Name: micropuncture of bowman's space in mice facilitated by 2 photon microscopy
Uploaded: 2018-10-11T14:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy at JoVE.com

NIDDKK08 DK090754 到每小时研究院P41 GM103493 到RDS。该材料是由波特兰退伍军人事务医疗中心的资源和设施所支持的工作成果 (按 MPH)。内容不代表美国退伍军人事务部或美国政府的意见。

本文所述的所有程序均由俄勒冈州健康 & 科学大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 用于演示的安装程序
<ol><li>使用直立式2光子显微镜、3轴级控制器、探头/移液器支架以及用于探头/移液架的3轴控制器;所有四项都是必需的。 注意: 许多类似的设置是可用的, 只要有独立的定量3轴控制移液器和显微镜的阶段, 就足够了, 并为体内直立成像建立了显微镜。</li>
</ol>2. 启动实验规程前所需的材料
<ol><li>使用 FITC-葡聚糖, 200万 Da, 5% 溶液在生理盐水或磷酸盐缓冲盐水眶注射标记肾血管。这种分子量 (MW) 被选择, 因为它留在血管和不过滤。</li>
	<li>机拉硼硅酸盐玻璃微: 使用长锥度、闭合尖端设置 (例如,热量 = 610、速度 = 150、时间 = 250 ms、环路) 将微拉至6–10µm 尖端。斜面到45°和火焰抛光轻。</li>
	<li>微的量子点涂层: 根据所引用的协议, 带有量子点的涂层微量吸管提示。12
</li>
	<li>聚硅氧烷肾脏支架/垫片。使用聚硅氧烷腻子制作肾脏支架/垫片。时尚 a 1 x 1 厘米2由5毫米厚的直角菱形 (即截断立方体) 从聚硅氧烷腻子。将聚硅氧烷的中间70% 从一条边移除, 并由菱形中心约70% 的圆组成。使聚硅氧烷干燥24小时。参见图 1。</li>
	<li>显微注射仪制备: 预填聚乙烯 (PE)-50 管和微量吸管加载的微量吸管支架与油的长度。如果进行质谱分析, 则需要对眼, 否则可能使用矿物油。设置显微注射仪与气密汉密尔顿型注射器和填充对眼。这将连接到 PE-50 管和移液器支架。</li>
	<li>将移液器放在移液器支架中, 然后将 PE-50 管和移液器装入, 然后将 PE-50 管的近端连接到充满油的汉密尔顿注射器, 从而创建从移液器到注射器的液压系统。</li>
</ol>3. 侧移液器通过一种新的手术方法进入液体成像柱下方的肾脏
注:图 1显示了成像支持系统和手术准备的组装。描述的过程是对 C57BL/6 小鼠进行 20–25 g。
<ol><li>称量鼠标。</li>
	<li>采用4% 异氟醚诱导麻醉, 在空气/氧混合物中保持1.5–2.5% 异氟醚。通过缺乏对疼痛刺激和降低呼吸速率的反应, 确认鼠标被麻醉。</li>
	<li>润滑眼睛, 在底板上放置动物的侧面。使用胶带固定4肢。</li>
	<li>注射生理盐水, 200 µL, 皮下注射, 并放置直肠温度探头。在手术期间使用加热灯控制温度, 在成像过程中加热垫。</li>
	<li>使用脱毛膏去除鼠标左侧的所有毛发。</li>
	<li>找到脾脏, 这是可见的在皮肤下, 并找到左肾在背部和骶侧的脾脏。</li>
	<li>在皮肤上做一个0.5 厘米的切口, 在腹膜的小切口, 只是足够的肾脏推动通过容易。</li>
	<li>用温和的压力挤压肾脏。放置肾脏稳定剂形式与聚硅氧烷围绕肾脏和修复与氰基丙烯酸酯粘合剂。用垫片将肾脏排成一行, 这样, 肾脏的外侧大部分表面就会超过稳定器1毫米。</li>
	<li>用胶水将头板固定在稳定器的形状上, 安装在底板上的安装杆上。</li>
	<li>用1% 琼脂糖溶液将肾脏周围的聚硅氧烷支架填满, 并将10毫米盖玻片放在顶部并保持, 直到琼脂糖牢固。用胶水将盖玻片密封到头板上, 并用牙科水泥在玻片周围创建环。</li>
	<li>注射 FITC-葡聚糖 (200万 Da, 5% 溶液, 100–150µL) 复古轨道, 快速将鼠标和固定板移动到2光子显微镜阶段, 保持麻醉并确保在显微镜阶段充分清除废气。</li>
</ol>4. 选择合适的肾小球和移液器进入鲍曼的空间
<ol><li>
定义：
	<ol>
<li>在屏幕上将 X 定义为左-右, 面向显微镜</li>
		<li>从舞台控制器读取 SX (阶段 X)</li>
		<li>在移液器表盘控制器上定义 PX 为移液器 X</li>
		<li>在屏幕上定义 Y 并向显微镜方向前进, 回到2光子设置</li>
		<li>将 z 定义到天花板上, 向下朝向地面, 并以目标 Z 位置在舞台上测量。</li>
		<li>定义 S (O) Z 作为舞台 (真正的目标) 高度。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
找到肾脏的表面, 使用绿色荧光蛋白 (GFP) 过滤器设置在眼中识别。由于注射 FITC-葡聚糖, 脉管将是明亮的绿色。
	<ol>
<li>确定合适的肾小球。使用眼部识别肾脏表面后, 切换到2光子 (非扫描模式) 并探索成像窗口。微穿刺的有利特性如下: 盖玻片 > 30 µm 以下垂直距离 (防止移液器与盖玻片在进入过程中发生碰撞) 和侧向肾脏胶囊到肾小球 < 400 的侧向距离µm (超出此距离, 移液器的偏差可能增加小姐的可能性)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>记录侧向和垂直距离到穿刺点, 肾脏胶囊上的点直接指向肾小球的移液端。</li>
	<li>将目标焦点提升到水柱中, 保持 x 和 y 级坐标不变, 距离仅为一厘米。</li>
	<li>将移液头插入水柱, 打开 4 '、6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) 激发。将移液器的 x 和 y 尺寸移动到尖端的最大荧光点, 这将是目标的中心。没有这种精确的 prepositioning, 在眼中找到移液器是困难的。由于量子点荧光在相同的 (在这种情况下, 红色) 波长无论激发波长, DAPI 激发产生红色荧光, 这是紧密聚焦在尖端, 如图 2所示。</li>
	<li>将激发设置更改为红色荧光蛋白 (RFP), 并将眼中的移液器可视化, 然后在眼视图中精确居中。</li>
	<li>切换到2光子, 并在2光子下找到移液器, 将其精确地放置在图像的中心。这是注册位置。</li>
	<li>保存移液器的图像。</li>
	<li>注册舞台和微量吸管控制器坐标。 注意: 使用补充的. html 文件, 它将使用 JavaScript 代码执行计算 (在没有安装电子表格软件的系统上有利) 或电子表格来计算阶段和移液器坐标之间的偏移, 并计算移液器控制器的目标坐标。</li>
	<li>从 x 轴的水柱中取出移液器, 使 z 和 y 保持相同。</li>
	<li>将移液器 z 移至靶肾小球 z (即,将移液器向下移至盖玻片下方的 Z 方向)</li>
	<li>将移液器 y 移动到目标肾小球 y 坐标。</li>
	<li>将2光子实时视图移动到目标肾小球 Z, 然后移至肾脏边缘并记下 SX。</li>
	<li>使用从注册 SX 的偏移量计算肾脏边缘 PX。</li>
	<li>向移液器 (增加 SX) 移动舞台, 使肾脏的边缘远到屏幕的左侧, 但仍可见。</li>
	<li>将移液器快速推进至约100µm 小于上面计算的肾脏边缘 PX。</li>
	<li>找到移液头, 缓慢推进移液器。增加红色增益并观察红色像素直方图 (由于量子点和非目标荧光的极端亮度, 在窗口中的移液器被成像之前, 像素分布会发生变化)。</li>
	<li>在活的2光子成像下前进到肾脏边缘。 注意: 在进入肾脏胶囊之前, 可以重定向移液器在 Y 和 Z 尺寸。但是, 这可能会破坏移液器尖端。更保守的措施, 如果移液器是关闭目标, 是撤回在 x 维度高达2厘米, 重定向, 然后返回到肾脏边缘的 x 维度。一旦移液器在组织内, 除 X 以外的任何轴上的运动导致移液管屈曲, 这需要很大的经验来使用, 并且经常导致破损。</li>
	<li>将移液器在 X 轴中缓慢地驱动到据为己有目标 PX, 保持对 SX 的关注。(偶尔回到肾小球, 看看它是否在所有微量吸管的插入时都发生了改变)。</li>
	<li>当您处于正确的位置时, 使用 z 堆栈来记录位置。 注意: 随着微量吸管到位, 药物, 蛋白质, 或荧光示踪剂可能被注射, 流体可以吸气为以后的分析, 或压力或电荷相对于另一个电极可能被测量。</li>
</ol>5. 鲍曼空间中流体的吸入
<ol><li>设置微泵在2分钟内注射 100 nL 对眼, 以确保移液器通畅, 并减少进入过程中移液管堵塞的混淆。重新映像以确保移液器位置。</li>
	<li>等待4–6分钟进行额外过滤。</li>
	<li>设置微泵以高达 50 nl/分钟的速率吸出高达 300 nl。 注意: 肾小球形态学改变不以此速率观察, 表明它不会改变在吸入过程中液体的传递速率。由于没有像传统的微穿刺的油块, 恢复这个体积, 必要的质谱, 可能包括一些注入 perflourodecalin 和可能管状流体。对于离子敏感电极测量荧光光谱仪、聚合酶链反应和其他敏感端点的检测, 可以使用较低的体积。如果质谱不是终点, 矿物油和标准微穿刺技术可以用来测量吸气量在储存之前。</li>
	<li>图像再次。</li>
	<li>取出移液器并保存样品, 在分析前添加三缓冲液并存储在80°c。</li>
	<li>使用过量的异氟醚或其他经批准的方法安乐死鼠标。 注: 滤液通过从肾小球毛细血管过滤进入空间。在小鼠的单保留肾单位肾小球滤过率 (SNGFR) 报告 8–14 nL/分钟.3的斯塔林部队治理 SNGFR, 但在鲍曼的空间负静水压可能增加 SNGFR。标准微穿刺方法使用管状封锁与油和中性压力的管状流体取样, 然而这些化合物干扰质谱 (见下文);因此, 在这种技术中, 早期的近端小管仍然是专利。此外, 在吸尘时, 鲍曼的空间包含了一个未知的, 但正容积的滤液。因此, 液体吸入率可能超过 SNGFR。 注意: 在这里描述的实验中, 目的是通过 nanoproteomic 技术获得比常规肾小球滤液更大的样本来进行质谱分析。由于使用质谱法排除使用矿物油或蜡的油块 (减少信号的有机分子的复杂混合物: 质谱中的噪声) 对眼用于填充微量吸管和注射器。Perflourodecalin 不知道阻止管状流, 但在生物惰性和不干扰质谱。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schnermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncture+analysis+of+tubuloglomerular+feedback+regulation+in+transgenic+mice.">Micropuncture analysis of tubuloglomerular feedback regulation in transgenic mice.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (12), 2614-2619 (1999).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncture+of+the+kidney:+a+primer+on+techniques.">Micropuncture of the kidney: a primer on techniques.</a> Comprehensive Physiology. 2 (1), 621-637 (2012).</li><li>Vallon, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncturing+the+nephron.">Micropuncturing the nephron.</a> Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 458 (1), 189-201 (2009).</li><li>Perrien, D. 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D., Zhao, R., Moore, R. J., Clair, G., Ansong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+mass+limited+tissue+samples+for+spatially+resolved+tissue+profiling.">Quantitative proteomic analysis of mass limited tissue samples for spatially resolved tissue profiling.</a> Methods in Molecular Biology. , (2017).</li><li>Yi, L., Piehowski, P. D., Shi, T., Smith, R. D., Qian, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+microscale+separations+towards+nanoproteomics+applications.">Advances in microscale separations towards nanoproteomics applications.</a> Journal of Chromatography A. 1523, 40-48 (2017).</li><li>Clair, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially-resolved+proteomics:+Rapid+quantitative+analysis+of+laser+capture+microdissected+alveolar+tissue+samples.">Spatially-resolved proteomics: Rapid quantitative analysis of laser capture microdissected alveolar tissue samples.</a> Scientific Reports. 6, 39223 (2016).</li><li>Huang, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNaPP:+Simplified+nanoproteomics+platform+for+reproducible+global+proteomic+analysis+of+nanogram+protein+quantities.">SNaPP: Simplified nanoproteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities.</a> Endocrinology. 157 (3), 1307-1314 (2016).</li><li>Andrasfalvy, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-based+multiphoton+fluorescent+pipettes+for+targeted+neuronal+electrophysiology.">Quantum dot-based multiphoton fluorescent pipettes for targeted neuronal electrophysiology.</a> Nature Methods. 11 (12), 1237-1241 (2014).</li><li>Huang, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNaPP:+Simplified+nano-proteomics+platform+for+reproducible+global+proteomic+analysis+of+nanogram+protein+quantities.">SNaPP: Simplified nano-proteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities.</a> Endocrinology. 157 (3), (2016).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263 (4 Pt 2), F601-F606 (1992).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+glomerular+permeability+of+fluorescent+macromolecules+using+2-photon+microscopy+in+Munich+Wistar+rats.">Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li><li>Sandoval, R. M., Kennedy, M. D., Low, P. S., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+trafficking+of+fluorescent+conjugates+of+folic+acid+in+intact+kidney+determined+using+intravital+two-photon+microscopy.">Uptake and trafficking of fluorescent conjugates of folic acid in intact kidney determined using intravital two-photon microscopy.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 287 (2), C517-C526 (2004).</li><li>Salmon, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+endothelial+glycocalyx+links+albuminuria+and+vascular+dysfunction.">Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (8), 1339-1350 (2012).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

我们提出了一个方法来访问鲍曼的小鼠非表面肾小球的空间, 通过2光子显微镜的帮助。我们开发了这个程序来解决肾小球微穿刺的一个关键限制, 在小鼠1光子显微镜下可寻址的表面肾小球的稀有性, 为了促进实验目标, 从鲍曼的空间中吸取流体的渴望后续分析。这项技术的发展和实践有赖于六个关键步骤。首先, 必须仔细地进行新的手术准备, 使成像水柱不会从盖玻片上脱落, 而在肾脏的范围内, 这是移液器的目标。其次, 用于微穿刺的玻璃移液器必须在2光子显微镜下可见, 这是使用量子点完成的。第三, 立体定向技术需要精确定位在鲍曼的空间的移液器在三维度, 在肾脏表面下高达100µm。因此, 注册移液器的坐标系和精确的阶段是关键步骤。第四, 仔细选择目标肾小球是必要的, 以确保它是可供移液器不受肾脏支持结构和成像柱的冲击。最后, 必须仔细考虑采取的分析步骤, 以遵循采集程序, 流体样品的采集量和时间必须与分析和肾小球生理学相匹配。
我们设计了一种可扩展到许多分析的采集程序, 包括传统的微穿刺端点, 例如火焰光度法、离子敏感电极测量或压力、体积或电荷测量。此外, 我们相信这项技术将适用于新的分析终点, 包括聚合酶链反应 (可能跟随 miRNA 的反转转录) 和质谱下游的代谢组学。用于促进质谱的特殊修改值得进一步讨论, 它们也施加一些限制。首先, 虽然质谱是高度敏感的, 微穿刺样本的低蛋白质含量和体积使蛋白质分析在常规蛋白质组探索的动态范围之下, 因此简化 nanoproteomics必要。8,13秒为了优化早期检测的蛋白质产量, 我们确定了 200-300 nL 的吸液是必要的, 但对于这个体积的全新滤液采集, 如果鼠标 GFR 仅为 8-14 nL, 则可能需要长达20分钟的吸入。/分钟3。随着哉和小管显示, 长时间的吸入改变了早期近端小管液的白蛋白含量14, 我们选择吸6分钟以上;然而, 这意味着我们的吸入率超过滤液流入率。在设计工作流程时, 鼓励用户在实验系统中考虑肾小球过滤的生理学。质谱是一种敏感的技术, 它会被引进的石油馏分 (如矿物油) 的信号所淹没, 微穿刺通常用于保留肾单位的吸水和隔离段的液压系统。因此, 我们不能将矿物油用于此目的, 或它的其他共同用途, 量化纳升范围样品的体积。相反, 我们用生物惰性的对眼填充系统, 不干扰质谱, 具有良好的光学特性。我们相信对眼所施加的限制是可以克服的, 并正在研究更多的技术创新, 我们预计将允许测量样品体积和管状段的封锁。
大多数微穿刺的研究都是在慕尼黑大鼠身上进行的, 它显示了表面肾小球的增加, 但由于基本的丧失, 这大大限制了管状运输和其他肾脏生理学的生理研究。分子生物学工具, 转基因小鼠2,3。由于它便于微量吸管访问鲍曼的小鼠空间, 因此新的技术可以减轻这些严重的局限性。我们采用这种技术, 以获得肾脏滤液的蛋白质组研究使用高灵敏度质谱法, 称为 nanoproteomics9。但是, 可能还有其他应用程序。例如, 使用2光子显微术15、16、17的荧光示踪剂, 大大帮助过滤蛋白的肾脏生理学研究。添加微穿刺到2光子显微镜提供了使用荧光分子进行单保留肾单位生理研究的可能性, 允许相邻的, 非注入 nephrons 作为控制。希望这一明确的解释, 必要的步骤将允许广泛采用的实验室已经配备了2光子显微镜和/或微穿刺。虽然它是复杂的, 我们现在已经执行这个过程很多次, 这里提出的改进代表了一个稳定的生理发现平台。

该程序的目的是提供常规微穿刺访问鲍曼的空间和其他肾小球结构的小鼠。微穿刺对肾脏生理学的研究仅限于1光子显微镜, 它只能在肾脏表面的几微米内成像, 并且在 z 维度上提供了有限的精度。由于小鼠表面的肾小球很少, 因此在1光子显微镜下找不到表面肾小球是不可能的, 因此大多数微穿刺的研究都是在慕尼黑大鼠身上进行的, 其中有更多的表面肾小球。因此, 在小鼠模型中工作的好处在微穿刺研究中被限制在1,2,3。成像技术的最新进展, 包括显微 CT4、5、纳米粒子成像6和成像质谱仪7大大提高了适用于肾小球生理学的模式范围, 但微穿刺提供的干预和样品的独特能力仍然无法替代。因此, 使用此处提供的技术扩展微穿刺的使用有望促进新的肾脏生理学研究, 特别是对肾脏滤液 (即代谢组学) 的含量和基本生理学的评价。转基因小鼠, 如滤液压力和电荷的测量, 以前只在大鼠身上进行。
在这项技术中, 使用2光子显微镜可以可视化和微量吸管访问肾脏结构高达约100µm 肾囊下。因此, 多 (5–10) 的肾小球可供微穿刺在每个小鼠肾脏迄今成像。虽然该技术与传统的肾脏微穿刺有一定的特点, 但它是设计出来的, 需要从传统的技术进行广泛的修改。在本协议中, 我们展示了从鲍曼的空间中吸取流体的渴望, 并显示了随后的分析与质谱 (nanoproteomics)8、9、10、11的例子结果。质谱的下游使用需要专门的样品制备工作流程, 这里也展示了这一点。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright 2 photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 7MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 axis microscope stage controller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 axis headstage controller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 2000 kDa MW</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52471-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary tubes</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B150-110-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dots, 605 nm</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q21701MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysiloxane</td>
			<td>Sugru</td>
			<td>No cat number</td>
			<td>www.sugru.com, &#34;original formula&#34;. Any color.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-50 tubing</td>
			<td>Instech Labs</td>
			<td>BTPE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>WPI</td>
			<td>UMP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector controller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Micro4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluorodecalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>306-94-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip, 10 mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>64-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>Custom</td>
			<td>No part number</td>
			<td>Common in neuroscience labs, many suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head fixation device</td>
			<td>Custom</td>
			<td>No part number</td>
			<td>Common in neuroscience labs, many suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needle</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>125393</td>
			<td>For retroorbital injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin syringe</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>309626</td>
			<td>For retroorbital injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micropuncture of bowman's space in mice facilitated by 2 photon microscopy

肾脏微穿刺和肾脏 2-光子成像是肾脏生理学的精技术。然而, 微穿刺是有限的依赖于传统显微学的表面保留肾单位特征, 和2光子研究是有限的干预只能在器官, 而不是保留肾单位水平评估。特别是小鼠肾小球的微穿刺研究受到小鼠表面肾小球缺乏的挑战。为了解决这一局限性, 为了研究从鲍曼的空间在小鼠生理模型中的吸液, 我们开发了2光子肾小球微穿刺。我们提出一种新的手术准备, 允许横向访问肾脏, 同时保留所需的垂直成像柱2光子显微镜。高分子量的荧光素异硫氰酸酯 (FITC)-葡聚糖的施用用于呈现肾脏血管, 因此2光子成像可见的肾小球。然后在立体定向指导下引入一个量子点涂层移液器, 将其从几个到许多, 在成像窗口中进行可视化。在本协议中, 我们提供了执行该程序所需的准备、材料和方法的详细信息。这项技术促进了以前不可能的肾脏生理学研究, 包括从鲍曼的空间和保留肾单位的所有部分的成像深度限制, 约100µm 在肾囊下恢复滤液。压力、电荷和流量均可使用引入的移液器进行测量。在这里, 我们提供从鲍曼的空间抽吸液相色谱/质谱的代表性数据。我们期望这种技术在肾脏生理调查中具有广泛的适用性。

这个过程需要一个独特的外科准备的肾脏2光子成像和访问, 如图 1所示。此处所示的制备方法可使垂直成像柱与肾脏上的目标进行少量密度变化, 以实现2光子显微术的最佳光学, 同时对移液器进行横向访问, 仅在水平方向上驱动 (x维度.肾部分挤压可防止肾蒂的过度张力, 并保留血管流, 并建立一个自定义肾脏支持的两个目标的成像和访问。在这个过程中的第二个挑战是精确定位在肾脏内的移液器在3维度, 这需要注册移液器和舞台坐标系。图 2给出了这个过程的关键步骤, 显示了在 DAPI 激发下2光子显微镜的水柱中被发现的移液器。在进入肾脏之前, 进入水柱并将移液器的坐标注册到阶段, 这对于在目标鲍曼的空间中实现移液管的精确立体定向定位至关重要。移液器从右侧进入成像水列。DAPI 激发开启后, 红色量子点涂层移液器在红橙色荧光明亮, 并且可以在目标的中间仔细定位。当激励光束穿过目标中心时, 移液器可以自由移动到最大荧光点, 确保它在目镜中可见。
正确的移液器拉拔和肾小球选择对于本协议的成功至关重要, 如图 3、 图 4、 图 5所示。在图 3A中, 可以看到在该过程的移液器注册部分中, 在流体柱上成像的微量吸管的红色荧光量子点涂层玻璃。笔尖的宽度为6微米。在图 3B中, 显示了一个12µm 尖端的吸液吸管。这种移液器不能穿透肾囊, 而不会造成血管损伤由于12µm 直径和不规则的尖端表面 (注意在斜面顶部的刺)。在图 3C和3D中, 显示了最佳定位而不是目标肾小球成像的重要性。图 3C所示的美丽的近表面肾小球显示了良好的成像 (由于它的表面位置在肾囊下20µm), 但不适合通过此程序访问, 因为它太接近表面, 和移液器会击中盖玻片。在图 3D中, 显示了最佳定位的肾小球。注意用于说明两个肾小球的不同比例 (比例尺都是50µm)。由于深度引起的折射, 这些肾小球显得不那么尖锐;这个图像被拍摄在70µm 肾囊下。侧肾边缘250µm 右侧, 使两个这些肾小球可得。在访问过程中, 成像被紧紧地聚焦在目标肾小球如图 4, 并使用每秒图像采集, 允许调查人员精确地观察移液器在鲍曼的空间的位置。
图 4展示了一个典型的肾脏进入和结果, 在鲍曼的空间内的移液头。在图 4A中, 使用正交视图的 z 栈的平均强度投影演示了鲍曼空间中的移液器尖端。请注意, 由于尖端的锥形部分设置的量子点具有极明亮的荧光, 因此有红色移液头光谱伪影 (圆形荧光球)。在图 4B中, z 栈数据的体积投影演示了鲍曼空间中的另一个移液器。请注意, 移液器将鲍曼的胶囊拖入进入旅行的方向, 根据协议中所述, 在笔尖后面创建明显的隆起。
在图 5中, 一个失败过程的结果显示, 在肾囊中有太大开口的移液器破裂, 导致出血。移液器太钝;在试图通过肾脏胶囊, 胶囊被推到移液头之前, 直到破损发生。在这张图中, 肾囊可见, subcaspular 出血增强, 在 FITC 荧光绿。FITC 信号在移液器本身内可见, 表明在压力下的血液进入移液管腔。箭头指向许多在移液腔内可见的红细胞, 作为 FITC-葡聚糖的填充缺陷。
图 6描述了从鲍曼的空间吸液, 小鼠尿蛋白 17 (MUP17) 获得的代表性质谱。最后,表 1展示了成功的抽吸程序的示例结果, 列出了使用纳米级质谱测定的蛋白质在6分钟内从3只小鼠收集的吸液。在每种情况下, 移液器被成像, 因为它被撤回从鲍曼的空间, 没有 FITC 荧光在鲍曼的空间或移液管腔中观察到, 表明缺乏与等离子体的吸血污染。17蛋白质, 主要是低分子量, 从至少2唯一的肽每蛋白质确定。光谱计数低, 符合先前的蛋白质在肾小球滤液中的估计, 和已知的过滤蛋白, 如维生素 D 结合蛋白 (VTDB), 白蛋白 (大奖赛) 和主要尿蛋白 17 (MUP17) 存在。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig1.jpg"> 图 1: 肾脏的部分挤压与自定义支持和固定的横向访问.在左侧, 显示成像柱和肾脏支持的部分, 并在中心的完整装配。在右侧, 肾脏准备显示前 (上) 和后 (下面) 的支持的应用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig2.jpg"> 图 2: 完成的肾脏准备在移液器注册步骤的协议.在这里, DAPI 激发被用来定位微量吸管在2光子显微镜的水柱内。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig3.jpg"> 图 3: 注射 FITC-葡聚糖后移液器和肾脏的成像, 为微穿刺显示合适和不合适的肾小球.a.带6µm 尖端的拉拔式移液器。粗刃的钝尖。C.这个肾小球是明确定义的, 但太接近盖玻片的微穿刺。D.适当定位的肾小球。比例尺均为50µm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的更大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig4.jpg"> 图 4: 成功的移液器通道导致从2个不同的程序放置在鲍曼的空间视图中。带正交投影的 Z 型叠层显示了鲍曼的移液头与肾小球簇相邻的位置。比例尺为50µm. z 栈中的体积渲染同样演示了鲍曼的空间中的移液器与肾小球簇相邻。比例尺为100µm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig4large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig5.jpg"> 图 5: 一个不成功的过程由于钝移液器, 撕裂肾囊和导致出血到移液管腔.FITC 荧光从淤血血浆和红细胞 (箭头) 在移液器内可见。箭头指向在移液管腔内可见的红色血细胞。比例尺为50µm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig5large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig6.jpg"> 图 6: 主要尿蛋白 17 (MUP17) 的质谱, 从纳米级液相色谱/质谱分析中获得鲍曼的空间抽吸.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig6large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>蛋白</td>
			<td>MW (kD)</td>
			<td>平均频谱计数</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTA_MOUSE</td>
			<td>42</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB_MOUSE</td>
			<td>42</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CLPX_MOUSE</td>
			<td>69</td>
			<td>2。5</td>
		</tr>
<tr>
<td>DHSA_MOUSE</td>
			<td>73</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>FOLR2_MOUSE</td>
			<td>29</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>GBLP_MOUSE</td>
			<td>35</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>ALBU_MOUSE</td>
			<td>66</td>
			<td>6。7</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBA_MOUSE</td>
			<td>15</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBB1_MOUSE</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MIB1_MOUSE</td>
			<td>110</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MUP17_MOUSE</td>
			<td>21</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>PERI_MOUSE</td>
			<td>54</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNAS4_MOUSE</td>
			<td>17</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>SPTB1_MOUSE</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>VIME_MOUSE</td>
			<td>54</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>VTDB_MOUSE</td>
			<td>53</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 从3只小鼠的鲍曼空间吸出的蛋白质列表。
补充视频 1: 在鲍曼的空间中定位移液器后获得的 z 栈的体积渲染演示了在空间内的移液器尖端, 毗邻毛细管簇.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/0128a-3dview03162018-3.avi">请点击这里下载此文件.</a>

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Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

微穿刺2光子显微镜辅助小鼠鲍曼空间的研究

我们目前使用2光子显微术在鲍曼的小鼠泌尿空间内放置一个微量吸管, 结合2个肾脏生理学的基础技术。使用2光子显微术克服了传统显微术微穿刺肾脏生理学研究的关键局限性。

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...

该技术可以帮助回答单肾生理学的关键问题，包括全身蛋白和代谢物的球状过滤率及其对管状生理学的贡献。这种微假技术的主要优点是，它允许进入鲍曼的空间和所有小鼠的皮质肾素。通常，对此方法的新的个人会很难，因为它需要正确执行准备步骤。在确认对手趾捏没有反应后，对眼睛涂抹软膏，并使用胶带固定20至25克成年小鼠的四肢。使用脱毛霜去除动物左侧的所有头发，并使用脾脏通过脾脏的后侧和乳条侧的皮肤定位左肾。在皮肤上做一个0.5厘米的切口，然后是小切口在小的切口，只是足够大的肾脏被推通过。用温和的压力挤压肾脏，并在组织周围放置聚硅氧烷肾脏稳定剂。将肾脏与垫片连接，使肾脏的侧表面超出稳定器约一毫米，用氰丙烯酸酯粘合剂将肾脏固定到形态上。将头板粘附到稳定器形状上，然后将头板安装到底板上的安装杆上。接下来，用百分之一的加糖溶液填充聚硅氧烷支撑中的井，并在形态顶部保持 10 毫米盖滑，直到加糖牢固。用胶水将盖滑密封在头板上，用牙科水泥在盖滑周围形成一个环。然后以再轨道向100至150微升的飞合体-德克斯特兰注入，并快速将鼠标和固定板移到双光子显微镜阶段。手动聚焦肾脏表面后，切换到非扫描双光子模式，并探索成像窗口，以定位比盖滑下方 30 微米且从横向肾胶囊小于 400 微米的目标球状体。记录与目标球的横向和垂直距离。然后记录球状的 x、y 和 z 级坐标。最后，在不更改 x 和 y 级坐标的情况下，将目标焦点提升约一毫米到水柱中。将移液器尖端驱动到水柱中，然后打开 DAPI 激励。将 x 和 y 尺寸中的移液器移动到尖端最大荧光点。这将是目标的中心。将 x 引文设置更改为红色荧光蛋白，用眼部可视化移液器，以便精确定位在眼视中。切换回双光子，在实时双光子视图下查找移液器，并精确地将尖端放在图像的中心，这是注册位置。然后保存移液器的图像并注册舞台和微移液器控制器坐标。在不移动 y 轴和 z 轴的情况下，从 x 轴中的水柱上拆下移液器，将移液器 z 移动到目标球状 z 坐标和肾脏边缘。注意阶段 x 并使用注册阶段 x 的偏移量计算肾边缘移液器 x。增加舞台 x 以向移液器移动舞台，直到肾脏边缘远到屏幕左侧，同时保持可见。快速推进移液器到约100微米远离肾边缘移液器X刚刚计算。增加红色增益，开始在实时双光子成像下缓慢地将移液器尖端推进到肾边缘，同时监控红色像素直方图。将 x 轴中的移液器缓慢地驱动到球状目标移液器 x，并留意舞台 x。到达球状体后，使用 z 堆栈记录位置。移液器就位后，将微泵设置为在两分钟内注入 100 纳米光的全氟二甲酸素。确保移液器的分时性，并减少进入过程中移液器堵塞的混淆。经过4至6分钟的过滤后，将微型泵设置为以每分钟高达50纳米光的速度吸气多达300纳米升。这个美丽的，接近表面球状显示有利的成像由于表面位置的球状在20微米以下的肾胶囊。然而，由于移液器会击中盖滑，球状体离表面太近，不能进行微注射。这些球状体的最佳定位与横向边缘250微米的权利，并显得不那么尖锐，因为他们的折射造成的70微米深从胶囊。这两个因素，使球状可访问。在这个典型的肾脏入口图像中，来自具有正交视图的 z 堆栈的均强度投影揭示了鲍曼空间内的移液器尖端，请注意来自位于尖端锥形部分的量子点极亮荧光的红色移液器尖端光谱伪影。在这里，在鲍曼空间中定位移液器后获得的 z 堆栈的体积渲染显示了与毛细管塔夫特相对的空间内的移液器尖端。如果使用开口太大的移液器，肾胶囊可能会破裂，导致次帽出血和血液进入移液管流明。使用这种方法，从每个蛋白质至少两种独特的肽中鉴定出17种蛋白质，主要是低分子量。结合这种方法，其他方法，如测量，离子敏感电极测量，荧光抗体注射可用于回答有关发光溶解剂在管状和球状生理学中的作用的问题。

Research

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Biology

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