Name: neutrophil extracellular traps generated by low density neutrophils obtained from peritoneal lavage fluid mediate tumor cell growth and attachment
Uploaded: 2018-08-03T14:30:00
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Agradecemos a Sra. J. Shinohara e I. Nieda para trabalhos técnicos e administrativos. Também, agradecemos os Drs Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina e Kazuya Takahashi sua cooperação para aquisição de amostra na sala de cirurgia. Este trabalho foi financiado por um subsídio para a investigação científica do Ministério da educação, ciência, esportes e cultura do Japão e o Japão sociedade para a promoção da ciência (17K 10606).

LDN foram obtidos de pacientes matriculados neste estudo e foram aprovados pela institucional Review Board de Jichi médica Universidade.
1. isolamento de LDN de Lavages de cavidade Abdominal e deteção líquida
<ol><li>Aquisição de amostra<ol>
<li>Infundi 1.000 mL de solução salina estéril diretamente na cavidade abdominal antes do fechamento da ferida em pacientes que se submeteram à cirurgia abdominal devido a malignidade gastrointestinal. Nota: As amostras foram obtidas de paci...

<ol>
	<li>Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+density+neutrophils+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus,+rheumatoid+arthritis,+and+acute+rheumatic+fever.">Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever.</a> Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).</li><li>Denny, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs.">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li><li>Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+of+low+density+subpopulations+and+CD10+(CALLA)+negative+neutrophils+in+severely+infected+patients.">The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients.</a> Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).</li><li>Schmielau, J., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+granulocytes+and+granulocyte-derived+hydrogen+peroxide+are+the+underlying+mechanism+of+suppression+of+t-cell+function+in+advanced+cancer+patients.">Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients.</a> Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).</li><li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties.">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).</li><li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+granulocytes:+a+distinct+class+of+neutrophils+in+systemic+autoimmunity.">Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity.</a> Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis.">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li><li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis.">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2013).</li><li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress.">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li><li>Monti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-dependent+cell+adhesion+to+neutrophil+extracellular+traps+through+engagement+of+fibronectin+in+neutrophil-like+cells.">Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells.</a> Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).</li><li>Najmeh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+via+beta1-integrin+mediated+interactions.">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions.</a> International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).</li><li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+Human+Neutrophil+Extracellular+Traps+(NETs)+Isolation+and+Handling.">Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li><li>Kanamaru, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+density+neutrophils+(LDN)+in+postoperative+abdominal+cavity+assist+the+peritoneal+recurrence+through+the+production+of+neutrophil+extracellular+traps+(NETs).">Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).</li><li>Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+transgenic+for+the+human+CGM6+gene+express+its+product,+the+granulocyte+marker+CD66b,+exclusively+in+granulocytes.">Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes.</a> Blood. 91 (2), 663-672 (1998).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps.">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).</li></ol>

Estudos anteriores relataram que circulam células tumorais pode ser presa por substratos NET na vivo10,11. Células de câncer de mama metastático foram mostradas para estimular os neutrófilos e induzir a formação de redes, que auxilia no crescimento de células de tumor no órgão alvo17. Além disso, nós encontramos que a curto prazo culturas de LDN de fluido de lavagem pós-operatória produziam enormes redes que poderiam...

Os neutrófilos nucleares polimorfo, na circulação de sangue normalmente são separados de células mononucleares através do método de preparação de gradiente de densidade. No entanto, alguns neutrófilos conhecidos como neutrófilos baixa densidade (LDN), com fenótipos CD11b(+), CD15(+), CD16(+) e CD14(-), são co purificados com células mononucleares. O número relativo de LDN aumenta significativamente em diversas condições patológicas, incluindo doenças auto-imunes,1,2, sepse3e câncer4,5. Estudos anteriores mostraram que LDN são uma classe fenotipicamente e funcionalmente distinta de neutrófilos6. Deve notar-se que LDN na circulação de sangue são mais propensos a produzir neutrófilos armadilhas extracelulares (redes) do que a densidade normal neutrófilos2,7. As redes são estruturas semelhantes a web compostas de ácidos nucleicos, histonas, proteases e proteínas cytosolic e granulares, e eficientemente podem enganar e destruir patógenos8.
Recentemente, as redes foram mostradas para capturar não só os micróbios, mas também plaquetas e circulantes de células de tumor que podem ajudar no trombo formação9 e tumor metástases10,11. No entanto, os mecanismos moleculares por trás as interações adesivas entre redes e plaquetas ou células tumorais são ainda pouco claras. Mais recentemente, um ensaio de adesão em vitro revelou que células de leucemia mieloide (K56212) e células de carcinoma de pulmão (A54913) anexar a redes através de integrinas β1 e β3. Os autores utilizaram NET ações isoladas de neutrófilos e ativado pelo phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) como o substrato de adesão14. Embora este ensaio permite a detecção de interações reais com componentes líquidos na ausência de neutrófilos, é discutível se a "célula livre circulante líquido" isolados por centrifugação de alta velocidade mantém a estrutura molecular idêntica à redes produzidas em vivo. Recentemente, encontramos o líquido de lavagem peritoneal após cirurgia abdominal continha muitos LDN maduro, que gerou enormes redes e anexado às células de tumor causando metástases peritoneais15. Neste estudo, analisámos com sucesso a adesão das células tumorais para redes intactas sem qualquer manipulação física. Aqui, nós mostramos detalhes de uma técnica para detectar interações adesivas entre redes e células tumorais livre.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare, SWEDEN</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StraightFrom&#8482; Whole Blood CD66b MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-104-913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Rinsing Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-041-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Magnetic Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>P9691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluent C</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>CGLDIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)</td>
			<td>nacalai tesque, Japan</td>
			<td>06894-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions</td>
			<td>gibco by life technologies, Mexico</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin lyophilized powder, &#8805;96% (agarose gel electrophoresis)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies Japan</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin Prophylactic</td>
			<td>InvivoGen, San Diego, CA-USA</td>
			<td>ant-mpp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington, Lakewood NJ)</td>
			<td>LS002138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well</td>
			<td>IWAKI, Japan</td>
			<td>4810-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well</td>
			<td>IWAKI, Japan</td>
			<td>4820-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescein stereomicroscope</td>
			<td>BX8000, Keyence, Osaka Japan</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole view cell observation system</td>
			<td>Nikon, Kanagawa, Japan</td>
			<td>BioStudio (BS-M10)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MKN45 human gastric cancer cell line</td>
			<td>Riken, Tukuba Japan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NUGC-4 human gastric cancer cell line</td>
			<td>Riken, Tukuba Japan</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCUM-1 human gastric cancer cell line</td>
			<td>Osaka City University, Japan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Gift from Dr. M.Yashiro</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutrophil extracellular traps generated by low density neutrophils obtained from peritoneal lavage fluid mediate tumor cell growth and attachment

Ativado os neutrófilos liberação dos neutrófilos extracelular armadilhas (redes), que podem capturar e destruir micróbios. Estudos recentes sugerem que as redes estão envolvidas em vários processos de doença, tais como metástases de tumor, trombose e doenças auto-imunes. Aqui, nós mostramos uma técnica detalhada em vitro para detectar atividade NET durante a captura de células de tumor gratuito, que crescem após a ligação a redes. Primeiramente, coletamos neutrófilos de baixa densidade (LDN) de líquido de lavagem peritoneal no pós-operatório de pacientes que se submeteram a laparotomias. Cultivo a curto prazo da LDN resultou na maciça formação líquida que foi visualizada com verde fluorescente nuclear e corante de contraste do cromossomo. Após a incubação co de linhas de células de câncer gástrico humano MKN45, OCUM-1 e NUGC-4 com as redes, muitas células de tumor foram aprisionadas por redes. Posteriormente, o acessório foi totalmente revogado pela degradação de redes com DNase I. tempo-lapso vídeo revelou que células tumorais capturadas pelas redes não morreu, mas em vez disso, cresceu vigorosamente em uma cultura contínua. Esses métodos podem ser aplicados para a detecção de adesivas interações entre redes e vários tipos de células e materiais.

Na cultura de 2 horas, LDN CD66b(+), derivado de estruturas de sequência mostrou fluido de lavagem peritoneal corados com corante verde-fluorescente para nuclear e cromossomo (figura 1B), enquanto CD66b(-) células mononucleares não fizeram (Figura 1). No entanto, quando as culturas LDN foram pré-tratados com 100 U/mL DNase, a estrutura característica era destruído (Figura 1), indicando que eles...

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Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Aqui, apresentamos um método no qual neutrófilos baixa densidade humanos (LDN), recuperados do líquido de lavagem peritoneal pós-operatórias, produzem maciço dos neutrófilos extracelulares armadilhas (redes) em armadilha eficientemente as células do tumor gratuito que crescem posteriormente.

Neutrófilos armadilhas extracelulares geradas pela baixa densidade neutrófilos obtidos de fluido de lavagem Peritoneal mediato fixação e crescimento de células de Tumor

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

Ensaio de recrutamento de células de Tumor de pulmão

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Pesquisa do câncer

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murino Experimental Modelo de desenvolvimento do tumor original e Peritoneal Metástase<em&gt; via</em&gt; Ortotópico injetar células do ovário Carcinoma

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

Deteção de alta sensibilidade de Micrometastases gerado pelo Organoids GFP de Lentivirus-transfectadas cultivadas de um Tumor de cólon derivado de paciente

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Imagem latente da viver-pilha ensaios de migração de células-tronco do estudo Glioblastoma cerebral Tumor e invasão

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Modelos de xenoenxertos Ortotópicos derivados do paciente para Carcinoma de células urotelial humana e crescimento do tumor do câncer colorretal e metástase espontânea

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

Transferência de neutrophils tumor-associados manipulados em ratos do tumor-rolamento para estudar seu potencial angiogênico em vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Um Modelo de Camundongo para Investigar o Papel de Fibroblastos Associados ao Câncer no Crescimento Tumoral

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Protocolo automatizado de dissecção para enriquecimento de tumores em tecidos de baixo teor de tumores

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...