronic+myelogenous+leukemia+stem+cells+by+histone+deacetylase+inhibitors+in+combination+with+imatinib+mesylate.">Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate.</a> Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).</li><li>Koschmieder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+chronic+phase+of+myeloid+leukemia+with+expansion+of+hematopoietic+stem+cells+in+a+transgenic+model+of+BCR-ABL+leukemogenesis.">Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis.</a> Blood. 105, 324-334 (2005).</li><li>Abraham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+targeting+of+p53+and+c-MYC+selectively+eliminates+leukaemic+stem+cells.">Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells.</a> Nature. 534, 341-346 (2016).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+p53+by+SIRT1+inhibition+enhances+elimination+of+CML+leukemia+stem+cells+in+combination+with+imatinib.">Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib.</a> Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).</li><li>. Qiagen-miRNAeasy kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources">https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources</a> (2018)</li><li>. DNA-free DNA removal kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&amp;s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&amp;ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&amp;s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&amp;ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s</a> (2018)</li><li>. SuperScript&#8482; III First-Strand Synthesis System Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051</a> (2018)</li><li>. 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암 세포의 대량에 대 한 치료 응답 TKI은 티로신 키 니 아 제 oncoprotein 신호는 종양은 중독의 봉쇄에 의해 중재 됩니다. 그러나, 상대적으로 작은 MRD에 기여 하는 암 세포의 소수 oncogene 의존과 치료4를 탈출 하는 방법에 대 한 알려져 있다. 최근 연구는 백혈병에 단단한 기관 종양 약물 저항을 중재 성장 인자 신호 밝혀. 이 다양 한 분자 메커니즘 본질적인 저항10<su...

BCR-ABL1 퓨전 oncogene의 제정 티로신 키 니 아 제 활동 하면 CML, 작은 분자 억제제 여 키 니 아 제 활동에 근거를 제공 한다. CML 환자 치료에 TKIs의 성공 타겟된 치료1,2의 개념을 혁명. 그 후, 안티 니 정밀 의학으로 치료는 단단한 종양을 포함 한 다른 여러 악성 종양에 대 한 개발 되었다. 지금까지, 30 개 이상의 kinase 억제제는 다양 한 악성 종양 치료를 위한 미국 국가 FDA에 의해 승인 되었습니다. TKI 치료 질병 억제에 매우 효과적 이다, 그러나 그것은 치료입니다. 게다가, 암 세포의 작은 인구는 치료 기간 동안 지속: MRD3,,45. 완전 한 사 함을 보여도 환자가 결국 결과에 재발 하지 않을 경우 지속적으로 억제 MRD 남아 있습니다. 그러므로, MRD 세포의 박멸 내구성 또는 치료 응답을 달성 하기 위해 필요 합니다. CML은 발암, 합리적인 대상 감독 치료제, 질병의 진행, 그리고 약물 저항 메커니즘, 정밀 의학의 개념을 정의 하기 위한 귀중 한 패러다임을 나타냅니다. 그러나, 오늘날에 암 세포에 TKI 유도 된 세포 죽음을 운전 하는 메커니즘은 완전히 이해 되지 않습니다,도 왜 MRD 세포 (leukemic 줄기 세포 [LSCs]의 구성)은 본질적으로 TKIs4,6. 그럼에도 불구 하 고, 돌연변이 니 oncoprotein 하 "oncogene 의존"의 현상 TKIs에 의해 타겟된 oncogene의 심각한 저해 대규모 proapoptotic 응답 또는 셀에 정지에 이르게 하는 종양 충격을 발생 하는 TKI 효능에 연루는 맞는 방식으로6,7,,89. 그러나, oncogene 의존의 기계적 underpinning 부족 이다. 최근 연구는 주석은 oncogene 의존 성장 인자 신호 및 따라서 TKI 치료10,,1112에 저항을 수 여 연루 있다. 따라서, oncogene 의존의 메커니즘에 대 한 통찰력을 얻기 위해 우리가 수행 전체-게놈 식 중독 BCR-ABL1 및 nonaddicted 세포 성장 인자 (성장), c-Fos와 Dusp1의 중요 한 중개자는 밝혔다에서 프로 파일링 oncogene 중독13. C-Fos와 Dusp1의 유전 삭제 합성 BCR ABL1 표현 하는 치명적인 셀 이며 실험에 사용 하는 생쥐 백혈병을 개발 하지 않았다. 또한, 작은 분자 억제제에 의해 c-Fos와 DUSP1의 억제 생쥐에서 BCR ABL1 유도 CML 치료. 결과 높은 수준의 치료13저항을 야기 하는 동안 낮은 수준의 마약 감도 부여 c Fos와 Dusp1의 식 수준 암 세포, apoptotic 임계값 정의 보여 줍니다.
Oncogene 의존을 운전 하는 유전자를 식별 하기 위해 우리는 마우스-그리고 CML 환자 파생 셀 (K562)를 사용 하 여 성장 인자와 TKI (imatinib)의 실험을 프로 파일링 하는 여러 전체 게놈 식 수행. 이러한 데이터는 CD34에서 얻은 CML 환자 데이터 세트와 병렬로 분석 되었다+ 조 혈 줄기 세포 imatinib 치료 전후. 이 분석 공개 3 개의 유전자 (전사 요소 [c-Fos], 이중 특이성 인산 가수분해 효소 1 [Dusp1], 그리고 RNA 의무적인 단백질 [Zfp36])는 일반적으로 upregulated TKI 내성 세포에서. 약물 저항을 부여에 있는이 유전자의 중요성을 확인 하기 위해 우리는 단계별 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실시. 이 유전자의 표현 수준 실시간 정량 (RT-정량)와 서 부 럽 약물 내성 세포에 의해 확인 되었다. 또한, cDNA overexpression 및 c-Fos, Dusp1의 shRNA 헤어핀으로 최저 그리고 Zfp36 높은 c-Fos와 Dusp1 식은 충분 하 고 TKI 저항을 부여 하는 데 필요한. 따라서, 우리는 c-Fos와 Dusp1 모델 마우스를 사용 하 여 생체 조건 유효성 검사를 수행. C-Fos와 Dusp1의 유전 유효성 검사에 대 한 우리 ROSACreERT를 유도할 수 있는 c-Fosfl/플로리다 쥐 (조건부 녹아웃)14 만들어지고 Dusp1-/- (똑 바른 녹아웃)15 ROSACreERT2-c-Fosfl/플로리다 수 있도록 그들을 넘어 Dusp1/- 이중 유전자 변형 쥐. 골 수 파생 된 c-키트+ 세포 (c Fos에서fl/플로리다-, Dusp1-/--, c-Fosfl/플로리다Dusp1-/-) BCR ABL1 표현 했다 분석 생체 외에서 에 콜로 니 형성 단위 (CFU) 분석 결과, vivo 백혈병 개발에 혼자 또는 함께 c-Fos와 Dusp1의 요구를 테스트 하려면 치명적 방사능된 쥐에서 골 수 이식에 의해. 마찬가지로, DFC (difluorinated curcumin)16 c-Fos와 BCI에 의해 Dusp1의 화학 임무 (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 시험 되었다 생체 외에서 그리고 vivo BCR-ABL1-표현, 뼈를 사용 하 여에서 야생-타입 (WT) 마우스에서 골 수 유래 c-키트+ 세포. 우리 어디 BCR ABL1 특히 유도 되었다 그것의 줄기 세포에 doxycycline (Tet transactivator 표현 murine 줄기 세포 백혈병 (SCL) 유전자 3' 증강에 의해 CML 마우스 모델을 활용 하는 leukemic 줄기 세포에서 c-Fos와 Dusp1의 요구를 확인 하려면 레 귤 레이 션)18,19. 우리 골 린-사용 Sca+c-키트+ (LSK) 세포 vivo에서 이식 분석 결과에서 이러한 쥐에서. 또한, 우리는 설립 phopsho-p38 수준 및 Dusp1 및 c-Fos 저해 수립이 동적 생체로 일리노이-6의 식 각각, vivo에서. 마지막으로, 인간의 관련성, CD34 환자 파생에 대 한 연구를 확장+ 세포 (마우스에서 c-키트+ 세포에 해당) 복종된 장기 생체 외에서 문화 시작 셀 분석 실험 (LTCIC)를 했다 vivo에서 인간 답게 마우스 모델의 CML20,21. Immunodeficient 마우스 CML CD34 + 세포, 약물 치료 및 인간 leukemic 세포 생존의 분석으로 이식 했다.
이 프로젝트에서 우리는 다른 전 임상 모델을 사용 하 여 대상 식별 및 유전과 화학 도구를 사용 하 여 유효성 검사에 대 한 방법을 개발 한다. 이러한 메서드는 치료 개발에 대 한 화학 modalities를 개발 하는 다른 대상 유효성을 성공적으로 적용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:948px;" width="946">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:424px;">Biological Materials</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-016-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>3434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>4434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Hydroxytamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DFC</td>
			<td>LKT Laboratories Inc.</td>
			<td>D3420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCI</td>
			<td>Chemzon Scientific</td>
			<td>NZ-06-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imatinib</td>
			<td>LC Laboratory</td>
			<td>I-5508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458-37-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NDGA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>500-38-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penn/Strep</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1XPBS</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-005-CL</td>
			<td style="width:131px;">5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3369</td>
			<td style="width:131px;">5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45uM acro disc filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70um nylon cell stariner</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)</td>
			<td>Simga</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>CO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocullulose Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45R (B220)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>553092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45.1-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0453-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45.2-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0454-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hCD45-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Biotin-FITC</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-857&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-7-4</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>MA5-16539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ter-119</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>558612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD117 APC&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>553356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharm Lyse</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">BD Perm/Wash&#160; (permeabilization and wash solution for phospho flow)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phospho p38</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4511S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">total p38</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse IgG control</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Flour 488 conjugated&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K278001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X HBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K278002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood Capillary Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-260-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood Collection Tube</td>
			<td>Giene Bio-One</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Newborn Calf Serum</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erythropoiein</td>
			<td>Amgen</td>
			<td>5513-267-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human IL-3</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">G-SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GM-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyeloCult (media for LTCIC assay)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mortor pestle</td>
			<td>Coor tek&#160;</td>
			<td>60316 and 60317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflorane (Isothesia TM)</td>
			<td>Butler Schien</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B90920s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td style="width:131px;">100mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto agar (agar)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E-3119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Doxycycline chow</td>
			<td>TestDiet.com</td>
			<td>52662</td>
			<td style="width:131px;">modified RMH1500, Autoclavable 5LK8&#160; with 0.0625% Doxycycline&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodonitrotetrazolium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I10406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dneasy Blood &#38; tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">miRNeasy Mini Kit&#160; (RNA isolation kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)</td>
			<td>Ambion, Life Technologies</td>
			<td>AM1906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD117 MicroBead Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay</td>
			<td>Stemp Cell Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing bucket rotor cetrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TC-10 automated cell counter</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C-1000 Thermal cycler</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mastercycler Real Plex 2</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemavet ( boold counter)</td>
			<td>Drew-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSR II ( FACS analyzer)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fortessa I ( FACS analyzer)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSAriaII ( FACS Sorter)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnet Stand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Irradiator</td>
			<td style="width:247px;">&#160;J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA</td>
			<td>Mark I Model 68A</td>
			<td>source Cs 137</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSACreERT2</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scl-tTA&#160;</td>
			<td>Dr. Claudia Huettner&#8217;s lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BoyJ&#160;</td>
			<td>mouse core facility at CCHMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57Bl/6&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NSGS</td>
			<td>mouse core facility at CCHMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-&#160;</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSACreERT2/c-Fosfl/fl</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">BaF3</td>
			<td style="width:247px;">Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">WEHI</td>
			<td style="width:247px;">Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">CML-CD34+ and Normal CD34+ cells</td>
			<td style="width:247px;">University Hospital, University of Cincinnati</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for evaluating the role of c-fos and dusp1 in oncogene dependence

만성 골수성 백혈병 (CML) 치료에 tyrosine kinase 억제제 (TKIs)의 데모는 암 치료에 새로운 시대를 예 고 했다. 그러나, 세포의 작은 인구에 반응 하지 않는 TKI 치료 결과 최소 잔여 질병 (MRD); 이 세포를 근절 하기 위해 심지어는 가장 강력한 TKIs 실패. 이러한 MRD 세포 치료에 저항을 개발 하는 저수지 역할을 합니다. 왜 TKI 치료 MRD 셀에 대 한 효과 알 수 없습니다. TKI 치료 동안 MRD 세포의 생존을 지 원하는에 연루는 성장 인자 신호 하지만 기계적 이해 부족. 최근 연구는 높은 c-Fos와 Dusp1 집중 결과로 종양 표현과 MRD 셀에 신호 하는 성장 인자 중재 TKI 저항을 설명 했다. C-Fos와 Dusp1의 유전과 화학 억제 CML를 TKIs에 절 묘하게 과민 한 렌더링 하 고 두 유전자 및 인간 답게 된 마우스 모델에 CML을 치료. 우리는 TKI-민감하고-내성 세포에서 여러 microarrays를 사용 하 여이 대상 유전자 발견. 여기, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 마우스 모델을 사용 하 여 대상 유효성 검사 메서드를 제공 합니다. 이러한 메서드는 쉽게 유전자 유효성 검사 및 치료 개발에 대 한 모든 대상에 적용할 수 있습니다.

Oncogene 중독 TKIs의 치료 효능에 연루 되었습니다. 그러나, oncogene 의존 운전 메커니즘 이해 되지 않는다. 우리는 중독을 계획에 관련 된 유전자 구성 요소를 식별 하기 위해 여러 편견된 유전자 식 분석을 수행. 이러한 분석 3 유전자, c Fos, Dusp1, 및 Zfp36, 암 세포는 생존을 위한 종양 신호에 의존 하 고, 따라서, TKI 치료를 구분 하지 않습니다의 upregulation를 공개 했다. ShRNA 중재 ...

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Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Oncogene 의존에 c Fos의 역할 및 Dusp1를 평가 하기 위한 방법

여기, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 유전자 및 인간 답게 된 마우스 모델을 사용 하 여 백혈병에서 마약 대상으로 c Fos와 Dusp1의 유전과 화학 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 유전 유효성 검사 및 치료 개발에 대 한 모든 대상에 적용할 수 있습니다.

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

이 방법은 종양 유전자 의존에 관련시킨 중요한 유전자의 확인과 같은 암 치료 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 키나아제 구동 암에 공통되는 온코진 의존성을 활용하므로 다중 종양 유형에 적용가능하다는 것입니다. 이 방법은 백혈병에 대한 통찰력을 제공할 수 있더라도 폐암, 뇌종양 및 췌장 종양과 같은 고형 종양과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.일반적으로, 이 방법에 새로운 개인 분자 생물학 및 세포 생리학에 경험의 부족으로 인해 투쟁 할 것 이다. 시작하려면 안락사 된 마우스에서 다리 뼈를 수확하십시오. 메스로 뼈에서 조직을 청소합니다.그런 다음 차가운 PBS에 뼈를 얼음위에 놓고 뼈를 봉금으로 부수습니다. 그 후, 70 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 셀 서스펜션을 10밀리리터 파이펫이 있는 50밀리리터 스크류 캡 튜브로 필터링합니다. 차가운 PBS로 박격포를 여러 번 씻고 셀 서스펜션을 50 밀리리터 튜브에 추가하십시오.다음 원심 분리골골은 골수를 제거하고 진공 및 유리 파이펫으로 상체를 제거합니다. PBS의 5 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 파이펫을 사용하여 실온 폴리 자당의 상단에 매달린 골수를 천천히 추가합니다.그 후, 브레이크가 꺼져 20분 동안 400 Gs에서 폴리 자당을 회전시다. 원심분리 후 파이펫으로 흐린 총 모노 핵 세포 인터페이스를 수집하고 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮긴다. PBS로 10 밀리리터에 볼륨을 가져와 계산할 수 있는 마이크로리터 20기를 제거합니다.원심 분리 후, 상체를 버리고 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, EDTA 및 BSA를 가진 PBS에 있는 세포 펠릿을 재중단합니다. CD117 마이크로비드를 세포 현탁액에 넣고 소용돌이를 혼합합니다.그 후, 섭씨 4도에서 10분 동안 서스펜션을 배양합니다. 그런 다음 EDTA및 BSA와 원심분리기가 1200G에서 5분 동안 섭씨 4도에 더 많은 PBS를 사용하여 최대 10 밀리리터의 볼륨을 가져옵니다. 진공을 사용하여 상체를 제거하고 EDTA 및 BSA로 PBS에서 세포 펠릿을 중단하십시오.그런 다음 EDTA 및 BSA를 사용하여 PBS 3 밀리리터를 자석 기둥이 있는 자석 스탠드에 추가하고 수집 튜브로 흐르도록 합니다. 버퍼가 컬럼을 통해 흐르면 셀 서스펜션을 추가하고 컬럼을 통해 수집 튜브로 흐르도록 합니다. 다음으로 EDTA와 BSA를 사용하여 PBS의 밀리리터 를 추가하여 플런저로 즉시 플러시합니다.플런저를 제거하고 셀을 계산하기 전에 플러시를 반복합니다. 세포를 원심분리한 후, 상체를 제거하고 배양을 위해 완전한 IMDM에서 세포 펠릿을 중단한다. 이산화탄소5%로 밤새 세포를 섭씨 37도에서 배양합니다.먼저, 레트로바이러스 플라스미드 DNA를 포장 플라스미드, 염화칼슘 및 물을 1.5 밀리리터 튜브에 결합합니다. 그런 다음 다른 1.5 밀리리터 튜브에 HBS 의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 동시에 가장 낮은 설정으로 설정 된 소용돌이와 혼합하면서 HBS를 포함하는 튜브에 경피 혼합물 드롭 와이즈를 추가합니다.실온에서 20~30분 동안 배양혼합물을 배양한다. 잠복기 동안, HEK 세포에 클로로퀸을 추가하고 인큐베이터에 보관하십시오. 트랜스페션 믹스를 추가한 후, 신선한 DMEM10 미디어의 14밀리리터를 매우 느리게 추가하여 세포 매체를 변화시키는 섭씨 5%CO2 인큐베이터에서 8시간 동안 세포를 배양한다.접시의 벽에 천천히 파이펫팅HEK 세포의 스트리핑을 방지하는 데 도움이됩니다. 그런 다음 37섭씨 5%CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 10 밀리리터 주사기를 사용하여 바이러스 성 상체를 수집하십시오.그런 다음 주사기에 0.45 마이크로미터 주사기 필터를 부착합니다. 새로운 컬렉션 튜브에 바이러스 성 상체를 플런지. 약 16시간 후에 바이러스 성 상체를 수집하십시오.그 후, PBS에 재조합 인간 섬유네틴 조각의 2밀리리터를 추가하여 6개의 잘 배양 플레이트에 첨가한다. 다음 날 파이펫을 사용하여 플레이트에서 섬유네틴을 제거합니다. PBS에서 2%BSA로 플레이트를 차단하고 실온에서 플레이트를 30분 동안 배양합니다.진공을 사용하여 BSA를 제거하고 진공으로 제거하기 전에 PBS로 플레이트를 세척하십시오. 그 후 즉시 여과된 바이러스 성 상신체를 추가하고 플레이트를 2시간 동안 원심분리기를 추가합니다. 진공을 사용하여 상체를 제거하고 플레이트를 다시 회전시십시오.다음으로 진공으로 상체를 제거하고 PBS로 바이러스 코팅 된 우물을 씻으신다. 진공상태에서 PBS를 제거하고 이전에 배양된 c-Kip 플러스 마우스 세포를 바이러스 코팅 된 우물에 추가하십시오. 원심분리 후 세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.48 변환 후 시간, 원심 분리를 통해 세포를 펠릿과 FACS 버퍼 1에서 다시 중단. 먼저 실온에서 마우스를위한 사이토카인으로 메틸 셀룰로오스를 해동하십시오. 그런 다음 FACS 튜브에서 메틸 셀룰로오스의 3 밀리리터를 알리쿼트합니다.메틸 셀룰로오스의 3 밀리리터에 적절한 억제제와 함께 세포 현탁액의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 서스펜션을 10~30초 동안 높게 소용돌이시다. 대부분의 기포가 탈출한 후 1 밀리리터 주사기를 사용하여 3개의 복제 플레이트에 1 밀리리터의 미디어 플레이트를 플레이트에 놓습니다.접시를 큰 페트리 접시에 놓고 멸균물이 들어있는 열린 접시 하나를 놓습니다. 그런 다음 큰 페트리 접시를 덮고 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 10 밀리리터의 물에 10 밀리그램의 요오도니트로테라졸륨염화물을 용해하여 요오도니트로테라졸륨 염화염을 준비하십시오.필터는 0.2 마이크로미터 필터가 장착된 Luer 잠금 주사기를 장착하여 염색 용액을 살균합니다. 조직 배양 후드에서, CFU 플레이트 주위에 염색 용액의 100 마이크로 리터를 드롭 현명한 추가합니다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양합니다.마지막으로, 식민지가 어두운 붉은 갈색으로 변한 후 멸균 조직 배양 후드에 흰색 배경을 사용하여 염색 된 CFU 플레이트의 사진을 찍습니다. 이 프로토콜에서, 다중 편견 유전자 발현 분석은 종양유전자 중독을 오케스트레이션하는 유전 성분을 확인하기 위하여 이용되었습니다. 백혈병에서 치료 대상으로 c-Fos 및 Dusp1의 역할을 검증하기 위해, 그들의 과발현은 BCR-ABL1 종양 유전자를 발현하는 세포로 확인되었다.RT-qPCR 및 서부 블로팅을 통한 분석은 둘 다 BCR-ABL1에 의해 유도되었고 그들의 발현이 성장 인자 IL-3에 의해 증강된다는 것을 확인했습니다. YFP 플러스 발현 세포는 추가 시험관 내 및 생체 내 에세이를 위해 FACS를 통해 분류되었습니다. 결과는 c-Fos와 Dusp1의 삭제가 CFU 숫자를 억제한다는 것을 보여주었습니다.c-Fos와 Dusp1이 모두 결여된 세포는 c-Fos와 Dusp1의 손실이 BCR-ABL1 발현에 합성적으로 치명적임을 나타내는 모든 CfU를 전멸시키는 식민지및 이마티닙 치료를 형성하는 능력에서 현저히 손상되었습니다. 이 발달 후에, 이 기술은 암의 필드에 있는 연구원이 종양유전자 의존을 몰고 유전 네트워크 및 유전자를 탐구하고 이 유전자가 마우스 모형 및 인간 적인 환자에 있는 그들의 특정 반응에 어떻게 영향을 미치는지를 탐구하는 길을 포장했습니다. 레트로바이러스 및 환자 샘플로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 안전한 실험실 관행을 준수해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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