Name: lung fixation under constant pressure for evaluation of emphysema in mice
Uploaded: 2019-09-26T12:30:00
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Ce travail a été soutenu en partie par JSPS KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) et l'Institute for Environmental and Gender-Specific Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Grant Number E2920 (T. Sato). Le bailleur de rôle n'a joué aucun rôle dans la conception des méthodes actuelles et dans l'écriture du manuscrit.

Les méthodes suivantes ont été approuvées par les comités de soins et d'utilisation des animaux de l'École de médecine de l'Université de Juntendo. Les Lignes directrices pour une bonne conduite des expériences animales, Conseil des sciences du Japon, 1er juin 2006 ont été suivies. Il y a trois étapes principales dans cette méthode : 1) dissection de souris, 2) exsanguination de poumon, et 3) fixation des tissus de poumon assistés par l'équipement spécialisé. Typiquement, les spécimens de poumon sont tr...

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	<li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+strategy+for+the+diagnosis,+management,+and+prevention+of+chronic+obstructive+lung+disease+2017+report.+GOLD+Executive+Summary.">Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive lung disease 2017 report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li><li>Pauwels, R. A., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+and+clinical+features+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+(COPD).">Burden and clinical features of chronic obstructive pulmonary disease (COPD).</a> Lancet. 364 (9434), 613-620 (2004).</li><li>Spurzem, J. R., Rennard, S. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+remodeling+in+the+smoke+exposed+guinea+pig+model.">Airway remodeling in the smoke exposed guinea pig model.</a> Inhalation Toxicology. 19 (11), 915-923 (2007).</li><li>Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instillation+and+Fixation+Methods+Useful+in+Mouse+Lung+Cancer+Research.">Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).</li><li>Roos, A. B., Berg, T., Ahlgren, K. M., Grunewald, J., Nord, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+pulmonary+neutrophilia+using+aerosolized+lipopolysaccharide.">A method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K. L., Mahadeva, R., Boukedes, S. S., Owen, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+pulmonary+emphysema+and+small+airway+remodeling+in+cigarette+smoke-exposed+mice.">Automated measurement of pulmonary emphysema and small airway remodeling in cigarette smoke-exposed mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), 52236 (2015).</li><li>Nakanishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarithromycin+prevents+smoke-induced+emphysema+in+mice.">Clarithromycin prevents smoke-induced emphysema in mice.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (4), 271-278 (2009).</li><li>Maeno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+Cells+are+required+for+inflammation+and+destruction+in+cigarette+smoke-induced+emphysema+in+mice.">CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice.</a> Journal of Immunology. 178 (12), 8090-8096 (2007).</li><li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+fixation+for+total+preanalytic+phase+evaluation+in+pathology+laboratories:+a+comprehensive+study+including+immunohistochemistry,+DNA,+and+mRNA+assays.">Optimal fixation for total preanalytic phase evaluation in pathology laboratories: a comprehensive study including immunohistochemistry, DNA, and mRNA assays.</a> Pathology International. 64 (5), 209-216 (2014).</li></ol>

La procédure de fixation pour les poumons de rongeurs présentée ici n'est pas nouvelle; cependant, ce système présente plusieurs avantages. Tout d'abord, il peut fixer de nombreux poumons (maximum de 20) avec la même condition à la fois. La Society of Toxicologic Pathology affirme que la pression pour l'instillation de la gravité varie de 22 à 25 cmH2O22. Notamment, plusieurs études ont effectué la fixation pulmonaire à une pression de 25 cmH2O13...

La MPOC est l'une des principales causes mondiales de décès1. La fumée de cigarette est la cause la plus importante de la MPOC, mais les mécanismes de pathogénie restent incomplètement définis. La MPOC présente deux caractéristiques principales, y compris la limitation progressive du débit d'air et une réponse inflammatoire anormale du poumon. Le désordre emphysème se produit fréquemment dans les poumons des patients de COPD2. Les résultats pathologiques de l'emphysème sont caractérisés par la destruction de mur alvéolif3. Plusieurs espèces animales ont été utilisées pour produire des modèles de MPOC in vivo (c.-à-d. chiens, cobayes, singes et rongeurs)4. Cependant, la souris est devenue la plus couramment utilisée dans la construction de modèles de MPOC. Cela a de nombreux avantages, y compris son faible coût, la capacité d'être génétiquement modifié, la disponibilité étendue de l'information génomique, la disponibilité des anticorps, et la capacité d'utiliser une variété de souches de souris5. Actuellement, il n'y a aucun modèle de souris qui peut imiter toutes les caractéristiques de la MPOC humaine; ainsi, les chercheurs individuels doivent choisir quel modèle convient le mieux à la recherche spécifique sur la MPOC6. Le modèle de souris emphyséame est l'un des nombreux modèles de souris COPD qui sont actuellement disponibles. D'autres modèles incluent le modèle de souris d'exacerbation, le modèle systémique de comorbidités, et le modèle de susceptibilité de COPD7.
Le modèle de souris emphyséame peut être généré par plusieurs types d'agents exogènes, y compris les agents chimiques et l'exposition à la fumée de cigarette4. L'exposition chimique (p. ex., à l'élastase) produit un type grave d'emphysème, tandis que la fumée de cigarette entraîne un emphysème léger8,9. On croit que la fumée de cigarette est la principale cause de la pathogénie de la MPOC; par conséquent, le choix de la fumée de cigarette comme un moyen de créer un modèle de souris COPD est raisonnable10. De nombreuses études ont utilisé la fumée de cigarette pour créer de l'emphysème chez la souris. Par exemple, Nikula et coll. ont réussi à créer un modèle de souris emphyséamée à partir de souris femelles B6C3F1 en les exposant à la fumée de cigarette pendant 7 ou 13 mois11. Nous avons également établi un modèle de souris emphyséame via la protéine marqueur de sénescence/SMP-30 SOURIS KO12. Il est crucial d'effectuer une méthode de fixation pulmonaire qui peut correctement visualiser ce modèle d'emphysème doux par l'exposition à la fumée de cigarette.
Diverses méthodes de fixation pulmonaire ont été établies13. Cependant, il n'existe pas de méthode standard d'or de fixation des tissus pulmonaires pour évaluer l'emphysème14. Plusieurs études de ce laboratoire ont montré que le système de fixation présenté ici est utile en créant une condition stable pour l'évaluation de l'emphysème12,15,16,17,18. Le principal avantage du système actuel est qu'il peut fixer de nombreux poumons avec la même condition à la fois sans effondrement pulmonaire ou la déflation. Le système actuel de fixation pulmonaire utilise un équipement spécial qui permet de gonfler les échantillons pulmonaires à une pression constante appropriée pendant une période donnée. Cet équipement spécial se compose de trois pièces, y compris un conteneur inférieur, conteneur supérieur, et la pompe. Les échantillons pulmonaires sont placés dans le récipient inférieur qui est relié à des agents de fixation sous pression, ce qui entraîne une différence de pression de 25 cmH2O dans le niveau d'agents entre les contenants supérieurs et inférieurs19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% formalin (formalin neutral buffer solution)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>060-01667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bent forceps</td>
			<td>Hammacher</td>
			<td>HSC187-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula, size 20G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SR-FS2032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula, size 22G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SR-OT2225C</td>
			<td>Cannula to exsanguinate lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Hammacher</td>
			<td>HSC184-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtowel</td>
			<td>Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)</td>
			<td>61000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)</td>
			<td>62011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lower container (acrylic glass material)</td>
			<td>Tokyo Science</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Pressure equipment component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller pump</td>
			<td>Nissin Scientific Corp</td>
			<td>NRP-75</td>
			<td>Pump machine to exsanguinate lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller pump RP-2000</td>
			<td>Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd)</td>
			<td>160200</td>
			<td>Pressure equipment pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tube &#216; 9 mm</td>
			<td>Sansyo</td>
			<td>94-0479</td>
			<td>Pressure equipment component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somnopentyl (64.8 mg/mL)</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>SOM02-YA1312</td>
			<td>Pentobarbital Sodium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Hammacher</td>
			<td>HSB014-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture thread, size 0</td>
			<td>Nescosuture</td>
			<td>GA01SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 mL</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 1 ml with needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T2613S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-10ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcock</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>TS-TR1K01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upper container (acrylic glass material)</td>
			<td>Tokyo Science</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Pressure equipment component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lung fixation under constant pressure for evaluation of emphysema in mice

L'emphysème est une caractéristique importante de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Les études impliquant un modèle de souris emphyséame exigent une fixation optimale des poumons pour produire des spécimens histologiques fiables du poumon. En raison de la nature de la composition structurelle du poumon, qui se compose en grande partie d'air et de tissu, il y a un risque qu'il s'effondre ou se dégonfle pendant le processus de fixation. Diverses méthodes de fixation pulmonaire existent, chacune ayant ses propres avantages et inconvénients. La méthode de fixation pulmonaire présentée ici utilise une pression constante pour permettre une évaluation optimale des tissus pour les études utilisant un modèle de poumon de souris emphysématous. Le principal avantage est qu'il peut fixer de nombreux poumons avec la même condition à la fois. Les échantillons pulmonaires sont obtenus à partir de souris chroniques exposées à la fumée de cigarette. La fixation pulmonaire est effectuée à l'aide d'équipements spécialisés qui permettent la production d'une pression constante. Cette pression constante maintient le poumon dans un état raisonnablement gonflé. Ainsi, cette méthode génère un spécimen histologique du poumon qui convient pour évaluer l'emphysème doux induit par la fumée de cigarette.

Tel que décrit précédemment, l'équipement spécialisé, qui génère une pression constante prolongée, peut être divisé en trois parties (figure 3A). La partie inférieure est le point où insérer l'échantillon pulmonaire (Figure 4A). Le poumon est relié par une canule (20 G) à la pointe de l'écoulement formalin à l'aide d'une bite d'arrêt à trois voies (Figure 4B). L...

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Lung Fixation under Constant Pressure for Evaluation of Emphysema in Mice Video (Video) | JoVE

Présenté ici est un protocole utile pour la fixation pulmonaire qui crée une condition stable pour l'évaluation histologique des spécimens de poumon à partir d'un modèle de souris de l'emphysème. Le principal avantage de ce modèle est qu'il peut fixer de nombreux poumons avec la même pression constante sans effondrement pulmonaire ou déflation.

Fixation pulmonaire sous pression constante pour l'évaluation de l'emphysème chez les souris

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung ...

La pression constante à l’intérieur du dispositif de fixation maintient les poumons dans un état raisonnablement gonflé générant un spécimen histologique de poumon approprié pour évaluer l’emphysème induit par la fumée douce de cigarette. Le principal avantage de ce modèle est qu’il peut fixer de nombreux poumons en même temps en utilisant la même pression constante sans effondrement pulmonaire ou déflation. Naoko Arano, étudiante diplômée de mon laboratoire, démontrera la procédure.Après avoir confirmé un manque de réponse au mouvement réflexe faire une incision dans la peau et le tissu musculaire le long de la ligne médiale de la souris, visant la région céphalique, et couper latéralement pour créer un espace de travail plus large. Après avoir exposé la ponction de la couche de diaphragme le tissu avec des forceps et ouvrir l’espace thoracique. Couper la zone sternale permettant de visualiser les poumons et le cœur.Et couper l’oreillette gauche et le ventricule droit. Insérez une canule de calibre 24 reliée à une pompe de perfusion dans la zone ventricule droite et dirigez la canule vers la zone céphalique jusqu’à ce qu’elle atteigne l’artère pulmonaire. Ensuite, allumez la pompe et perfusez le tissu avec environ 200 millilitres de PBS pendant une heure jusqu’à ce que tout le tissu pulmonaire ait changé pour une couleur blanche.À la fin de la perfusion couper le tissu conjonctif entourant la trachée, les poumons et le cœur, et utiliser une suture pour attacher les bronches principales droites. Ensuite, récoltez tous les lobes individuels du poumon droit et placez le cœur et les lobes du poumon gauche dans des seringues individuelles de 10 millilitres contenant un fixatif approprié. Rétractez le piston créant un vide dans la seringue pour gonfler les poumons et enlever le poumon de la seringue.Insérez une canule de calibre 20 dans la trachée et utilisez une suture pour fixer la canule en place. Connectez une seringue d’un millilitre remplie de fixatif à la canule et remplissez le poumon d’un fixatif supplémentaire pour vérifier les fuites. Assurez-vous que le site d’insertion a été fixé pour empêcher le spécimen pulmonaire de se détacher de la planche pulmonaire pendant la fixation.Ensuite, transférez le tissu à l’équipement de pression de fixation pulmonaire, en enlevant l’échantillon et en collant la trachée avec un noeud à la fin de la période de fixation. Le composant inférieur de l’équipement de pression de fixation pulmonaire dans lequel l’échantillon pulmonaire est inséré est relié par canule de calibre 20 à l’extrémité du flux de formaline avec un robinet d’arrêt à trois sens. La pression est générée à partir des différents niveaux de surface du fixatif entre les compartiments inférieurs et supérieurs.La différence de pression est de 25 centimètres d’eau, mais le bouton de réglage de la hauteur peut être utilisé pour ajuster la pression à entre 25 et 30 centimètres d’eau. Une pompe relie les récipients inférieurs et supérieurs, préservant une différence de 25 centimètres dans la hauteur de surface fixative, et dirige le flux de l’agent. Après 48 heures de fixation, les poumons des souris KO SMP30 exposées à l’air ambiant ne présentent pas d’élargissement marqué de l’espace aérien.Toutefois, l’élargissement important de l’espace aérien et la destruction des paroi alvéolaire sont observés chez les souris KO SMP30 exposées à la fumée chronique de cigarette. En outre, l’interception linéaire moyenne et l’indice destructeur des spécimens pulmonaires sont significativement plus élevés chez les souris SMP30 knockout exposées à la fumée que chez les animaux exposés à l’air. Notre laboratoire utilise 10% de formaline, mais les chercheurs peuvent utiliser d’autres agents de fixation en fonction de leurs besoins expérimentaux.Comme nous l’avons signalé en utilisant le système de fixation démontré échantillons pulmonaires peuvent être récoltés à partir de divers modèles d’emphysème de souris pour leur évaluation morphométrique. Comme les agents de fixation peuvent être dangereux, portez toujours l’équipement de protection du personnel approprié et travaillez dans une pièce bien ventilée.

Research

JoVE Journal

Medicine

Lung Fixation under Constant Pressure for Evaluation of Emphysema in Mice

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Médecine

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