Name: a high-throughput platform for the screening of salmonella spp./shigella spp.
Uploaded: 2018-11-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp. at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da scienza e tecnologia programma di Zhuhai, Cina (concessione numero 20171009E030064), la scienza e tecnologia programma del Guangdong, Cina (concessione numero 2015A020211004) e scienza e tecnologia programma dell'amministrazione generale di supervisione della qualità, ispezione e quarantena della Repubblica popolare cinese (concessione numero 2016IK302, 2017IK224).

Il protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca umana di Zhuhai International Travel Healthcare Center. Si prega di utilizzare standard di funzionamento sterile durante l'esperimento.
1. preparazione e composizione di terreni di coltura
<ol><li>Preparare il brodo nutritivo: Sciogliere 1% peptone, 0,3% di Estratto di carne di manzo, 0,5% cloruro di sodio, 0,1% di glucosio in H2O, regolare il pH a 7,5 e autoclave a 121 ° C per 15 min.</li>
	<li>Preparare il support...

<ol>
	<li>Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+acute+gastrointestinal+illness+in+developed+countries.">The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries.</a> Journal of Water and Health. 4, 31-69 (2006).</li><li>Wilking, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+gastrointestinal+illness+in+adults+in+Germany:+a+population-based+telephone+survey.">Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey.</a> Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).</li><li>Friesema, I. H. M., Lugn&#233;r, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+of+gastroenteritis+in+the+Netherlands,+with+special+attention+for+severe+cases.">Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).</li><li>Henson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+costs+of+acute+gastrointestinal+illness+in+British+Columbia,+Canada.">Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada.</a> International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).</li><li>Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-diarrhea+chronic+intestinal+symptoms+and+irritable+bowel+syndrome+in+North+American+travelers+to+Mexico.">Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico.</a> The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).</li><li>Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+quantification+of+19+diarrhea-related+pathogens+with+a+quantitative+real-time+PCR+panel+assay.">Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay.</a> Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).</li><li>Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screening+algorithm+for+diagnosing+bacterial+gastroenteritis+by+real-time+PCR+in+combination+with+guided+culture.">A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+quantitative+molecular+diagnostic+methods+to+identify+causes+of+diarrhoea+in+children:+a+reanalysis+of+the+GEMS+case-control+study.">Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study.</a> Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).</li><li>Wang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+shigellosis+by+real-time+PCR+suggests+underestimation+of+shigellosis+prevalence+by+culture-based+methods+in+a+population+of+rural+China.">Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China.</a> Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).</li><li>Wikswo, M. E., Hall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreaks+of+acute+gastroenteritis+transmitted+by+person-to-person+contact--United+States,+2009-2010.">Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact--United States, 2009-2010.</a> MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+12+Gastrointestinal+Pathogens+Spectrum+of+Acute+Infectious+Diarrhea+in+a+Sentinel+Hospital,+Shenzhen,+China.">The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).</li><li>Tariq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+antimicrobial+resistance+and+integron+association+of+multidrug-resistant+clinical+isolates+of+Shigella+species+from+Faisalabad,+Pakistan.">Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan.</a> Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).</li><li>Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+Genotypic+Eligible+Methods+for+Salmonella+Typhimurium+Source+Tracking.">Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viable+but+nonculturable+state+in+bacteria.">The viable but nonculturable state in bacteria.</a> The Journal of Microbiology. 43, 93-100 (2005).</li><li>Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+multiplex+real-time+PCR+kit+Amplidiag(R)+Bacterial+GE+in+the+detection+of+bacterial+pathogens+from+stool+samples.">Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples.</a> Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).</li><li>Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+Multiplex+Real-Time+PCR+Assay+for+Detecting+Major+Bacterial+Enteric+Pathogens+in+Fecal+Specimens:+Intestinal+Inflammation+and+Bacterial+Load+Are+Correlated+in+Campylobacter+Infections.">Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).</li><li>Van Lint, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+real-time+multiplex+PCR+for+the+simultaneous+detection+of+Campylobacter+jejuni,+Salmonella+spp.,+Shigella+spp./EIEC,+and+Yersinia+enterocolitica+in+fecal+samples.">Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples.</a> Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).</li><li>Kamkamidze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Identification+Of+The+Etiological+Factors+Causing+Diarrheal+Diseases.">Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases.</a> Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).</li><li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Application+of+a+Visual+DNA+Microarray+for+the+Detection+of+Food-borne+Pathogens.">Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens.</a> Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).</li><li>Zhuang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Salmonella+spp.+by+a+loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+method+targeting+bcfD+gene.">Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene.</a> Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).</li><li>Shi, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+simultaneous+detection+of+Salmonella+and+Shigella+using+modified+molecular+beacons+and+real-time+PCR.">Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR.</a> Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).</li><li>Mo, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+96-microwell+plate+DNA+diagnostic+chip+for+detection+of+foodborne+bacteria+and+its+application+in+an+incident+of+food+poisoning.">Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning.</a> Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).</li><li>Wang, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probe-free+and+sensitive+detection+of+diarrhea-causing+pathogens+using+RT-PCR+combined+high+resolution+melting+analysis.">Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis.</a> Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).</li><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+simultaneous+screening+of+seven+clinically+important+enteric+pathogens+using+a+magnetic+bead+based+DNA+microarray.">Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).</li><li>Qi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+assay+for+rapid+detection+of+five+important+pathogenic+vibrios.">Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios.</a> Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).</li><li>Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-+and+molecular-based+detection+of+swine-adapted+Salmonella+shed+by+avian+scavengers.">Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers.</a> Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).</li><li>Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verification+and+large+scale+clinical+evaluation+of+a+national+standard+protocol+for+Salmonella.spp./Shigella.spp.+screening+using+real-time+PCR+combined+with+guided+culture.">Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture.</a> Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).</li><li>Dekker, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drinking+water+from+dug+wells+in+rural+ghana--salmonella+contamination,+environmental+factors,+and+genotypes.">Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).</li><li>Gargano, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+from+selected+diseases+that+can+be+transmitted+by+water+-+United+States,+2003-2009.">Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009.</a> Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).</li><li>Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+culture,+ELISA+and+PCR+assays+for+the+detection+of+Salmonella+in+seafood.">Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood.</a> Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).</li><li>Herrera-Leon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blind+comparison+of+traditional+serotyping+with+three+multiplex+PCRs+for+the+identification+of+Salmonella+serotypes.">Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes.</a> Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).</li><li>Cunningham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-hour+molecular+detection+of+Campylobacter,+Salmonella,+Yersinia,+and+Shigella+species+in+feces+with+accuracy+as+high+as+that+of+culture.">Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).</li><li>Eriksson, E., Aspan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+culture,+ELISA+and+PCR+techniques+for+salmonella+detection+in+faecal+samples+for+cattle,+pig+and+poultry.">Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry.</a> BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).</li><li>Dutta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+performance+characteristics+of+a+direct+PCR+with+stool+samples+in+comparison+to+conventional+techniques+for+diagnosis+of+Shigella+and+enteroinvasive+Escherichia+coli+infection+in+children+with+acute+diarrhoea+in+Calcutta,+India.">Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India.</a> Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).</li></ol>

Da Salmonella spp /Shigella spp sono spesso associati con l'intossicazione alimentare e trasmissione fecale-orale di gastroenterite acuta28,29 e il metodo di routine è laborioso o richiede molto tempo 7, descriviamo una piattaforma ad alta produttività per la Salmonella spp / proiezione diShigella spp., usando la PCR in tempo reale combinati con cultura guidata.
Ci sono dive...

La diarrea è ancora un problema di salute comune con un'alta incidenza globalmente tasso1,2. Anche se la mortalità è relativamente bassa, alcuni pazienti mostrano vari sintomi per settimane (come sgabelli allentati e acquosi, l'urgenza di andare in bagno), che rendono l'impatto socio-economico molto alto3,4. Più seriamente, alcuni pazienti possono anche sviluppare sindrome dell'intestino irritabile se lasciato non trattato5. Ci sono vari tipi di batteri, virus e parassiti che possono causare diarrea6. Salmonella spp /Shigella spp sono tra i più comuni batteri per la trasmissione di gastroenterite acuta7,8,9,10,11. Di conseguenza, molte contee hanno emesso leggi o regolamenti per regolare Salmonella spp /Shigella spp screening fra la gente che dovrebbe gestire cibo e acqua. Ad esempio, il governo cinese hanno emesso leggi obbligatorie Salmonella spp /Shigella spp screening una volta all'anno.
Il metodo gold standard per Salmonella spp /Shigella spp. rilevamento è coltura dei batteri. Attraverso la coltura dei batteri e successiva identificazione biochimica e sierologica caratterizzazione, possiamo identificare la specie di batteri, che potrebbero facilitare la gestione del focolaio di malattia e profilatura antimicrobica per facilitare il trattamento dei pazienti 12. potrebbe anche aiutare a rintracciare la fonte di infezione durante la Salmonella spp /Shigella spp. scoppio13. Tuttavia, questo metodo è laborioso (che richiedono funzionamento manuale) e che richiede tempo (prendendo diversi giorni), soprattutto per il collaudo di un gran numero di esempi7. Inoltre, vitali ma non coltivabili (VBNC) Salmonella spp /Shigella spp.,possono esistere in alcuni campioni di feci14. In considerazione di questi inconvenienti, molti laboratori hanno cercato di sviluppare nuove tecniche per la rilevazione della Salmonella spp /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. tutti questi metodi utilizzano il test nucleare acido amplificazione (NAAT), tra i quali la reazione a catena della polimerasi (PCR) è il più comune. Uno dei principali limiti di questi metodi NAAT basata è che i batteri morti, anche batteriche detriti contenenti DNA genomic incompleta, potrebbero mostrare risultati positivi26, che in gran parte potrebbe influenzare la diagnosi accurata della malattia. Blanco et al hanno mostrato che quel saggio molecolare è altamente sensibile, non solo praticabile Salmonella nelle culture, ma anche di parziali genomi e batteri morti o impraticabili dal passato infezioni o contaminazioni26. Di conseguenza, la nuova tecnologia dovrebbe essere sviluppata.
Qui, abbiamo descritto un nuovo metodo che combina il NAAT basato su metodo e coltura. Come illustrato nella Figura 1, questo nuovo metodo si applica in tempo reale PCR prima di screening e quindi vengono inviati campioni positivi per l'identificazione e la coltura dei batteri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:732px;" width="732">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tris</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">EDTA</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">798681</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">NP40</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">11332473001</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:249px;">ddH2O</td>
			<td style="width:112px;">Takara</td>
			<td style="width:119px;">9012</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PrimeSTAR HS (Premix)</td>
			<td style="width:112px;">Takara</td>
			<td style="width:119px;">R040Q</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Nutrient Broth</td>
			<td style="width:112px;">LandBridge</td>
			<td style="width:119px;">CM106</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Nutrient agar</td>
			<td style="width:112px;">LandBridge</td>
			<td style="width:119px;">CM107</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Selenite Cystine medium</td>
			<td style="width:112px;">LandBridge</td>
			<td style="width:119px;">CM225</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">XLD</td>
			<td style="width:112px;">LandBridge</td>
			<td style="width:119px;">CM219</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">MAC&#160;</td>
			<td style="width:112px;">LandBridge</td>
			<td style="width:119px;">CM908</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Salmonella chromogenic agar</td>
			<td style="width:112px;">CHROMagar</td>
			<td style="width:119px;">SA130</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Salmonella diagnostic serum</td>
			<td style="width:112px;">Tianrun</td>
			<td style="width:119px;">SAL60</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Shigella diagnostic serum</td>
			<td style="width:112px;">Tianrun</td>
			<td style="width:119px;">SHI54</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">anal swab (collecting tube plus)</td>
			<td style="width:112px;">Huachenyang</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">slide</td>
			<td style="width:112px;">Mingsheng</td>
			<td style="width:119px;">7102</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">micro-loop</td>
			<td style="width:112px;">Weierkang</td>
			<td style="width:119px;">W511</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">incubator</td>
			<td style="width:112px;">Jinghong</td>
			<td style="width:119px;">DNP-9082</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">autoclave</td>
			<td style="width:112px;">AUL</td>
			<td style="width:119px;">SS-325</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">dry bath</td>
			<td style="width:112px;">Jinghong</td>
			<td style="width:119px;">KB-20</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">automated microbial identification system</td>
			<td style="width:112px;">bioM&#233;rieux</td>
			<td style="width:119px;">VITEK2</td>
			<td style="width:252px;">other equivalent system could be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">fluorescent real-time PCR machine</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">ABI7500</td>
			<td style="width:252px;">other equivalent machine could be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput platform for the screening of salmonella spp./shigella spp.

Trasmissione feco-orale di gastroenterite acuta si verifica di tanto in tanto, soprattutto quando le persone che hanno gestito il cibo e l'acqua sono infetti da Salmonella spp./Shigella spp. Il metodo gold standard per la rilevazione della Salmonella spp./Shigella spp è coltura diretta ma questo è laborioso e che richiede tempo. Qui, descriviamo una piattaforma di alto-rendimento per Salmonella spp./Shigella spp., screening, usando reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR) combinata con cultura guidata. Ci sono due fasi principali: PCR in tempo reale e la cultura guidata. Per la prima fase (Real-Time PCR), spieghiamo ogni passaggio del metodo: esempio di collezione, pre-arricchimento, estrazione del DNA e PCR in tempo reale. Se il risultato in tempo reale di PCR è positivo, allora viene eseguita la seconda fase (guidata cultura): coltura selettiva, identificazione biochimica e sierologica caratterizzazione. Illustriamo anche risultati rappresentativi generati da esso. Il protocollo descritto qui sarebbe una valida piattaforma per lo screening rapido, specifico, sensibile ed alta-velocità di trasmissione di Salmonella spp /Shigella spp.

Il protocollo è stato applicato per lo screening della Salmonella spp /Shigella spp nelle feci anale campioni da chi dovrebbe gestire cibo e acqua.
In fase PCR in tempo reale, come mostrato in Figura 5A, c'era un'amplificazione successo nel canale di HEX, che significava che il misto del campione era positivo per Salmonella spp. Quindi un ulteriore PCR in...

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A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp /Shigella spp sono agenti patogeni comuni attribuiti alla diarrea. Qui, descriviamo una piattaforma di alto-rendimento per lo screening della Salmonella spp /Shigella spp usando la PCR in tempo reale combinati con cultura guidato.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Questo metodo fornisce una piattaforma ad alta produttività per lo screening di Salmonella e Shigella. Il vantaggio principale di questa tecnica è la ripetizione, la specificità, la sensibilità e l'elevata produttività. Questa tecnica combina il metodo e la coltura veloci NAAT in cui è stato applicato prima lo screening PCR in tempo reale, e poi quelli positivi sono stati inviati per la coltura e l'identificazione dei batteri.Sebbene questo metodo si concentri sullo screening di Salmonella e Shigella, può anche essere applicato ad altri agenti patogeni come Vibrios, Staphylococcus, E.Coli ed eccetera. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la selezione della colonia corretta è difficile a causa della flora di fondo nei campioni. Per iniziare, aggiungere tre millilitri di brodo nutriente a ciascun campione.Quindi, incubare i campioni a 36 gradi Celsius per sei ore. Successivamente, centrifugare la coltura pre-arricchimento a 800 g per due minuti. Quindi, trasferire il supernatante su un nuovo tubo e centrifugarlo di nuovo per cinque minuti a 12.000 g.Dopo aver scartato il supernatante, aggiungere 100 microlitri della soluzione di estrazione del DNA al pellet. Quindi, vortice il tubo per un minuto. Quindi, riscaldare il campione a 1.000 gradi Celsius nel bagno secco.Dopo aver ripetuto la centrifugazione, raccogliere il supernatante in un nuovo tubo. Innanzitutto, creare la miscela di reazione e impostare il programma di ciclismo in base al protocollo di testo. Quindi, eseguire PCR in tempo reale su una macchina PCR fluorescente in tempo reale.In primo luogo, aggiungere 100 microlitri della coltura pre-arricchimento a cinque millilitri di mezzo cristallino di selenite. Quindi, incubare la coltura a 36 gradi Celsius per 18-24 ore. Quindi, raccogli un anello della cultura e diffondilo su un piatto.Quindi, incubare il piatto a 36 gradi Celsius per 18-24 ore. Dopo l'incubazione, selezionare colonie sospette e trasferirle su un piatto. Incubare la piastra a 36 gradi Celsius per 18-24 ore.Quindi, identificare la colonia sospetta utilizzando un sistema di identificazione microbica automatizzato. Per iniziare la caratterizzazione dell'O-antigene, aggiungete una goccia dei sieri polivalenti dell'O-antigene a una diapositiva pulita. Trasferire un anello della colonia nello scivolo e macinarlo nella sieri.Se i batteri sembrano sabbia che scorre, ripetere il trattamento precedente con sieri monovalenti O-antigen fino a quando l'antigene non è caratterizzato. Per iniziare la caratterizzazione dell'antigene H, aggiungere una goccia di sieri polivalenti ad antigene H a una diapositiva pulita. Quindi, raccogli un loopful della colonia e griglialo nella sera.Utilizzare sieri monovalenti ad antigene H per ripetere il trattamento fino a quando non viene caratterizzato lo specifico antigene H. Per separare la coltura, raccogliere un anello della coltura pre-arricchimento e stenderlo su un piatto. Quindi, incubare il luogo a 36 gradi Celsius per 18-24 ore.Dopo l'incubazione, raccogli una colonia dall'aspetto sospetto su un piatto. Incubare la piastra a 36 gradi Celsius per 17-24 ore. Quindi, sottosostire la colonia all'identificazione biochimica utilizzando un sistema di identificazione microbica automatizzato.Quindi, applicare una goccia di sieri polivalenti della specie Shigella su uno scivolo pulito. Quindi, usa un micro-loop per raccogliere alcuni dei batteri e macinarli nei sieri. Infine, se i sieri assomigliano alla sabbia che scorre, utilizzare sieri monovalenti della specie Shigella per caratterizzare ulteriormente i batteri.Utilizzando questo protocollo, campioni di feci provenienti da pazienti sono stati vengono vengono vengono vengono Utilizzando la PCR in tempo reale, c'è stata un'amplificazione riuscita nel canale HEX, indicando che il campione era positivo per le specie di Salmonella. Un'ulteriore PCR in tempo reale ha indicato che il secondo campione era positivo per la Salmonella ed è stato scelto per la coltura guidata delle specie di Salmonella.Nella coltura guidata delle specie di Salmonella, le colonie rosa e viola sono state placcate separatamente e sottoposte a identificazione biochimica. I risultati hanno indicato che le colonie del secondo campione erano Salmonella paratyphi B.Utilizzando PCR in tempo reale, c'è stata un'amplificazione riuscita nel canale FAM, indicando che il campione era positivo per le specie di Shigella. Ulteriori PCR in tempo reale indicavano che il campione 10 era positivo per Shigella ed è stato scelto per la cultura guidata.Nella cultura guidata delle specie shigella, le colonie rosa-rosse e incolori sono state placcate separatamente e sottoposte a identificazione biochimica. I risultati indicavano che il campione 10 conteneva batteri shigella sonnei di fase II. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare la limitazione del metodo dovuta alla variazione della sequenza.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come le impostazioni cultura dirette, al fine di evitare risultati PCR falsi negativi in tempo reale. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo del rilevamento di Salmonella e Shigella, poiché il nuovo protocollo potrebbe aumentare il tasso positivo di due volte e ridurre significativamente il carico di lavoro e il TAT. Non dimenticare che lavorare con Salmonella e Shigella può essere estremamente pericoloso e i dispositivi di protezione individuale, DPI, dovrebbero essere sempre presi durante l'esecuzione di questa procedura.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay per Fenotipo<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Associazione, Invasion, e replica nei macrofagi

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

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