Name: methods for evaluating the role of c-fos and dusp1 in oncogene dependence
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence at JoVE.com

Yazarlar BaF3 ve WEHI hücreleri sağlamak için G. s. Daley için müteşekkiriz ve T. Reya MSCV-BCR-ABL-IRES-YFP için oluşturur. Yazarlar için-mek şartıyla CML patlama krizden hasta numuneleri M. Carroll için müteşekkiriz. Bu çalışmada ncı (1RO1CA155091), lösemi Araştırma Vakfı ve V Vakfı ve NHLBI (R21HL114074-01) dan M.A. için hibe tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi (CCHMC) esaslarına göre yapılmıştır. İnsan örnekler (Normal BM ve CML bundan (p210-BCR-ABL +) Lösemi) Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından onaylanan iletişim kuralları üzerinden alınan (Kurumsal değerlendirme Komitesi: Federalwide güvence #00002988 Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi) ve CCHMC ve Cincinnati Üniversitesi izin donör bilgili.
1. gerçek ...

<ol>
	<li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr/abl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome.">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247, 824-830 (1990).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).</li><li>Mahon, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discontinuation+of+imatinib+in+patients+with+chronic+myeloid+leukaemia+who+have+maintained+complete+molecular+remission+for+at+least+2+years:+the+prospective,+multicentre+Stop+Imatinib+(STIM)+trial.">Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial.</a> Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).</li><li>O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+limits+of+targeted+therapy+in+chronic+myeloid+leukaemia.">Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).</li><li>Rousselot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imatinib+mesylate+discontinuation+in+patients+with+chronic+myelogenous+leukemia+in+complete+molecular+remission+for+more+than+2+years.">Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years.</a> Blood. 109, 58-60 (2007).</li><li>Krause, D. S., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+kinases+as+targets+for+cancer+therapy.">Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).</li><li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+balance+between+life+and+death:+targeted+cancer+therapy+and+"oncogenic+shock".">Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock".</a> Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).</li><li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+addiction:+setting+the+stage+for+molecularly+targeted+cancer+therapy.">Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy.</a> Genes &amp; Development. 21, 3214-3231 (2007).</li><li>Weinstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer.+Addiction+to+oncogenes--the+Achilles+heal+of+cancer.">Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer.</a> Science. 297, 63-64 (2002).</li><li>Corbin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chronic+myeloid+leukemia+stem+cells+are+insensitive+to+imatinib+despite+inhibition+of+BCR-ABL+activity.">Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li><li>Wilson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+potential+for+growth-factor-driven+resistance+to+anticancer+kinase+inhibitors.">Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors.</a> Nature. 487, 505-509 (2012).</li><li>Kesarwani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+c-FOS+and+DUSP1+abrogates+intrinsic+resistance+to+tyrosine-kinase+inhibitor+therapy+in+BCR-ABL-induced+leukemia.">Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-fos+regulates+neuronal+excitability+and+survival.">c-fos regulates neuronal excitability and survival.</a> Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).</li><li>Dorfman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+erp/mkp-1+gene+does+not+affect+mouse+development:+normal+MAP+kinase+activity+in+ERP/MKP-1-deficient+fibroblasts.">Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts.</a> Oncogene. 13, 925-931 (1996).</li><li>Padhye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorocurcumins+as+cyclooxygenase-2+inhibitor:+molecular+docking,+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+in+mice.">Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice.</a> Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).</li><li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages.">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeting+of+quiescent+chronic+myelogenous+leukemia+stem+cells+by+histone+deacetylase+inhibitors+in+combination+with+imatinib+mesylate.">Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate.</a> Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).</li><li>Koschmieder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+chronic+phase+of+myeloid+leukemia+with+expansion+of+hematopoietic+stem+cells+in+a+transgenic+model+of+BCR-ABL+leukemogenesis.">Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis.</a> Blood. 105, 324-334 (2005).</li><li>Abraham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+targeting+of+p53+and+c-MYC+selectively+eliminates+leukaemic+stem+cells.">Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells.</a> Nature. 534, 341-346 (2016).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+p53+by+SIRT1+inhibition+enhances+elimination+of+CML+leukemia+stem+cells+in+combination+with+imatinib.">Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib.</a> Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).</li><li>. Qiagen-miRNAeasy kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources">https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources</a> (2018)</li><li>. DNA-free DNA removal kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&amp;s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&amp;ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&amp;s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&amp;ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s</a> (2018)</li><li>. SuperScript&#8482; III First-Strand Synthesis System Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051</a> (2018)</li><li>. Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html">https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html</a> (2018)</li><li>Abarrategi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+human+bone+marrow+niche+in+mice:+From+host+bone+marrow+engraftment+to+bioengineering+approaches.">Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches.</a> Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).</li><li>Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+screening+and+validation+of+resistant+mutations+against+kinase+inhibitors.">A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li></ol>

Kanser hücreleri toplu için TKI tedavi yanıtı Tirozin kinaz oncoprotein sinyalleri tümör bağımlısı olduğu bir abluka tarafından aracılık ettiği. Ancak, nispeten az hakkında nasıl bir azınlık MRD için katkıda bulunan kanser hücrelerinin kaçış onkogen bağımlılığı ve tedavisi4bilinir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda büyüme faktörü sinyal ilaç direnci lösemi ve solid organ tümörler aracılık eder saptandı. Bu çeşitli moleküler mekanizmaları iç diren...

Kurucu Tirozin kinaz aktivitesinin BCR-ABL1 füzyon onkogen kinaz aktivitesi küçük molekül inhibitörleri tarafından hedeflemek için bir gerekçe sağlar CML neden olur. CML hastaların tedavisinde TKIs başarısı hedefe yönelik tedavi1,2kavramı devrim. Daha sonra anti-kinaz terapisi hassas ilaç olarak solid tümör dahil olmak üzere birçok diğer maligniteler için geliştirilmiştir. Şimdiye kadar otuzdan fazla kinaz inhibitörleri çeşitli maligniteler tedavisi için United State FDA tarafından onaylanmıştır. TKI tedavi hastalık bastırmak çok etkili olmakla birlikte, iyileştirici değil. Ayrıca, tedavi sırasında kanser hücrelerinin küçük bir nüfus devam ederse: MRD3,4,5. Tam iyileşme gösterdi bile hasta sonunda sonuçları nüks içinde değilse sürekli bastırılmış MRD ile bırakılır. Bu nedenle, MRD hücreleri eradikasyonu dayanıklı veya tedavi edici bir yanıt elde etmek için gereklidir. CML tanımlama hassas tıp kavramı, oncogenesis, rasyonel hedef yönelik tedavi, hastalık ilerleme ve ilaç direnci mekanizmaları için değerli bir paradigma temsil eder. Ancak, bugün bile, TKI indüklenen hücre ölümü kanser hücrelerinde sürüş mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır, ne de neden MRD hücreleri (lösemik kök hücrelerinin [LSCs] oluşan) TKIs4,-6özünde dayanıklı. Yine de, mutant kinaz oncoprotein için "onkogen bağımlılık" olgusu içinde nereye TKIs tarafından hedeflenen onkogen akut inhibisyonu bir büyük proapoptotic yanıt ya da sendika hücredeki yol açan bir oncogenic şok neden TKI etkinliği karıştığı içerik bağımlı bir şekilde6,7,8,9. Ancak, mekanik destek onkogen bağımlılığı eksik. Son yıllarda yapılan çalışmalarda büyüme faktörü sinyal onkogen bağımlılığı abrogates ve sonuç olarak direnç TKI terapi10,11,12confers karıştığı. Bu nedenle, onkogen bağımlılığı mekanizmasının bir anlayış kazanmak için biz bütün-genom ifade BCR-ABL1 bağımlısı ve nonaddicted hücreleri (büyüme faktörleri ile büyüdü), c-Fos ve Dusp1, kritik arabulucu olduğunu ortaya profil oluşturma gerçekleştirilen onkogen bağımlılığı13. C-Fos ve Dusp1 genetik silinmesi sentetik BCR-ABL1 ifade etmek için öldürücü hücreler ve deneyde kullanılan farelerde lösemi geliştirmek değil. Ayrıca, c-Fos ve DUSP1 inhibisyonu küçük molekül inhibitörleri tarafından BCR ABL1 indüklenen CML farelerde tedavi. Öyle ki daha yüksek düzeyleri terapi13direnç neden iken alt düzey ilaç duyarlılığı görüşmek ifade düzey c-Fos ve Dusp1 kanser hücrelerinde apoptotik eşik tanımlamak sonuçlar gösterir.
Onkogen bağımlılığı sürüş genlerin tanımlamak için hem fare - ve CML hasta kaynaklı hücreler (K562) kullanarak deneyler büyüme faktörü ve TKI (imatinib) profil oluşturma birkaç bütün-genom ifade seslendirdi. Bu veri paralel CML hasta veri kümeleriyle CD34 elde edilen analiz edildi+ hematopoietik kök hücre imatinib ile işlemden önce ve sonra. Bu analiz üç gen saptandı (transkripsiyon faktörü [c-Fos], Çift özgüllük fosfataz 1 [Dusp1] ve bir RNA-bağlayıcı protein [Zfp36]) hangi are sık TKI dayanıklı hücrelerdeki upregulated. İlaç direnci veriyor bu genlerin önemi doğrulamak için adım adım vitro ve in vivo analizi yapılır. Bu genlerin ifade düzeyde gerçek zamanlı qPCR (RT-qPCR) ve ilaca dirençli hücrelerde western Blot tarafından teyit edildi. Daha fazla, cDNA overexpression ve c-Fos, Dusp1, shRNA tokalar tarafından nakavt ve Zfp36 yükseltilmiş c-Fos ve Dusp1 ifadeleri yeterli ve TKI direnç danışmam gerekli olduğunu ortaya koymuştur. Bu nedenle, fare modelleri c-Fos ve Dusp1 ile sadece kullanma içinde vivo bir doğrulama işlemi. C-Fos ve Dusp1 genetik doğrulama için biz ROSACreERT indüklenebilir c-Fosfl/fl fareler (koşullu nakavt)14 oluşturulan ve onları ROSACreERT2-c-Fosfl/fl yapmak Dusp1- / - (düz nakavt)15 ile çapraz Dusp1- / - çift transgenik fareler. Kemik iliği türevi c-Seti+ hücreleri (c-Fos üzerindenfl/fl-, Dusp1- / -- ve c-Fosfl/flDusp1- / -) BCR-ABL1 ifade edildi analiz vitro bir koloni oluşturan birim (CFU) tahlil ve içinde Vivo c-Fos ve Dusp1 şartı tek başına veya birlikte lösemi gelişme test etmek için öğrenirim radyasyonlu farelerde kemik iliği nakli tarafından. Aynı şekilde, kimyasal engellemeler BCI tarafından Dusp1 ve c-Fos DFC (difluorinated curcumin)16 (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 test edildi tüp bebek ve içinde vivo BCR-ABL1-ifade, kemik kullanarak vahşi-tipi (WT) fare hücrelerden kemik iliği türevi c-Seti+ . C-Fos ve Dusp1 gereksinim lösemik kök hücre olarak onaylamak için biz nerede BCR-ABL1 özellikle kök hücrelerine doksisiklin (Tet-transactivator ifade fare kök hücre lösemi (SCL) Gen 3' artırıcı altında tarafından akımıdır CML fare modeli kullanılan Yönetmelik)18,19. Kemik iliği Lin-kullanılan Sca+c-Seti+ (LSK) hücreleri bu fareler içinde vivo nakli tahlil üzerinden. Ayrıca, phopsho-p38 düzeyleri ve Il-6 Dusp1 ve c-Fos inhibisyon, ifade pharmaco dinamik biyolojik olarak sırasıyla kurduk vivo içinde. Son olarak, çalışma insan alaka, hasta kaynaklı CD34 için genişletmek için+ (c-Seti+ hücreleri eşdeğer üzerinden fareler) vardı tabi uzun vadeli için tüp bebek kültür başlatılıyor hücre deneyleri (LTCIC) hücreleri ve bir içinde vivo insanlaşmış fare modeli CML20,21. İmmünyetmezligi fareler CML CD34 + hücre, ardından ilaç tedavisi ve insan lösemik hücre sağkalım analizi ile nakledilen.
Bu projede, biz farklı preklinik modelleri kullanarak hedef tanımlama ve genetik ve kimyasal araçlarını kullanarak doğrulamaları için yöntemler geliştirmek. Bu yöntemler, terapötik geliştirme için kimyasal yöntemleri geliştirme diğer hedefler doğrulamak için başarıyla uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:948px;" width="946">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:424px;">Biological Materials</td>
			<td style="width:247px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-016-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>3434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>4434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Hydroxytamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine Flt3-Ligand</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine IL-6</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Murine IL-7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>217-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DFC</td>
			<td>LKT Laboratories Inc.</td>
			<td>D3420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCI</td>
			<td>Chemzon Scientific</td>
			<td>NZ-06-195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imatinib</td>
			<td>LC Laboratory</td>
			<td>I-5508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curcumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458-37-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NDGA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>500-38-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penn/Strep</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1XPBS</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-005-CL</td>
			<td style="width:131px;">5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3369</td>
			<td style="width:131px;">5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45uM acro disc filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70um nylon cell stariner</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)</td>
			<td>Simga</td>
			<td>1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>CO-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocullulose Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1620115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0051-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0112-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45R (B220)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>553092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45.1-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0453-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD45.2-PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0454-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hCD45-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Biotin-FITC</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-857&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-7-4</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>MA5-16539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Ter-119</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>558612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD117 APC&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>553356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Pharm Lyse</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">BD Perm/Wash&#160; (permeabilization and wash solution for phospho flow)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phospho p38</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4511S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">total p38</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse IgG control</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>554121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Flour 488 conjugated&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K278001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X HBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K278002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood Capillary Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-260-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood Collection Tube</td>
			<td>Giene Bio-One</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Newborn Calf Serum</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erythropoiein</td>
			<td>Amgen</td>
			<td>5513-267-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human IL-3</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">G-SCF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GM-CSF</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MyeloCult (media for LTCIC assay)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mortor pestle</td>
			<td>Coor tek&#160;</td>
			<td>60316 and 60317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflorane (Isothesia TM)</td>
			<td>Butler Schien</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B90920s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td style="width:131px;">100mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto agar (agar)</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E-3119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Doxycycline chow</td>
			<td>TestDiet.com</td>
			<td>52662</td>
			<td style="width:131px;">modified RMH1500, Autoclavable 5LK8&#160; with 0.0625% Doxycycline&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodonitrotetrazolium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I10406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dneasy Blood &#38; tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">miRNeasy Mini Kit&#160; (RNA isolation kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)</td>
			<td>Ambion, Life Technologies</td>
			<td>AM1906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD117 MicroBead Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay</td>
			<td>Stemp Cell Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing bucket rotor cetrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TC-10 automated cell counter</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C-1000 Thermal cycler</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mastercycler Real Plex 2</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:424px;">ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>17001401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemavet ( boold counter)</td>
			<td>Drew-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSR II ( FACS analyzer)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fortessa I ( FACS analyzer)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSAriaII ( FACS Sorter)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnet Stand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Irradiator</td>
			<td style="width:247px;">&#160;J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA</td>
			<td>Mark I Model 68A</td>
			<td>source Cs 137</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSACreERT2</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scl-tTA&#160;</td>
			<td>Dr. Claudia Huettner&#8217;s lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BoyJ&#160;</td>
			<td>mouse core facility at CCHMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57Bl/6&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NSGS</td>
			<td>mouse core facility at CCHMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-&#160;</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSACreERT2/c-Fosfl/fl</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">BaF3</td>
			<td style="width:247px;">Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">WEHI</td>
			<td style="width:247px;">Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">CML-CD34+ and Normal CD34+ cells</td>
			<td style="width:247px;">University Hospital, University of Cincinnati</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for evaluating the role of c-fos and dusp1 in oncogene dependence

Tirozin kinaz inhibitörleri (TKIs) kronik miyeloid lösemi (CML) tedavisinde gösteri kanser tedavi yeni bir dönemin habercisi. Ancak, küçük bir nüfus hücre TKI tedavi için minimal rezidüel hastalık (MRD); kaynaklanan yanıt vermiyor Bu hücreler ortadan kaldırmak için bile en güçlü TKIs başarısız. Bu MRD hücreler tedaviye direnç geliştirmek için bir depo olarak hizmet vermektedir. Neden TKI tedavi MRD hücreleri karşı etkisiz bilinmemektedir. Büyüme faktörü sinyal MRD hücreleri hayatta kalma TKI tedavisi sırasında destek karıştığı, ama mekanik bir anlayış eksik. Son yıllarda yapılan çalışmalarda bir yükseltilmiş c-Fos ve yakınsak bir sonucu olarak Dusp1 ifade oncogenic ve büyüme faktörü MRD hücreleri sinyal TKI direnç aracılık gösterdi. C-Fos ve Dusp1 genetik ve kimyasal inhibisyonu CML TKIs zarif duyarlı işler ve her iki genetik ve insanlaşmış fare modellerinde CML tedavileri. TKI-duyarlı ve - dayanıklı hücreleri birden çok microarrays kullanarak bu hedef genlerin tespit edilmiştir. Burada, biz tüp bebek ve içinde vivo fare modelleri kullanarak hedef doğrulama için yöntemler sağlar. Bu yöntemlerin herhangi bir hedef için genetik doğrulama ve terapötik geliştirme kolayca uygulanabilir.

Onkogen bağımlılığı TKIs tedavi edici etkinliği karıştığı olmuştur. Ancak, onkogen bağımlılığı sürüş mekanizmaları anlaşılmadı. Biz genetik bileşen bağımlılığı düzenlediğini dahil tanımlamak için birden çok tarafsız gen ifade analizler yapılır. Bu analizler üç genler, c-Fos, Dusp1 ve Zfp36, oncogenic hayatta kalmak için sinyal üzerinde bağımlı değildir ve böylece, TKI tedavi için büyük küçük harf duyarlı olan kanser hücrelerini upr...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence at JoVE.com

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri

Burada, c-Fos ve Dusp1 genetik ve kimyasal doğrulama uyuşturucu hedef olarak tüp bebek ve içinde vivo genetik ve insanlaşmış fare modelleri kullanarak lösemi için iletişim kuralları açıklar. Bu yöntem, herhangi bir hedef için genetik doğrulama ve terapötik geliştirme için uygulanabilir.

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Bu yöntem, onkogen bağımlılığı ile ilgili temel genlerin belirlenmesi gibi kanser terapötik alanlarında anahtar soruların cevapyardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, birçok kizaz kaynaklı kanserlerde yaygın olan onkogen bağımlılığını kullanmasıdır, bu nedenle birden fazla tümör tipi için geçerlidir. Bu yöntem lösemi içine içgörü sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer sistemlere uygulanabilir, akciğer kanseri gibi katı tümörler, beyin tümörleri, ve pankreas tümörleri.Genel olarak, bu yönteme yeni bireyler moleküler biyoloji ve hücresel fizyoloji deneyim eksikliği nedeniyle mücadele edecek. Başlamak için, bir ötenazi farebacak kemikleri hasat. Kemiklerdeki dokuları neşterle temizleyin.Sonra buz üzerinde soğuk PBS kemikleri yerleştirin ve bir havaneli ile kemikleri ezmek. Bundan sonra, hücre süspansiyonuna 70 mikrometrelik hücresüzlüksüzlük ten 10 mililitrelik pipetle 50 mililitrelik bir vidalı tüpe süzün. Harcı ve havaneleyi soğuk PBS ile birden fazla kez yıkayın ve hücre süspansiyonuna 50 mililitrelik tüpekleyin.Sonraki santrifüj kemik iliği ve vakum ve cam pipet ile supernatant çıkarın. Hücre peletini 5 mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Bir pipet kullanarak, yavaş yavaş oda sıcaklığında poli-sakaroz üstüne askıya kemik iliği ekleyin.Bundan sonra, fren kapalı 20 dakika boyunca 400 Gs poli-sakaroz spin. Santrifüjden sonra, bir pipet ile bulutlu toplam mono-nükleer hücre arayüzü toplamak ve yeni bir 15 mililitrelik tüp aktarın. PBS ile 10 mililitre hacmi getirin ve saymak için 20 mikrolitre kaldırın.Santrifüjden sonra, supernatant atın ve buz üzerine pelet yerleştirin. Daha sonra, EDTA ve BSA ile PBS hücre pelet resuspend. Hücre süspansiyonuna CD117 mikroboncukları ve karıştırmak için girdap ekleyin.Bundan sonra, 4 santigrat derece 10 dakika boyunca süspansiyon kuluçka. Daha sonra hacmi 10 mililitreye kadar EDTA ve BSA ile daha fazla PBS ve 1200 G'de 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüj ile getirin. Supernatant kaldırmak ve EDTA ve BSA ile PBS hücre pelet askıya almak için bir vakum kullanın.Daha sonra EDTA ve BSA ile 3 mililitre PBS ekleyin manyetik kolonlu bir mıknatıs standına ve bir toplama tüpüne akmasına izin verin. Arabellek sütundan akan bittikten sonra, hücre süspansiyonu ekleyin ve sütundan toplama tüpüne akmasına izin verin. Sonraki sütuna EDTA ve BSA ile PBS 5 mililitre daha ekleyin ve hemen piston ile floş.Pistonu çıkarın ve hücreleri saymadan önce floşu tekrarlayın. Hücreleri santrifüj ettikten sonra, supernatant çıkarın ve kültür için tam IMDM hücre pelet askıya. Kültür hücreleri bir gecede 37 santigrat derecede %5 karbondioksitle.İlk olarak, 1,5 mililitrelik bir tüp içinde ambalaj plazmid, kalsiyum klorür ve su ile retroviral plazmid DNA birleştirin. Daha sonra başka bir 1,5 mililitrelik tüp hbs 500 mikrolitre ekleyin. Aynı anda en düşük ayara ayarlanmış girdap ile karıştırırken HBS içeren tüpe transfeksiyon karışımı damla akıllıca ekleyin.Transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında 20-30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka döneminde, HEK hücrelerine klorokin ekleyin ve kuvözde tutun. Transfeksiyon karışımını ekledikten sonra, hücreleri 37 santigrat derecede 8 saat kuluçkaya yatırın 5%5 CO2 kuluçka makinesi, 14 mililitre taze DMEM10 ortamını çok yavaş bir şekilde ekleyerek hücre ortamını değiştirerek değiştirin.Çanak duvara yavaş yavaş pipetleme HEK hücrelerinin herhangi bir sıyırma önlemeye yardımcı olur. Sonra hücreleri bir gecede 37 santigrat derece %5 CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. Viral supernatant toplamak için 10 mililitrelik şırınga kullanın.Sonra şırınga için 0,45 mikrometre şırınga filtresi takın. Viral supernatant'ı yeni bir toplama tüpüne daldırın. Yaklaşık 16 saat sonra viral supernatant toplamak.Bundan sonra, tedavi edilmemiş 6 iyi kültür plakaları için PBS rekombinant insan fibronektin parçası iki mililitre ekleyin. Ertesi gün, plakalardan fibronectin kaldırmak için bir pipet kullanın. PBS'de %2 BSA ile plakaları bloke edin ve plakaları oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.BSA kaldırmak için bir vakum kullanın ve bir vakum ile çıkarmadan önce PBS ile plakaları yıkayın. Bundan sonra, hemen filtrelenmiş viral supernatant ekleyin ve iki saat boyunca plaka santrifüj. Supernatant kaldırmak ve plaka tekrar döndürmek için bir vakum kullanın.Daha sonra bir vakum ile supernatant çıkarın ve PBS ile viral kaplı kuyuları yıkayın. Bir vakum ile PBS çıkarın, viral kaplı kuyulara daha önce kültürlü c-Kip artı fare hücreleri ekleyin. Santrifüjden sonra hücreleri 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.Transdüksiyondan 48 saat sonra, hücreleri santrifüj yoluyla peletleyin ve FACS tampon 1'de yeniden askıya alın. Önce oda sıcaklığında fareler için sitokinlerle metil selüloz eritin. Sonra bir FACS tüpünde 3 mililitre metil selüloz.Metil selüloz 3 mililitre uygun inhibitörleri ile hücre süspansiyon 100 mikrolitre ekleyin. Sonra süspansiyonu 10-30 saniye boyunca yükseklere doğru itin. Hava kabarcıkları kaçış çoğu sonra, üç çoğaltma plakaları medya 1 mililitre plaka için 1 mililitreşyon şırınga kullanın.Steril su içeren bir açık çanak ile birlikte büyük bir Petri kabında plakaları yerleştirin. Sonra büyük Petri kabını kapatın ve hücreleri 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. 10 mililitre suda 10 miligram iyodonitrotetrazolium klorür eriterek iyodonitrotetrazolium klorür lekesini hazırlayın.Filtre, 0,2 mikrometre filtre ile donatılmış luer kilit şırıngaile boyama çözeltisini sterilize edin. Doku kültürü başlık, CFU plaka etrafında damla-bilge boyama çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin. Sonra bir hücre kültürü kuluçka makinesinde tabakları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın.Son olarak, koloniler koyu kırmızı kahverengi renk döndü sonra, lekeli CFU plaka fotoğraf çekmek için steril doku kültürü başlık beyaz bir arka plan kullanın. Bu protokolde, onkogen bağımlılığını düzenleyen genetik bileşeni tanımlamak için birden fazla tarafsız gen ekspresyonu analizi kullanılmıştır. Lösemide tedavi hedefi olarak c-Fos ve Dusp1'in rolünü doğrulamak için, aşırı ekspresyonu BCR-ABL1 onkogenesini ifade eden hücrelerle doğrulandı.RT-qPCR ve western blotting ile yapılan analizler, her ikisinin de BCR-ABL1 tarafından indüklendirilmiş olduğunu ve ekspresyonların büyüme faktörü IL-3 ile artırıldığını doğrulamıştır. YFP artı ifade hücreleri daha fazla in vitro ve in vivo tahliller için FACS üzerinden sıralandı. Sonuçlar, c-Fos ve Dusp1'in silinmesinin tek başına CFU sayılarını inhibe ettiğini göstermiştir.Hem c-Fos hem de Dusp1'den yoksun hücreler koloni oluşturma yetenekleriaçısından önemli ölçüde tehlikeye girdi ve C-Fos ve Dusp1 kaybının BCR-ABL1 ekspresyonu için sentetik olarak ölümcül olduğunu gösteren Tüm CPU'ları yok etti. Bu gelişmeden sonra bu teknik, kanser alanında araştırmacıların onkogen bağımlılığını yönlendiren genetik ağları ve genleri ve bu genlerin fare modellerinde ve insan hastalarda ki özel tepkilerini nasıl etkilediğini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Retrovirüsler ve hasta numuneleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken laboratuvar uygulamalarına uyulması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

İnsan hipofiz adenom doku Proteom analizi için kütle spektrometresi yöntemleri ile birleştiğinde iki boyutlu Jel Elektroforez

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Kanserle ilgili yorgunluk mitokondriyal işlev rolünün değerlendirilmesi

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3-b hücre kültür sistemi istila eğitim ve Mesane kanserinde tedavi değerlendirmek için

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Organoid Kültürü Kullanarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Ayırt Etme Kapasitesinin Değerlendirilmesi

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

Yumurtalık Kanserinde Çentik Sinyalizasyonunun Rolünü Anlamak İçin Biyoinformatik Yaklaşımların ve Deneysel Doğrulamaların Entegrasyonu

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...