Name: micropuncture of bowman's space in mice facilitated by 2 photon microscopy
Uploaded: 2018-10-11T14:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy at JoVE.com

NIDDKK08 DK090754 mph 日の出P41 GM103493 をRDSに。この材料は、資源に支えられた (MPH) 作業の結果と、ポートランド退役軍人医療センターの施設の使用。内容は、米国退役軍人局やアメリカ合衆国政府の見解を表していません。

ここ記載されているすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会のオレゴン健康及び科学大学によって承認されました。
1. セットアップのデモに使用
<ol><li>パッチアンプ用アダプター/ピペット ホルダー; ため直立 2 光子顕微鏡、3 軸ステージ コント ローラー、パッチアンプ用アダプター/ピペット ホルダーと 3 軸コント ローラーを使用します。これらのアイテムのすべての 4 つが必要です。 注: 多くの同様のセットアップは利用でき、ピペット顕微鏡ステージ独立の定量的な 3 軸制御があり、顕微鏡が生体内で直立したイメージング用に設定されている限りで十分です。</li>
</ol>2 実験的プロトコルを開始する前に必要な資料
<ol><li>FITC-デキストラン、2,000,000 Da 5% 食塩水または腎血管をマークする retroorbital 注射用リン酸緩衝生理食塩水ソリューションを使用します。それは血管に残っているし、フィルター処理を行いませんので、この分子量 (MW) が選択されます。</li>
	<li>マシンを引っ張ってホウケイ酸ガラス マイクロ ピペット: 先端は長いテーパー、閉じた設定を使用して 6-10 μ m の先端にマイクロ ピペットを引く (など熱 = 610、速度 = 150、時間 = 250 ms、ループ) マイクロ ピペットの引き手に。45 ° の面取りと軽く炎-ポーランド語。</li>
	<li>マイクロ ピペットの量子ドット コーティング: 参照先のプロトコルによると量子ドットを用いたマイクロ ピペット先端をコートします。12
</li>
	<li>ポリシロキサン腎臓サポート/スペーサー。腎臓サポート/スペーサーをクラフトするのにポリシロキサンのパテを使用します。ポリシロキサン パテから 5 mm 厚の直角菱形 (すなわち、切頂六面体) によってファッション 1 × 1 cm2 。1 つのエッジからポリシロキサンと、菱形の中心の約 70% を占める円の中間の 70% を削除します。24 h 乾燥するポリシロキサンを許可します。図 1を参照してください。</li>
	<li>マイクロインジェクター準備: オイルとポリエチレン (PE)-50 チューブ ・ ピペット装荷マイクロ ピペット ホルダーの長さを自動設定。質量分析法を計画すると、perfluorodecalin が必要な鉱物油を使用する場合がありますそれ以外の場合。気密ハミルトン型注射器と perfluorodecalin でいっぱいガラスシリンジを設定します。これは、PE 50 管、ピペット ホルダーに接続されます。</li>
	<li>ピペット ピペット ホルダーが、PE 50 チューブとピペットを記入し、前方 PE-50 のピペットから油圧システムを作成し、ハミルトンのオイル充填注射器にチューブ注射器への近位端に接続します。</li>
</ol>3. 横ピペット新規手術を介して列をイメージング流体下腎臓へ
注: イメージングのサポート システムと手術準備のアセンブリは、図 1に示すです。20-25 g の重量を量る c57bl/6 マウスで説明されている手順が実行されます。
<ol><li>マウスの重量を量る。</li>
	<li>4% イソフルランを用いた麻酔を誘導し、空気/酸素混合物で 1.5-2.5% イソフルランと維持します。痛みを伴う刺激, 呼吸数の減少への応答の不在によってマウスに麻酔がかかることを確認します。</li>
	<li>目を注油し、ベース プレートの横方向の動物を配置します。テープを使用して 4 四肢を固定します。</li>
	<li>200 μ L、通常生理食塩水を皮下注入し、直腸温度プローブを配置します。イメージング中に手術や加熱パッドの中に暖房ランプを使用して温度を制御します。</li>
	<li>脱毛クリームを使用してマウスの左側にあるすべての髪を削除します。</li>
	<li>皮膚の下に表示され、脾臓を検索し、脾臓背側および尾側左の腎臓を探します。</li>
	<li>皮膚に 0.5 cm の切開を行い、腹膜に小さな切開だけで十分な簡単にを介してプッシュする腎臓。</li>
	<li>穏やかな圧力で腎臓を押し出します。腎臓周辺シアノアクリ レート系接着剤で修正ポリシロキサンで作られた腎臓スタビライザー フォームを配置します。その腎臓の外側の表面を超えた安定器約 1 mm で、腎臓をスペーサーと並ぶ。</li>
	<li>接着剤で安定剤フォーム ヘッド プレートを修正し、ベース プレートにバーを取り付けにヘッド プレートをマウントします。</li>
	<li>1% のアガロース溶液が付いている腎臓を取り巻くポリシロキサン サポートの井戸を埋めるし、上 10 mm coverslip の場所 agarose がしっかりするまで保持します。接着剤で頭プレートに coverslip のシール、歯科用セメントと、coverslip の周りのリングを作成します。</li>
	<li>レトロな軌道 FITC デキストラン (2,000,000 Da、5% 溶液、100-150 μ L) を挿入して移動マウスと固定プレート 2 光子励起顕微鏡ステージに迅速に維持麻酔し十分な排ガス顕微鏡ステージ上清掃します。</li>
</ol>4. 適切な糸球体とボウマンのスペースにピペット アクセスの選択
<ol><li>
定義:
	<ol>
<li>画面の左から右と左-右顕微鏡に直面して X を定義します。</li>
		<li>ステージ コント ローラーから SX (ステージ X) を読む</li>
		<li>ピペット X としてピクセルを定義、ピペット ダイヤル コント ローラー</li>
		<li>画面の上下、顕微鏡と 2 光子セットアップの方へ進むと Y を定義します。</li>
		<li>床に向かってダウン天井に向かって Z とを定義し、目的の Z 位置をステージ上で測定します。</li>
		<li>ステージ (本当に目標) 高さとして S (O) Z を定義します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
腎臓、眼で緑色蛍光タンパク質 (GFP) のフィルター設定を使用して特定の画面を見つけます。FITC デキストラン注入による血管系は明るい緑色になります。
	<ol>
<li>適当な糸球体を識別します。眼を使用して腎臓の表面を識別した後 2 光子 (非走査モード) に切り替え、画像ウィンドウを探索します。それによって有利な特性は次のよう: 垂直距離、coverslip の下 > (アクセス中にピペットと coverslip の間の衝突を防ぐため) に 30 μ m と糸球体に横腎被膜からの距離を横 < 400μ m (この距離を超えてピペットの偏差がの可能性を高める欠場)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>レコード水平・垂直距離を穿刺するポイント、糸球体のピペット側に直接腎被膜上の点。</li>
	<li>X を維持、水の列に目的の焦点ポイントを上げるし、y ステージ座標そのまま、ちょうど約センチメートルの距離。</li>
	<li>水の列にピペット チップをドライブ、4', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) 励起入れます。X と y でピペットの先端の最大蛍光の点に寸法、これは目的の中心に移動します。この正確な大のせず眼のピペットを見つけることは難しいです。量子ドット励起波長に関係なく (この場合は、赤) で同じ波長を発するので、DAPI の励起は図 2に示す先端にしっかりと焦点を当てて赤い蛍光性を生成します。</li>
	<li>赤色けい光たんぱく質 (RFP) を励起設定を変更し、眼でピペットを可視化し、正確に眼のビューの中央に配置します。</li>
	<li>2 光子に切り替え、2 光子、画像の中央に正確に配置することの下でピペットを見つけます。登録ポジションです。</li>
	<li>ピペットのイメージを保存します。</li>
	<li>ステージとマイクロ ピペット コント ローラー座標を登録します。 注: ステージとピペットの座標間のオフセットを計算する JavaScript コード、(インストールされているスプレッドシート ソフトウェアを持っていないシステム上有利な) またはスプレッドシートを使用して計算を実行する補足の .html ファイルを使用して、ピペット コント ローラーのターゲット座標を計算します。</li>
	<li>X 軸、z と y を同じ維持で水柱からピペットを削除します。</li>
	<li>ピペット Z を Z (すなわち移動、coverslip 以下で Z 方向にダウン ピペット) ターゲット糸球体に移動します。</li>
	<li>ピペット Y をターゲット糸球体 Y 座標に移動します。</li>
	<li>Z 対象糸球体腎臓の端へと 2 光子ライブ ビューを移動し、SX に注意してください。</li>
	<li>腎臓エッジ登録 SX からのオフセットを使用してピクセルを計算します。</li>
	<li>腎臓の端がまだ目に見えるが、画面の左側にまでそのピペット (増加 SX) に向けた段階を移動します。</li>
	<li>ピクセル計算上腎臓端より約 100 μ m のピペットを迅速に進めます。</li>
	<li>ピペット チップ、ピペットをゆっくりと前進を探します。赤のゲインを上げるし、赤のピクセルのヒストグラム (ピクセル分布シフト ピペットの量子ドットとオフのターゲット蛍光の極端な明るさのための] ウィンドウでイメージを作成する前に) を見る。</li>
	<li>ライブの 2 光子励起イメージング下腎臓エッジに向かって前進します。 注: 腎カプセルに入ると、前にそれは Y および Z 次元でピペットをリダイレクトすることが可能です。ただし、これはピペット チップを破る可能性があります。保守的なメジャー ピペットがターゲット、オフの場合最大 2 cm、リダイレクト、X 次元に腎臓エッジに戻る X 次元に撤退することです。X 以外の任意の軸の運動はピペット屈曲する素晴らしい経験を必要とするに至るピペットは、組織内では、一度使用、および頻繁に破損につながる。</li>
	<li>X 軸にゆっくりとつかみなさいターゲット ピクセル、SX に目を光らせてするピペットをドライブします。(時折、マイクロ ピペットの挿入時に全然でシフトしているかどうか参照してくださいに糸球体に戻って便利です)。</li>
	<li>Z スタックでの文書の位置の正しい場所にできたら。 注: 場所に挿したと薬、蛋白質、または蛍光トレーサーを注射する、流体は、後で分析のため吸気可能性があります。 または圧力または別の電極を基準にして料金を測定することがあります。</li>
</ol>5. Bowman 腔からの吸引
<ol><li>設定 100 を注入するマイクロ ピペットの開存性を確保し、ピペットを入力中に差し込むから交絡を削減する perfluorodecalin 2 分以上の nL。ピペット位置を確実に減らせます。</li>
	<li>追加のろ過のための 4-6 分を待ちます。</li>
	<li>300 までを吸引するポンプを設定まで 50 nL/min の速度で nL。 注: 糸球体形態変化は認められないこのレートでは、吸引時にスペースに流体の配信レートは変更されませんを示唆しています。それによって従来のようにオイル ブロックはありませんが、質量分析法に必要なこのボリュームの回復は注入された perflourodecalin とおそらく尿細管液の一部を含めることができます。イオン感応電極測定蛍光分光法、ポリメラーゼの連鎖反応、およびその他の機密性の高いエンドポイントなどの試金、低いボリュームを使用する場合があります。質量がエンドポイントでない場合は、鉱油と標準それによって技術が格納される前に吸気量を測定する使用できます。</li>
	<li>もう一度イメージ。</li>
	<li>ピペットを撤回し、サンプル、TRIS バッファーを追加し、-80 ° 分析の前に保存を維持します。</li>
	<li>イソフルラン、またはその他の承認された方法の過剰摂取を使用してマウスを安楽死させます。 注: 濾液糸球体毛細血管からろ過してスペースに入ります。スターリング力支配 SNGFR、しかしと Bowman 腔に負の静水圧は、したがって、SNGFR を高める可能性があります、8-14 nL/分3間マウス単一腎糸球体濾過率 (SNGFR) が報告されます。しかし、これらの化合物は質量分析法 (下記参照) を妨げる、標準それによってメソッドは筒状の流動体のサンプリングのオイルと中立的な圧力、尿細管封鎖を使用します。したがって、この手法では、初期の近位尿細管は特許。さらに、吸引の時に、Bowman 腔には肯定的な濾液量が、未知が含まれています。そのため、流体の吸引率は、SNGFR を超える可能性があります。 注: ここで説明する実験、目標だったより大きいを取得する nanoproteomic を用いた質量分析のため糸球体濾液の通常のサンプルより。質量分析の使用鉱物油やワックス (質量分析法の信号: ノイズを低減する有機分子の複雑な混合物) でオイル ブロックの使用を排除するので、perfluorodecalin はマイクロ ピペットと注射器の塗りつぶしに使用します。Perflourodecalin 鋼管の流れをブロックする知られていないしかしは生物学的に不活性と質量と干渉しません。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schnermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncture+analysis+of+tubuloglomerular+feedback+regulation+in+transgenic+mice.">Micropuncture analysis of tubuloglomerular feedback regulation in transgenic mice.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (12), 2614-2619 (1999).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncture+of+the+kidney:+a+primer+on+techniques.">Micropuncture of the kidney: a primer on techniques.</a> Comprehensive Physiology. 2 (1), 621-637 (2012).</li><li>Vallon, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncturing+the+nephron.">Micropuncturing the nephron.</a> Pflugers Archive. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNaPP:+Simplified+nanoproteomics+platform+for+reproducible+global+proteomic+analysis+of+nanogram+protein+quantities.">SNaPP: Simplified nanoproteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities.</a> Endocrinology. 157 (3), 1307-1314 (2016).</li><li>Andrasfalvy, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-based+multiphoton+fluorescent+pipettes+for+targeted+neuronal+electrophysiology.">Quantum dot-based multiphoton fluorescent pipettes for targeted neuronal electrophysiology.</a> Nature Methods. 11 (12), 1237-1241 (2014).</li><li>Huang, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNaPP:+Simplified+nano-proteomics+platform+for+reproducible+global+proteomic+analysis+of+nanogram+protein+quantities.">SNaPP: Simplified nano-proteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities.</a> Endocrinology. 157 (3), (2016).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263 (4 Pt 2), F601-F606 (1992).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+glomerular+permeability+of+fluorescent+macromolecules+using+2-photon+microscopy+in+Munich+Wistar+rats.">Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li><li>Sandoval, R. M., Kennedy, M. D., Low, P. S., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+trafficking+of+fluorescent+conjugates+of+folic+acid+in+intact+kidney+determined+using+intravital+two-photon+microscopy.">Uptake and trafficking of fluorescent conjugates of folic acid in intact kidney determined using intravital two-photon microscopy.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 287 (2), C517-C526 (2004).</li><li>Salmon, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+endothelial+glycocalyx+links+albuminuria+and+vascular+dysfunction.">Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (8), 1339-1350 (2012).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

2 光子励起顕微鏡によって促進されるマウスの表面非糸球体ボウマンの空間にアクセスする手法を提案します。実験目的、ボーマンのスペースからの吸引を容易にするため糸球体のそれによって、表面糸球体マウス、1 光子励起顕微鏡によってアドレス指定可能の希少性の重要な制限に対処するためこの手順を開発しました。その後の分析。この手法の開発と実践にかかっている六つの重要なステップです。まず、新規手術準備遂行されなければならない慎重にイメージングの水柱、coverslip 実行されませんし、coverslip ピペットのターゲットである腎臓の領域にわたります。第二に、それによって使用ガラス ピペットは 2 光子励起顕微鏡、量子ドットを用いた達成されるの目に見えるレンダリングする必要があります。第三に、定位技術は、腎臓表面の下 100 μ m までの 3 つの次元で Bowman 腔にピペットを正確に配置する必要です。したがって、精度ピペットとステージの座標システムに登録する、重要なステップです。ターゲット糸球体の第四に、注意の選択は腎臓サポート構造およびイメージング列ごとに衝突することがなくピペットにアクセスできることを確認する必要は。最後に、取得手続きに従うこと分析の手順に注意深い考察を与えられなければならないし、分析し、糸球体の生理量と流体のサンプルの取得のタイミングを一致する必要があります。
フレーム光度法、イオン感応電極測定や圧力、ボリュームまたは電荷の測定などの伝統的なそれによってエンドポイントなど、多くの分析に拡張可能性があります取得手続きを考案しました。さらに、この手法はポリメラーゼの連鎖反応 (おそらく次のマイクロ Rna の逆転写) と下流をメタボロミクス解析、質量分析装置を含む分析の小説のエンドポイントに従うことが考えています。質量分析を容易にする為、特別な変更が追加の議論に値する、彼らはいくつかの制限を課します。まず、質量分析法は高感度、低たんぱくとそれによって試料の体積レンダリング、従来のプロテオミクス探査のダイナミック レンジの下の蛋白質の解析と簡易 nanoproteomics がいたためいる。8,13第二に、初期の試金のための蛋白質収量を最適化するには、我々 決定 200 300 nL の吸引が必要であったが、このボリュームのde novo濾液獲得マウス GFR は 8-14 nL のみ場合おそらく限り吸引 20 分必要と最低3。6 分以上の吸引を選んだ東上と遠藤は、初期の近位尿細管液14のアルブミン コンテンツを長時間吸引に変更を示した、しかしこれは私たち誤嚥発生率が濾液流入率を超えていることを意味します。この手順のユーザーは自分のワークフローを設計の実験的システムで糸球体濾過の生理を考慮を推奨します。質量分析法、機密性の高い技術は、穿刺用油圧システムを構成するネフロン セグメントを特定しそれによってで用いられる鉱物油などに導入された石油留分からの信号によって圧倒されるでしょう。したがって、我々 はこのために、鉱物油を使用できませんでしたまたはその他の一般的な使用、ナノリットル範囲サンプル量の定量化。代わりには生物学的に不活性、質量分析を妨害しませんし良好な光学特性を持つ perfluorodecalin とシステムを入力します。Perfluorodecalin によって課された制限は克服できる、我々 は試料量の測定と尿細管のセグメントの封鎖になります期待している追加の技術革新に取り組んでいると考えています。
それによって研究のほとんどは、基礎の損失のための表面糸球体数の増加が、鋼管輸送、その他腎生理学のこの大幅に制限された生理学的な研究を示すミュンヘン Wistar ラットで行われています。分子生物学、トランスジェニック マウス2,3のツールです。マウスで Bowman 腔にマイクロ ピペット アクセスを容易にするため新たな手法は従ってこれらの重要な制限を軽減します。プロテオーム研究 nanoproteomics9として知られている高感度質量分析法による腎の濾液をアクセスするためにこの手法を採用しました。ただし、可能性があります追加のアプリケーションがあります。たとえば、フィルター処理されたタンパク質の腎生理研究大幅に助けられたが蛍光トレーサーの使用 2 光子励起顕微鏡15,16,17。それによって 2 光子顕微鏡への追加は、単一ネフロン コントロールとして機能するネフロンを隣接、非注入を許可する、蛍光分子生理学的研究を実行する可能性を提供しています。必要な手順のこの明確な説明に既に 2 光子顕微鏡やそれによって装備のラボで幅広い採用をできることが望まれます。複雑ですが、我々 は今何度もこの手順を実行が、提示した改良は、生理学的発見のための安定したプラットフォームを表します。

この手順の目的は、Bowman 腔とマウスで他の糸球体の構造へのルーチンのそれによってアクセスを提供することです。それによって腎生理研究は、1 光子励起顕微鏡、z 次元の有限精度提供しており腎臓表面の数ミクロン単位でイメージすることができますのみに限られています。マウスはいくつかの表面の糸球体であるため、1 光子励起顕微鏡による表面糸球体を見つけることは可能常には、従ってそれによって研究のほとんどを行ったミュンヘン Wistar 系ラットより多くの表面の糸球体があるの。したがって、マウス モデルでの作業の利点がそれによって研究1,2,3限定されていました。イメージング技術、マイクロ CT4,5などの最近の進歩6、イメージングとイメージング質量分析7はナノ粒子を大幅に拡充モダリティ糸球体の生理学に適用可能な範囲が一意の代替残っていない能力を介入し、それによってのサンプルを提供します。新規腎生理研究、特に、(すなわちメタボロミクス) 腎濾液の内容と基本的な生理学の評価を容易にする期待は、従ってそれによってここで紹介する手法を使用しての使用を拡張します。濾液圧と、電荷の測定などのトランスジェニック マウスは以前ラットでのみ実行します。
この手法では、2 光子励起顕微鏡を使用は、腎被膜下可視化と約 100 μ m までの腎の構造へのマイクロ ピペットをできます。複数 (5-10) 糸球体、したがってこれまでのイメージを作成すべてのマウスの腎臓でそれによってにアクセスできません。ただし、この手法は、従来の腎それによってといくつかの機能を共有、設計・ デ ・ ノボ従来手法から大幅な変更が必要。このプロトコルでは、Bowman 腔からの吸引を示すし、質量分析法 (nanoproteomics)8,9,10,11とその後の分析の結果の例を示します。質量分析計の下流工程で使用も紹介は特殊なサンプル準備作業のワークフローが必要です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright 2 photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 7MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 axis microscope stage controller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 axis headstage controller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 2000 kDa MW</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52471-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary tubes</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B150-110-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dots, 605 nm</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q21701MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysiloxane</td>
			<td>Sugru</td>
			<td>No cat number</td>
			<td>www.sugru.com, &#34;original formula&#34;. Any color.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-50 tubing</td>
			<td>Instech Labs</td>
			<td>BTPE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>WPI</td>
			<td>UMP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector controller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Micro4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluorodecalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>306-94-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip, 10 mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>64-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>Custom</td>
			<td>No part number</td>
			<td>Common in neuroscience labs, many suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head fixation device</td>
			<td>Custom</td>
			<td>No part number</td>
			<td>Common in neuroscience labs, many suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needle</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>125393</td>
			<td>For retroorbital injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin syringe</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>309626</td>
			<td>For retroorbital injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micropuncture of bowman's space in mice facilitated by 2 photon microscopy

それによって腎と腎の 2 光子励起イメージングには、腎生理種子技術。しかし、それによって、表面ネフロンの機能を従来の顕微鏡への依存によって制限、2 光子の研究は、介入は、ネフロンのレベルではなく、臓器にのみ評価できます。特に、マウスの糸球体のそれによって研究はマウスの表面糸球体の不足によって挑戦されました。マウスの生理学的モデルで Bowman 腔から吸引の研究を追求するためにこのような制限に対処する 2 光子それによって糸球体を開発しました。2 光子の顕微鏡検査のための必要な垂直画像列を維持しながら腎臓に横方向のアクセスを許可する新規の手術の準備を提案します。高分子量かに (FITC) の管理-デキストランを腎血管とそのため糸球体の 2 光子励起イメージングの表示をレンダリングに使用します。画像ウィンドウ内で視覚化が可能多くをいくつかから選択されている球体に定位の指導の下で量子ドット コーティング ピペットを導入しています。このプロトコルでは、準備や材料の調達の手順を実行に必要なメソッドの詳細を提供します。この手法は、Bowman 腔から濾液の回収および腎腎被膜下約 100 μ m、深さ制限イメージ内のすべてのセグメントを含む、腎臓の以前不可能な生理学的な研究を促進します。圧力、料金、流れすべて測定される導入のピペットを使用しています。ここでは、我々 は Bowman 腔から吸引に対して液体クロマトグラフィー/質量分析から代表的なデータを提供します。腎の生理学的な調査で広い適用性を持っているこの技術を見込んでいます。

この手順では、2 光子イメージング、図 1で示されているアクセスの腎臓のユニークな手術の準備を必要です。ここに示すこの準備により、水平 (x のみで駆動、ピペットの横のアクセスと同時に 2 光子励起顕微鏡用最適光学系での密度変更点が付いている腎臓の上の目的で縦画像) 寸法。腎臓の部分的な押出腎茎の余分な張力を防ぎ血流を保持し、カスタム腎臓サポートの構築により、イメージングおよびアクセスの 2 つの目的。この手順では、2 番目の課題は、ピペット ピペットと段階の座標系の登録を必要とする 3 つの次元で腎臓内の正確な位置決めです。このプロセスの重要なステップはに示す図 2、DAPI 励起下における 2 光子顕微鏡の水柱で発見されているピペットを表わす。水の列に入ると腎臓に入る前の段階のそれらにピペットの座標を登録するターゲット Bowman 腔内ピペットの正確な定位位置決めできるように重要です。ピペットは、右からイメージングの水の列を入力します。DAPI の励起がオンになって、赤オレンジ色で明るい蛍光を発する赤色量子ドット コーティング ピペットと目的の中間の下で慎重に配置できます。励起光は、対物レンズの中心を通る、最大蛍光、接眼レンズに表示されることを確認のポイントにピペットを自由に移動可能性があります。
適切なピペットを引っ張ると糸球体の選択は、図 3, 図 4, 図 5に示すようにこのプロトコルの成功にとって重要です。図 3 aで正しくプル、赤色蛍光の量子ドット コーティング ガラス マイクロ ピペット プロシージャのピペット登録部分の間に液柱のイメージを見ることができます。先端が幅で 6 ミクロンです。図 3 b、12 μ m の先端で不十分なプル ピペットが表示されます。このピペットは 12 μ m 径と不規則な先端面 (注傾斜面の上部にバール) 血管外傷を引き起こすことがなく腎被膜を突き通すことができません。図 3は、 3 Dに最適な位置決めではなくターゲット糸球体のイメージングの重要性が表示されます。図 3に示されている美しい、地表付近の糸球体 (20 μ m 以下の腎被膜の表面位置) のため良好な画像を示しますが、表面に近すぎるためにこのプロシージャによってアクセスに適したできないだろうとピペット、coverslip のヒットでしょう。図 3 D, 糸球体の最適配置が表示されます。別のスケール (縮尺記号はすべて 50 μ m) 両方の糸球体を説明するために使用に注意してください。これらの球体表示深度による屈折のため少ないシャープこの画像は、腎被膜下 70 μ m で撮影されました。腎臓の外側のエッジは、右、これらの糸球体の両方をアクセシブルに 250 μ m です。アクセス中に、イメージングはしっかりと図 4のようにターゲット糸球体に焦点を当てて、毎秒の画像が使用されており、Bowman 腔にピペットの位置決めを正確に観察する調査官。
図 4は、典型的な腎エントリとその結果、Bowman 腔内ピペット チップを示しています。図 4 aでは、正投影図の z スタックから平均強度突起は Bowman 腔にピペット チップを示しています。先端部の円錐形に配列した量子ドットの非常に明るい蛍光による赤ピペット先端スペクトル アーティファクト (蛍光の丸いボール) があることに注意してください。図 4 b、z データのボリュームの投影は、Bowman 腔に別のピペットを示します。ピペットでは旅行の方向のボーマン嚢をドラッグ作成プロトコルで説明されているように、先端の後ろにテンティング明白なエントリに注意してください。
図 5でも大きな開口部を持つピペットが出血を引き起こす、腎被膜で破った失敗した手順の結果が表示されます。ピペットがあまりにも鈍かった。腎被膜を渡すしようとすると、破損が発生するまで前にピペット チップ カプセルに押されました。この画像は、腎被膜が見える、FITC 蛍光グリーンで、subcaspular の出血によって強化されました。FITC 信号、圧力の下で血がピペット ルーメンを入力したことを示す自体、ピペット内表示されます。矢印は多く赤血球 FITC デキストラン欠損ピペット ルーメン内に表示されます。
図 6は、ボーマン宇宙吸引、マウス尿蛋白 17 (MUP17) から得られた代表的な質量スペクトルを示しています。最後に、表 1は、吸引 3 マウスのそれぞれから 6 分以上を収集にナノスケール質量分析法を使用して特定の蛋白質のリスト成功吸引手順の例の結果を示しています。それぞれのケースで、ピペットは、Bowman 腔から撤回され、Bowman 腔または吸引混入プラズマの欠如を示す、ピペット ルーメン内に FITC の蛍光は認められなかったをイメージしました。17 タンパク質、主に低分子量蛋白質あたり 2 ユニークなペプチドの最小から識別されました。スペクトル数が低く、糸球体濾液中のタンパク質の事前見積もりと一致して、フィルター処理された蛋白質、ビタミン D 結合蛋白質 (VTDB) などが知られている (ALBU)、アルブミンと尿中の主要なタンパク質 17 (MUP17) が存在。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig1.jpg"> 図 1: カスタム サポートと横方向アクセスの固定が付いている腎臓の部分的な押出し。左の中心の完全なアセンブリ、イメージングの列と腎臓サポートの部分が表示されます。右側の前に腎臓準備を示す (上記参照) と後 (下) のサポートのアプリケーション。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig2.jpg"> 図 2: プロトコルのピペット登録段階で腎臓準備を完了しました。ここでは、2 光子励起顕微鏡の水柱内マイクロ ピペットの位置に DAPI の励起を使用されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig3.jpg"> 図 3: ピペットおよび腎臓の FITC デキストラン、それによっての適切かつ不適切な糸球体を示す注入後の画像です。A. 6 μ m の先端でよく引っ張られたピペット。B.おおざっぱ、鈍い先端。C.この糸球体は、明確に定義が、それによっての coverslip に近すぎます。+は、糸球体を適当に配置。スケール バーは、すべての 50 μ m<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig4.jpg"> 図 4: 2 の異なったプロシージャからボーマン空間ビューの配置成功ピペット通路を導きます。A. z の直交投影で糸球体の房を隣接 Bowman 腔にピペット チップを示します。スケール バーは、50 μ m. b.Z スタックからボリューム ・ レンダリングは、同様に隣接する糸球体の房 Bowman 腔にピペットを示します。スケール バーは 100 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig5.jpg"> 図 5: 鈍ピペット、腎被膜を引き裂くと、ピペットの内腔への出血につながるため失敗したプロシージャ。FITC 蛍光管外血漿および赤血球 (矢印)、ピペット内に表示されます。矢印が指す赤い血球ピペット ルーメン内に表示されます。スケール バーは 50 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig6.jpg"> 図 6: ボーマン宇宙吸引のナノスケール液体クロマトグラフィー/質量分析法による解析から得られた主要な尿蛋白 (MUP17)、17 のマススペクトル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>タンパク質</td>
			<td>MW (kD)</td>
			<td>スペクトルの数を意味します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTA_MOUSE</td>
			<td>42</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB_MOUSE</td>
			<td>42</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CLPX_MOUSE</td>
			<td>69</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>DHSA_MOUSE</td>
			<td>73</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>FOLR2_MOUSE</td>
			<td>29</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>GBLP_MOUSE</td>
			<td>35</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>ALBU_MOUSE</td>
			<td>66</td>
			<td>6.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBA_MOUSE</td>
			<td>15</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBB1_MOUSE</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MIB1_MOUSE</td>
			<td>110</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MUP17_MOUSE</td>
			<td>21</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>PERI_MOUSE</td>
			<td>54</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNAS4_MOUSE</td>
			<td>17</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>SPTB1_MOUSE</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>VIME_MOUSE</td>
			<td>54</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>VTDB_MOUSE</td>
			<td>53</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1:3 マウスからボーマン宇宙吸引で識別された蛋白質のリスト。
補足ビデオ 1: キャピラリーの房を隣接空間内でピペット チップを示します Bowman 腔でピペットの配置後に取得した z スタックからボリューム ・ レンダリングします。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/0128a-3dview03162018-3.avi">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

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Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

2 光子顕微鏡による促進マウス Bowman 腔のそれによって

腎生理の 2 の基礎的な技法を組み合わせることボウマンのマウスの尿中領域内でマイクロ ピペットを配置する 2 光子顕微鏡の使用を提案します。2 光子顕微鏡の使用は、それによって腎臓生理学の従来の顕微鏡の重要な限界を克服します。

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...

この技術は、全身タンパク質および代謝産物の糸球体濾過率および管状生理学への寄与を含む、単一腎系生理学に関する主要な質問に答えるのに役立つ。このマイクロ穿刺技術の主な利点は、ボウマンの空間とすべてのマウスの皮質腎へのアクセスを可能にすることです。一般に、この方法を使用するユーザーは、正しく実行された準備手順を必要とするため、苦労します。足指ピンチへの応答の欠如を確認した後、目に軟膏を適用し、20〜25グラムの成人マウスの四肢を固定するためにテープを使用する。脱毛クリームを使用して動物の左側の毛を全て取り除き、脾臓の後部および尾側の皮膚を通して左腎臓を見つけるために脾臓を使用します。皮膚に0.5センチメートルの切開を行い、続いて腹部の小さな切開を行い、腎臓が押し通されるのに十分な大きさの腹部を切開する。穏やかな圧力で腎臓を押し出し、組織の周りにポリシロキサン腎臓安定剤の形を置きます.後でほぼ腎臓の表面が安定剤を超えて約1ミリメートル伸びるように腎臓をスペーサーと一緒に並べ、シアノアクリル酸接着剤で腎臓を形態に固定する。ヘッドプレートをスタビライザーの形に接着し、ヘッドプレートをベースプレートの取り付け棒に取り付けます。次に、ポリシロキサンの支持体に1%のアガロース溶液を充填し、アガロースが固まるまで10ミリメートルのカバースリップをフォームの上に保持します。カバースリップを接着剤でヘッドプレートに密封し、カバースリップの周りに歯科用セメントでリングを作成します。その後、100~150マイクロリットルのFITC-Dextranをレトロ軌道に注入し、マウスと固定板を2光子顕微鏡ステージに素早く移動します。手動で腎臓表面に焦点を当てた後、非スキャン2光子モードに切り替え、イメージングウィンドウを探索して、カバースリップの下30マイクロメートルより大きく、横方腎臓カプセルから400マイクロメートル未満のターゲット糸球体を見つけます。ターゲットの糸球体までの横方向および垂直距離を記録します。次に、糸球体の x、y、z のステージ座標を記録します。そして最後に、xとyのステージ座標を変更することなく、約1ミリメートルの目標焦点を水柱に上げます。ピペットチップを水柱に入れ、DAPI励振をオンにします。xおよびy次元のピペットを先端の最大蛍光の点まで動かします。これが目的の中心になります。x引用設定を赤蛍光タンパク質に変更し、眼の視点で正確にセンタリングできるようにピペットを眼で視覚化します。ライブ2光子ビューの下にピペットを見つけるために2光子に戻って、画像の中央に正確にチップを配置し、これは登録位置です。次にピペットの画像を保存し、ステージとマイクロピペットコントローラ座標を登録します。y 軸と z 軸を動かさずに x 軸の水柱からピペットを取り出し、ピペット z をターゲットの糸球体 z 座標と腎臓の端に移動します。ステージxに注意し、登録段階xからのオフセットを使用して腎臓エッジピペットxを計算する。ステージ x を大きくして、腎臓の端が画面の左端に向かって遠くまでピペットに向かってステージを移動し、目に見えるままにします。ピペットを腎臓端から約100マイクロメートル離れたところに素早く進めるだけで計算した。赤いゲインを増加させ、赤いピクセルヒストグラムを監視しながら、ライブ2光子イメージングの下で腎臓の端にゆっくりとピペットチップを進め始めます。x軸のピペットを糸球体ターゲットピペットxまでゆっくりと駆動し、ステージxに目を光らせておきます。糸球体に達すると、z スタックで位置を記録します。ピペットを位置に、マイクロポンプを2分間にわたって100ナノリットルのパーフルオロデカリンを注入するように設定します。ピペットの正愛を確保し、そして入り口の間にピペットのプラグから交戦を減らすために。4~6分の濾過の後、マイクロポンプを1分間に最大50ナノリットルの速度で最大300ナノリットルまで吸引するように設定します。この美しい、表面に近い糸球体は、腎カプセルの下20マイクロメートルで糸球体の表面位置による良好なイメージングを示しています。しかし、ピペットがカバースリップに当たるように、糸球体はマイクロインジェクションには表面に近すぎます。これらの糸球体は、左右に250マイクロメートルの横縁で最適に配置され、カプセルからの70マイクロメートルの深さによって引き起こされる屈折のためにあまり鋭く見えない。糸球体をアクセス可能にする両方の要因。この典型的な腎進入画像では、直交図を有するZスタックからの平均強度投影は、ボウマンの空間内のピペット先端を明らかにし、先端の円錐部に配置された量子ドットの極めて明るい蛍光から赤色ピペット先端スペクトルアーティファクトに注意する。ここでは、ボウマンの空間にピペットを配置した後に取得したzスタックからのボリュームレンダリングは、毛細管の房に隣接する空間内のピペットチップを示しています。開口が大きすぎるピペットを使用すると、腎嚢が壊れ、皮下出血やピペット内腔への血液の侵入を引き起こす可能性があります。この方法を用いて、17個のタンパク質、主として低分子量のタンパク質が、タンパク質当たり最低2つの固有ペプチドから同定されている。この方法と組み合わせることで、マソスペロスコピー、イオン感受性電極測定、蛍光抗体注射などの他の方法を用いて、管状および糸球体生理学における発光体の役割に関する質問に答えることができます。

Research

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Biology

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