Name: micropuncture of bowman's space in mice facilitated by 2 photon microscopy
Uploaded: 2018-10-11T14:00:00
Duration: 7 min 37 s
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNaPP:+Simplified+nano-proteomics+platform+for+reproducible+global+proteomic+analysis+of+nanogram+protein+quantities.">SNaPP: Simplified nano-proteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities.</a> Endocrinology. 157 (3), (2016).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263 (4 Pt 2), F601-F606 (1992).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. 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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

हम चूहों में गैर सतह glomeruli के बोमन अंतरिक्ष का उपयोग करने के लिए एक विधि पेश करते हैं, 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सुविधा. हम इस प्रक्रिया को विकसित करने के लिए glomerular micropuncture की एक प्रमुख सीमा का पता, सतह glomeruli के दुर्लभ वस्तु 1-चूहों में फोटॉन माइक्रोस्कोपी, क्रम में एक प्रयोगात्मक उद्देश्य की सुविधा के लिए, है बोमन अंतरिक्ष से द्रव की आकांक्षा बाद में विश्लेषण । विकास और इस तकनीक का अभ्यास छह महत्वपूर्ण कदम पर टिकी हुई है । सबसे पहले, उपंयास शल्य तैयारी सावधानी से किया जाना चाहिए ताकि इमेजिंग पानी स्तंभ बंद coverslip और coverslip गुर्दे के क्षेत्र में फैली हुई है जो पिपेट का लक्ष्य है पर नहीं चलता है । दूसरा, कांच micropuncture के लिए इस्तेमाल पिपेट 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी, जो क्वांटम डॉट्स का उपयोग कर पूरा किया जाता है के लिए दृश्यमान होना चाहिए । तीसरे, स्टीरियोटैक्टिक तकनीक को ठीक तीन आयामों में है बोमन अंतरिक्ष में एक पिपेट की स्थिति के लिए आवश्यक है, ऊपर १०० µm गुर्दे की सतह के नीचे । इसलिए, पिपेट और परिशुद्धता के साथ मंच के समंवय प्रणालियों पंजीकरण महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । चौथा, सावधान लक्ष्य glomerulus के चयन यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि यह गुर्दे की सहायता संरचना और इमेजिंग कॉलम द्वारा भिडंत के बिना पिपेट के लिए सुलभ है । अंत में, सावधान विचार विश्लेषणात्मक कदम के लिए अधिग्रहण की प्रक्रिया का पालन करने के लिए दिया जाना चाहिए, और मात्रा और तरल पदार्थ के नमूने के अधिग्रहण के समय विश्लेषण और glomerular फिजियोलॉजी के लिए मिलान किया जाना चाहिए ।
हम एक अधिग्रहण प्रक्रिया है कि पारंपरिक micropuncture अंतिमबिंदु, जैसे लौ photometry, आयन के प्रति संवेदनशील इलेक्ट्रोड माप, या दबाव, मात्रा या शुल्क की माप सहित कई विश्लेषण करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है बनाया है । इसके अतिरिक्त, हमें विश्वास है कि इस तकनीक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया सहित विश्लेषणात्मक अंतिमबिंदु के लिए उत्तरदायी होगा (शायद miRNA के लिए रिवर्स प्रतिलेखन के बाद) और जन स्पेक्ट्रोमेट्री के metabolomics बहाव. विशेष को जन स्पेक्ट्रोमेट्री की सुविधा के लिए कार्यरत संशोधनों अतिरिक्त चर्चा के लायक है, और वे कुछ सीमाएं लागू । सबसे पहले, हालांकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री अति संवेदनशील है, कम प्रोटीन सामग्री और micropuncture नमूनों की मात्रा पारंपरिक proteomic अंवेषण के गतिशील रेंज के नीचे प्रोटीन का विश्लेषण प्रदान करता है, और इसलिए सरलीकृत nanoproteomics थे आवश्यक. 8 , 13 दूसरा, जल्दी परख के लिए प्रोटीन उपज का अनुकूलन, हम निर्धारित किया है कि महाप्राण के 200-300 nL आवश्यक था, लेकिन de नोवो इस खंड के अधिग्रहण की आवश्यकता होती है शायद के रूप में आकांक्षा के 20 मिनट के रूप में लंबे समय के रूप में अगर माउस GFR केवल 8-14 है nL लैंडलाइंस3. के रूप में तोजो और Endou का प्रदर्शन किया है कि लंबे समय तक आकांक्षा जल्दी समीपस्थ tubule द्रव14की एल्ब्युमिन सामग्री बदल, हम 6 मिनट से अधिक महाप्राण के लिए चुने गए; लेकिन इसका मतलब यह है कि हमारी आकांक्षा दर निस्पंदन प्रवाह की दर से अधिक है । इस प्रक्रिया के उपयोगकर्ताओं को उनके कार्यप्रवाह डिजाइनिंग में उनके प्रायोगिक प्रणाली में glomerular निस्पंदन के फिजियोलॉजी पर विचार करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है । मास स्पेक्ट्रोमेट्री, एक संवेदनशील तकनीक, खनिज तेल, जो सामांयतः micropuncture में प्रयोग किया जाता है आकांक्षा और nephron के क्षेत्रों को अलग करने के लिए हाइड्रोलिक प्रणाली शामिल करने के रूप में एक शुरू की पेट्रोलियम आसुत से संकेत से अभिभूत हो जाएगा । इसलिए, हम इस प्रयोजन के लिए खनिज तेल का उपयोग नहीं, या इसके अंय आम उपयोग करते हैं, nanoliter रेंज के नमूनों की मात्रा का ठहराव सकता है । इसके बजाय हम perfluorodecalin जो जैविक रूप से निष्क्रिय है के साथ प्रणाली को भरने, जन स्पेक्ट्रोमेट्री परेशान नहीं करता है, और अनुकूल ऑप्टिकल विशेषताओं है । हमारा मानना है कि perfluorodecalin द्वारा लगाई गई सीमाएं दुर्गम हैं और अतिरिक्त तकनीकी नवाचारों पर काम कर रहे हैं जो हमें उम्मीद है कि नमूना मात्रा और ट्यूबलर खंड की नाकेबंदी का माप होगा ।
सबसे micropuncture अध्ययन ंयूनिख-Wistar चूहों, जो सतह glomeruli की संख्या में वृद्धि का प्रदर्शन में प्रदर्शन किया गया है, लेकिन यह बहुत सीमित ट्यूबलर परिवहन और अंय गुर्दे फिजियोलॉजी के शारीरिक अध्ययन क्योंकि मौलिक के नुकसान की आण्विक जीवविज्ञान के उपकरण, ट्रांसजेनिक2चूहों,3। क्योंकि यह चूहों में बोमन अंतरिक्ष के लिए micropipette पहुंच की सुविधा, उपंयास तकनीक इसलिए इन महत्वपूर्ण सीमाओं का शमन । हम nanoproteomics9के रूप में जाना उच्च संवेदनशीलता जन स्पेक्ट्रोमेट्री, का उपयोग कर proteomic अध्ययन के लिए गुर्दे निस्पंदन उपयोग करने के क्रम में इस तकनीक को अपनाया । हालांकि, संभव है कि अतिरिक्त अनुप्रयोग हैं । उदाहरण के लिए, फ़िल्टर किए गए प्रोटीन के गुर्दे शारीरिक अध्ययन बहुत 2 के साथ फ्लोरोसेंट अनुरेखक के उपयोग से सहायता प्राप्त किया गया है-फोटॉन माइक्रोस्कोपी15,16,17. micropuncture के अलावा 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट अणुओं के साथ एकल-nephron शारीरिक अध्ययन प्रदर्शन की संभावना प्रदान करता है, पड़ोसी की अनुमति, गैर इंजेक्शन बिगडते नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए । यह आशा व्यक्त की है कि आवश्यक कदम के इस स्पष्ट विवरण पहले से ही 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी और/micropuncture के लिए सुसज्जित प्रयोगशालाओं में व्यापक गोद लेने की अनुमति देगा । हालांकि यह जटिल है, हम अब इस प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है कई बार और शोधन प्रस्तुत यहां शारीरिक खोज के लिए एक स्थिर मंच का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

इस प्रक्रिया का उद्देश्य है बोमन अंतरिक्ष और चूहों में अन्य glomerular संरचनाओं के लिए नियमित micropuncture पहुँच प्रदान करना है. गुर्दे शरीर क्रिया विज्ञान के लिए Micropuncture अध्ययन 1-फोटॉन माइक्रोस्कोपी करने के लिए सीमित किया गया है, जो केवल गुर्दे की सतह के कुछ माइक्रोन के भीतर छवि कर सकते हैं, और जो z-आयाम में सीमित परिशुद्धता प्रदान करता है. क्योंकि चूहों कुछ सतह glomeruli है, यह हमेशा संभव नहीं है एक सतह glomerulus द्वारा खोजने के लिए 1-फोटॉन माइक्रोस्कोपी, इसलिए सबसे micropuncture अध्ययन किया गया है ंयूनिख-Wistar चूहों, जो और अधिक कई सतह glomeruli है. इसलिए, माउस मॉडल में काम करने का लाभ micropuncture अध्ययन1,2,3में सीमित किया गया है । इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में हाल ही में अग्रिमों, माइक्रो सीटी सहित4,5, nanoparticle इमेजिंग6, और इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री7 बहुत glomerular फिजियोलॉजी के लिए लागू मोडलों की सीमा को बढ़ाया है, लेकिन वहां अद्वितीय हस्तक्षेप करने की क्षमता और नमूना है कि micropuncture प्रदान करता है के लिए कोई विकल्प नहीं है । इसलिए micropuncture के उपयोग का विस्तार यहां प्रस्तुत तकनीकों का उपयोग करने के लिए उपंयास गुर्दे फिजियोलॉजी अध्ययन की सुविधा की उंमीद है, विशेष रूप से, गुर्दे निस्पंदन की सामग्री का मूल्यांकन (यानी, metabolomics) और बुनियादी शरीर क्रिया विज्ञान के ट्रांसजेनिक चूहों, ऐसे छानने का दबाव और आरोप की माप के रूप में, पहले ही चूहों में प्रदर्शन किया.
इस तकनीक में, 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के प्रयोग से गुर्दे की कैप्सूल नीचे के बारे में १०० µm करने के लिए गुर्दा संरचनाओं के लिए दृश्य और micropipette का उपयोग की अनुमति देता है । एकाधिक (5-10) glomeruli इसलिए हर माउस गुर्दे इस प्रकार अब तक छवि में micropuncture के लिए सुलभ हैं । हालांकि यह तकनीक पारंपरिक गुर्दे micropuncture के साथ कुछ सुविधाओं के शेयरों, यह de नोवो और पारंपरिक तकनीक से व्यापक संशोधनों के डिजाइन किया गया है की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल में हम है बोमन अंतरिक्ष और शो मास स्पेक्ट्रोमेट्री (nanoproteomics)8,9,10,11के साथ बाद विश्लेषण के उदाहरण के परिणाम से द्रव की आकांक्षा का प्रदर्शन । जन स्पेक्ट्रोमेट्री के बहाव का उपयोग एक विशेष नमूना तैयारी कार्यप्रवाह है, जो भी यहां का प्रदर्शन किया है की आवश्यकता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright 2 photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 7MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 axis microscope stage controller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 axis headstage controller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 2000 kDa MW</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52471-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary tubes</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B150-110-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dots, 605 nm</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q21701MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysiloxane</td>
			<td>Sugru</td>
			<td>No cat number</td>
			<td>www.sugru.com, &#34;original formula&#34;. Any color.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-50 tubing</td>
			<td>Instech Labs</td>
			<td>BTPE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>WPI</td>
			<td>UMP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector controller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Micro4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluorodecalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>306-94-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip, 10 mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>64-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>Custom</td>
			<td>No part number</td>
			<td>Common in neuroscience labs, many suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head fixation device</td>
			<td>Custom</td>
			<td>No part number</td>
			<td>Common in neuroscience labs, many suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needle</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>125393</td>
			<td>For retroorbital injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin syringe</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>309626</td>
			<td>For retroorbital injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micropuncture of bowman's space in mice facilitated by 2 photon microscopy

गुर्दे micropuncture और गुर्दे 2-फोटॉन इमेजिंग गुर्दे शरीर क्रिया विज्ञान में लाभदायक तकनीक हैं । हालांकि, micropuncture पारंपरिक माइक्रोस्कोपी पर निर्भरता nephron सुविधाओं की सतह के लिए सीमित है, और 2-फोटॉन अध्ययन में सीमित है कि हस्तक्षेप केवल अंग पर मूल्यांकन किया जा सकता है, बजाय nephron स्तर । विशेष रूप से चूहों के glomeruli के micropuncture अध्ययनों को चूहों में सतह glomeruli की धनाभाव से चुनौती दी गई है. इस सीमा का पता करने के लिए माउस शारीरिक मॉडल में है बोमन अंतरिक्ष से महाप्राण के अध्ययन का पीछा करने के लिए, हम 2 विकसित-फोटॉन glomerular micropuncture । हम 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक ऊर्ध्वाधर इमेजिंग कॉलम के संरक्षण, जबकि गुर्दे के लिए पार्श्व का उपयोग की अनुमति देता है कि एक उपंयास शल्य तैयारी प्रस्तुत करते हैं । उच्च आणविक भार fluorescein isothiocyanate (FITC) के प्रशासन-dextran गुर्दे vasculature और इसलिए 2-glomeruli इमेजिंग के लिए दिखाई फोटॉन प्रदान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक क्वांटम डॉट लेपित पिपेट तो स्टीरियोटैक्टिक मार्गदर्शन के तहत एक कई जो इमेजिंग विंडो के भीतर visualized किया जा सकता है कई से चयनित glomerulus के लिए शुरू की है । इस प्रोटोकॉल में, हम तैयारी, सामग्री, और प्रक्रिया को पूरा करने के लिए आवश्यक तरीकों का विवरण प्रदान करते हैं । इस तकनीक के पहले-असंभव शारीरिक अध्ययन की सुविधा, बोमन की अंतरिक्ष से निस्पंदन की वसूली सहित और इमेजिंग गहराई सीमा के भीतर nephron के सभी क्षेत्रों, गुर्दे कैप्सूल के बारे में १०० µm के नीचे. दबाव, चार्ज और प्रवाह सभी शुरू पिपेट का उपयोग कर मापा जा सकता है । यहां, हम तरल क्रोमैटोग्राफी/जन स्पेक्ट्रोमेट्री से प्रतिनिधि डेटा प्रदान करते है बोमन अंतरिक्ष से महाप्राण पर प्रदर्शन किया । हम इस तकनीक गुर्दे शारीरिक जांच में व्यापक प्रयोज्यता की उंमीद है ।

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Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

चूहों में बोमन अंतरिक्ष के Micropuncture 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सुविधा

हम 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के उपयोग के लिए चूहों में बोमन मूत्र अंतरिक्ष के भीतर एक micropipette जगह है, गुर्दे शरीर क्रिया विज्ञान के 2 मूलभूत तकनीकों के संयोजन. 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग micropuncture गुर्दे फिजियोलॉजी अध्ययन के लिए पारंपरिक माइक्रोस्कोपी की महत्वपूर्ण सीमाओं पर काबू ।

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...

यह तकनीक एकल-नेफ्रॉन फिजियोलॉजी पर महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है, जिसमें प्रणालीगत प्रोटीन और मेटाबोलाइट्स की ग्लोमेरुलर निस्पंदन दर और ट्यूबलर फिजियोलॉजी में उनके योगदान शामिल हैं। इस माइक्रोपंच्चर तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह सभी चूहों में बोमन के अंतरिक्ष और कॉर्टिकल नेफ्रॉन तक पहुंच की अनुमति देता है। आम तौर पर, इस विधि के लिए नए व्यक्ति संघर्ष करेंगे क्योंकि इसके लिए सही ढंग से निष्पादित तैयारी चरणों की आवश्यकता होती है।पैर की अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के बाद, आंखों पर मरहम लागू करें और टेप का उपयोग करने के लिए एक 20 से 25 ग्राम वयस्क माउस के चरम स्थिर । जानवर के बाईं ओर बालों के सभी को हटाने के लिए एक डिपिलेटरी क्रीम का उपयोग करें, और तिल्ली के पृष्ठीय और कौडल पक्ष पर त्वचा के माध्यम से बाईं किडनी का पता लगाने के लिए तिल्ली का उपयोग करें। त्वचा में 0.5 सेंटीमीटर चीरा बनाएं, इसके बाद पेरिटोनम में एक छोटे चीरा के बाद गुर्दे को धक्का दिया जा सके।कोमल दबाव के साथ गुर्दे को बाहर निकालें और ऊतक के चारों ओर एक पॉलीसिलोक्सेन किडनी स्टेबलाइजर फॉर्म रखें। स्पेसर के साथ किडनी को लाइन करें ताकि किडनी की पार्श्व सतह स्टेबलाइजर से परे लगभग एक मिलीमीटर तक फैली हो, और किडनी को साइनोएक्रिलेट चिपकने के साथ फॉर्म में ठीक करे । स्टेबलाइजर फॉर्म में हेड प्लेट को गोंद करें और बेस प्लेट पर बढ़ते सलाखों के लिए हेड प्लेट को माउंट करें।इसके बाद, एक प्रतिशत एगर उठे समाधान के साथ पॉलीसिलोक्सेन समर्थन में अच्छी तरह से भरें और फॉर्म के शीर्ष पर 10 मिलीमीटर कवर स्लिप पकड़ें जब तक कि एगर उठे फर्म न हो जाएं। कवर स्लिप को गोंद के साथ हेड प्लेट में सील करें और डेंटल सीमेंट के साथ कवर स्लिप के चारों ओर एक रिंग बनाएं। फिर फिटसी-डेक्सट्रान रेट्रो-ऑर्बिटली के 100 से 150 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें और जल्दी से माउस और फिक्सेशन प्लेट को दो फोटॉन माइक्रोस्कोप चरण में ले जाएं।मैन्युअल रूप से गुर्दे की सतह पर ध्यान केंद्रित करने के बाद, गैर-स्कैनिंग दो-फोटॉन मोड पर स्विच करें और एक लक्ष्य ग्लोबरुलस का पता लगाने के लिए इमेजिंग विंडो का पता लगाएं जो कवर स्लिप के नीचे 30 माइक्रोमीटर से अधिक है और पार्श्व किडनी कैप्सूल से 400 माइक्रोमीटर से कम है। लक्ष्य ग्लोमेरुलस के लिए पार्श्व और ऊर्ध्वाधर दूरी रिकॉर्ड करें। फिर ग्लोमेरुलस के लिए एक्स, वाई और जेड चरण निर्देशांक रिकॉर्ड करें।और अंत में, एक्स और वाई चरण निर्देशांक को बदले बिना पानी के कॉलम में एक मिलीमीटर के बारे में उद्देश्य केंद्र बिंदु उठाएं। पिपेट टिप को पानी के कॉलम में ड्राइव करें और डीएपीआई एक्सिटेशन चालू करें। एक्स और वाई आयामों में पिपेट को टिप के अधिकतम फ्लोरेसेंस के बिंदु पर ले जाएं।यह उद्देश्य का केंद्र होगा। एक्स प्रशस्ति पत्र सेटिंग को लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन में बदलें और नेत्र दृश्य में सटीक केंद्रित होने की अनुमति देने के लिए ऑक्यूलर के साथ पिपेट की कल्पना करें। लाइव दो-फोटॉन दृश्य के तहत पिपेट खोजने के लिए दो-फोटॉन पर वापस स्विच करें और टिप को छवि के केंद्र में ठीक रखें, यह पंजीकरण की स्थिति है।फिर पिपेट की एक छवि को सहेजें और चरण को पंजीकृत करें और माइक्रोपिपेट नियंत्रक निर्देशांक। वाई और जेड-एक्सिस को स्थानांतरित किए बिना एक्स-एक्सिस में पानी के कॉलम से पिपेट निकालें और पिपेट जेड को लक्ष्य ग्लोमेरुलस जेड-समन्वय और गुर्दे के किनारे पर ले जाएं। स्टेज एक्स पर ध्यान दें और पंजीकरण चरण एक्स से ऑफसेट का उपयोग करके किडनी एज पिपेट एक्स की गणना करें।स्टेज एक्स को बढ़ाएं जब तक कि गुर्दे का किनारा स्क्रीन के बाईं ओर न हो जाए, जबकि दिखाई न दे। जल्दी से पिपेट को गुर्दे के किनारे पिपेट एक्स से दूर लगभग 100 माइक्रोमीटर तक आगे बढ़ाया जाए। लाल लाभ बढ़ाएं और लाल पिक्सेल हिस्टोग्राम की निगरानी करते हुए लाइव टू-फोटॉन इमेजिंग के तहत किडनी एज में धीरे-धीरे पिपेट टिप को आगे बढ़ाना शुरू करें।स्टेज एक्स पर नजर रखते हुए, ग्लोमेरुलस लक्ष्य पिपेट एक्स के लिए एक्स-एक्सिस में पिपेट को धीरे-धीरे ड्राइव करें। ग्लोमेरुलस तक पहुंचने पर, जेड-स्टैक के साथ स्थिति को दस्तावेज़ करें। स्थिति में पिपेट के साथ, माइक्रोपंप को दो मिनट से अधिक परफ्लोरोडेकलिन के 100 नैनोलीटर इंजेक्ट करने के लिए सेट करें।पिपेट की पेटेंसी सुनिश्चित करना, और प्रवेश के दौरान पिपेट प्लगिंग से भ्रमित को कम करना। चार से छह मिनट के छानने के बाद, माइक्रोपंप को प्रति मिनट ५० नैनोलीटर तक की दर से ३०० नैनोलीटर तक एस्पिरेट करने के लिए सेट करें । यह सुंदर, सतह के पास ग्लोमेरुलस गुर्दे कैप्सूल के नीचे 20 माइक्रोमीटर पर ग्लोमेरुलस की सतह की स्थिति के कारण अनुकूल इमेजिंग को दर्शाता है।ग्लोमेरुलस माइक्रोइंजेक्शन के लिए सतह के बहुत करीब है, हालांकि, पिपेट कवर स्लिप को टक्कर देगा। ये ग्लोमेरुली को पार्श्व किनारों के साथ बेहतर ढंग से तैनात किया जाता है 250 माइक्रोमीटर सही होते हैं और कैप्सूल से उनके 70 माइक्रोमीटर गहराई के कारण अपवर्तन के कारण कम तेज दिखाई देते हैं। दोनों कारक जो ग्लोमेरुली को सुलभ बनाते हैं।इस ठेठ गुर्दे की प्रविष्टि छवि में, ऑर्थोगोनल दृश्यों के साथ जेड-स्टैक से एक मतलब तीव्रता प्रक्षेपण बोमन के अंतरिक्ष के भीतर पिपेट टिप से पता चलता है, टिप के शंकु अनुभाग पर व्यवस्थित क्वांटम डॉट्स के बेहद उज्ज्वल फ्लोरेसेंस से लाल पिपेट टिप स्पेक्ट्रल विरूपण साक्ष्य पर ध्यान दें। यहां, बोमन के अंतरिक्ष में एक पिपेट की स्थिति के बाद अधिग्रहीत जेड-स्टैक से एक मात्रा प्रतिपादन, केशिका टफ्ट को abutting अंतरिक्ष के भीतर पिपेट टिप दिखाता है । यदि बहुत बड़े उद्घाटन के साथ एक पिपेट का उपयोग किया जाता है, तो गुर्दे का कैप्सूल सबकैप्सुलर रक्तस्राव और पिपेट ल्यूमेन में रक्त के प्रवेश के कारण टूट सकता है।इस विधि का उपयोग करते हुए, 17 प्रोटीन, मुख्य रूप से कम आणविक वजन के, प्रति प्रोटीन दो अद्वितीय पेप्टाइड्स की एक ंयूनतम से पहचान की गई है । इस विधि के साथ मिलकर, अन्य तरीकों जैसे कि मैस्पेक्ट्रोस्कोपी, आयन संवेदनशील इलेक्ट्रोड माप, और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी इंजेक्शन का उपयोग ट्यूबलर और ग्लोमेरुलर फिजियोलॉजी में ल्यूमिनल सॉल्यूट्स की भूमिका के बारे में सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

विच्छेदन और चूहे में परिधीय लिम्फ नोड्स के 2 फोटॉन इमेजिंग

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

माउस 2-photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग thymus के स्वस्थानी इमेजिंग में

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

Neocortex में रक्त प्रवाह का एक कपालीय खिड़की के माध्यम से 2 फोटॉन इमेजिंग के लिए एक विधि

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

Vivo फीट 2 फोटॉन परत में कैल्शियम इमेजिंग / 2 चूहे के 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

अस्थि मज्जा का सृजन 2 फोटॉन इमेजिंग में उपयोग के लिए murine वृक्ष के समान कोशिकाओं व्युत्पन्न

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

जी प्रोटीन रिसेप्टर युग्मित spectrally हल दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग सहभागिता के vivo मात्रा में

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

विषयेतर प्रोटीन एक लघु bispecific आत्मीयता टैग द्वारा सुविधा शोधन

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Confocal और Multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग पांच फ्लोरोसेंट प्रोटीन द्वारा चिह्नित hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की विवो Clonal ट्रैकिंग में

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

वयस्क माउस Calvarial अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के Vivo 4 आयामी ट्रैकिंग में

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

मलीय Glucocorticoid विश्लेषण: Equids में गैर-आक्रामक अधिवृक्क निगरानी

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...