Name: micropuncture of bowman's space in mice facilitated by 2 photon microscopy
Uploaded: 2018-10-11T14:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy at JoVE.com

NIDDK K08 DK090754 para GM103493 de P41 MPH. NIGMS para RDS. Este material é o resultado do trabalho (por MPH), que foi apoiado com recursos e a utilização de instalações no centro médico para assuntos de veteranos de Portland. O conteúdo não representam a opinião do departamento dos EUA de assuntos de veteranos ou o governo dos Estados Unidos.

Todos os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Oregon Health & Science University.
1. instalação usada para demonstração
<ol><li>Usar um microscópio 2-fóton na vertical, um controlador de estágio de 3 eixos, um titular headstage/pipeta e um controlador de 3 eixos para o titular headstage/pipeta; todos os quatro destes itens são necessários. Nota: Muitas configurações semelhantes estão disponíveis e serão suficiente, enquanto controle de 3 eixos independente quantitativa da fase de pipeta e microscópio estão disponíveis, e o microscópio está configurado para a imagem latente na vivo na posição vertical.</li>
</ol>2. materiais necessários antes de iniciar os protocolos experimentais
<ol><li>Use FITC-dextrano, Da 2.000.000, solução a 5% em salina normal ou fosfato-salino para injeção retroorbital marcar a vasculatura renal. Este peso molecular (MW) é selecionado porque permanece na vasculatura e não filtra.</li>
	<li>Micropipetas de vidro de borosilicato de máquina-puxado: puxar Micropipetas de 6 – 10 µm ponta usando configurações de ponta longa conicidade, fechado (por exemplo, calor = 610, velocidade = 150, tempo = 250 ms, em loop) em um extrator da micropipeta. Chanfro de 45° e flama-polonês levemente.</li>
	<li>Revestimento de pontos quânticos de micropipetas: casaco pontas de micropipeta com pontos quânticos de acordo com o protocolo referenciado. 12
</li>
	<li>Espaçador/suporte de rim de polisiloxano. Use polisiloxano para craft um espaçador/suporte de rim. Fashion um 1 x 1 cm2 por 5 mm espessura perpendicular romboide (ou seja, um cubo truncado) de polisiloxano. Remova a média 70% do polisiloxano de uma borda e um círculo composto por cerca de 70% do centro do romboide. Permitir que o silicone secar por 24 h. Veja a Figura 1.</li>
	<li>Preparação de microinjector: Prefill um comprimento da tubulação de polietileno (PE)-50 e o titular micropipeta micropipeta-carregado com óleo. Se espectrometria de massa é planejada, perfluorodecalin é necessária, caso contrário o óleo mineral pode ser usado. Configurar o microinjector com uma seringa Hamilton-tipo hermética e preenchimento com perfluorodecalin. Isto será conectado à tubulação do PE-50 e titular da pipeta.</li>
	<li>Coloque a pipeta no suporte de pipeta e para a frente encher os tubos de PE-50 e pipeta, em seguida, fixe a extremidade proximal do PE-50 tubos para a seringa cheia de óleo de Hamilton, criando um sistema hidráulico de pipeta para seringa.</li>
</ol>3. lateral pipeta acesso no rim abaixo um fluido de imagem coluna através de um novo procedimento cirúrgico
Nota: A montagem do sistema de suporte de imagem e preparação cirúrgica é mostrada na Figura 1. O procedimento descrito é executado em camundongos C57BL/6, pesando 20 – 25 g.
<ol><li>Pese o mouse.</li>
	<li>Induzir anestesia usando 4% de isoflurano e manter com 1,5-2,5% de isoflurano em mistura de ar/oxigênio. Confirme que o mouse é anestesiado pela ausência de resposta ao estímulo doloroso e taxa respiratória reduzida.</li>
	<li>Lubrificar os olhos e posição lateral do animal em uma placa de base. Imobilize 4 extremidades usando fita.</li>
	<li>Injetar soro fisiológico normal, 200 µ l, por via subcutânea e colocar uma sonda de temperatura retal. Controle de temperatura usando uma lâmpada de aquecimento durante a cirurgia e uma almofada de aquecimento durante a imagem latente.</li>
	<li>Remova todo o cabelo do lado esquerdo do mouse usando um creme depilatório.</li>
	<li>Localize o baço, que é visível sob a pele, e localizar o rim esquerdo no lado dorsal e caudal do baço.</li>
	<li>Fazer uma incisão de 0,5 cm na pele e incisão menor no peritônio, apenas o suficiente para o rim atravessar facilmente.</li>
	<li>EXTRUDE o rim com uma pressão suave. Coloque a forma de estabilizador de rim feita com silicone em torno do rim e correção com adesivo de cianoacrilato. Alinhe o rim com o espaçador tal que a superfície lateral-maioria do rim ultrapassa o estabilizador, por cerca de 1 mm.</li>
	<li>Faça um prato de cabeça para o formulário do estabilizador com colagem e montar o prato de cabeça para barras de montagem na placa base.</li>
	<li>Encher o poço no apoio polysiloxane em torno do rim com solução de agarose 1% e colocar a lamela de 10 mm em cima e segure até agarose é firme. Selo da lamela à placa de cabeça com cola e criar um anel ao redor da lamela com cimento dental.</li>
	<li>Injetar FITC-dextrano (Da 2.000.000, solução a 5%, 100 – 150 µ l) retrô-orbitally e mova a placa de mouse e fixação à fase 2-fóton microscópio rapidamente, mantendo a anestesia e garantindo adequada os resíduos de gás no palco microscópio.</li>
</ol>4. seleção de um glomérulo apropriado e pipeta acesso ao espaço de Bowman
<ol><li>
Definições:
	<ol>
<li>Definir X como na tela da esquerda-direita e esquerda-direita, enfrentando o microscópio</li>
		<li>Leia SX (fase X) do controlador de palco</li>
		<li>Definir PX como pipeta X, na pipeta de discagem controlador</li>
		<li>Definir Y como up-down na tela e avançar em direção ao microscópio e volta para a configuração 2-fóton</li>
		<li>Definir como até Z em direção ao teto, para baixo para o chão e medido no palco com a posição do objetivo Z.</li>
		<li>Defina S (O) Z como a altura de palco (realmente o objectivo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Encontre a superfície do rim, identificável usando as configurações de filtro de proteína verde fluorescente (GFP) na ocular. Devido a injeção de FITC-dextrano, vasculatura será verde brilhante.
	<ol>
<li>Identifica um glomérulo apropriado. Depois de identificar a superfície do rim usando a ocular, mude para 2-fóton (modo de não-exploração) e explorar a janela de imagem. Características favoráveis para micropunção são as seguintes: distância vertical abaixo da lamela > 30 µm (para evitar a colisão entre a pipeta e a lamela durante o acesso) e lateral do distância da cápsula renal lateral para o glomérulo < 400 µm (além desta distância o desvio da pipeta pode aumentar a probabilidade de uma menina).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ponto de registro lateral e distância vertical para a punção, um ponto do glomérulo renal cápsula diretamente para o lado da pipeta.</li>
	<li>Levantar o ponto focal objectivo na coluna de água, mantendo o x e y coordenadas do palco inalterada, uma distância de apenas cerca de um centímetro.</li>
	<li>Dirija a ponta da pipeta na coluna de água e ligue 4', excitação de 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Mova a pipeta em x e y dimensões ao ponto de máxima fluorescência da ponta, este será o centro do objetivo. Encontrar a pipeta a ocular é difícil sem esse prepositioning precisos. Porque pontos quânticos de fluorescência no comprimento de onda mesmo (no caso, vermelho), independentemente do comprimento de onda de excitação, a excitação de DAPI produz fluorescência vermelha, que é fortemente focada na ponta, ilustrada na Figura 2.</li>
	<li>Altere a configuração de excitação para proteína fluorescente vermelha (RFP) e visualizar a pipeta na ocular e, em seguida, precisamente, centralizá-lo no modo de exibição ocular.</li>
	<li>Alterne para o 2-fóton e encontrar a pipeta sob 2-fóton, colocando-o precisamente no centro da imagem. Esta é a posição do registro.</li>
	<li>Salve uma imagem da pipeta.</li>
	<li>Registre o palco e as coordenadas do controlador micropipeta. Nota: Usar o arquivo. html suplementar, que irá executar cálculos usando o código JavaScript, (vantajoso em sistemas que não possuem software de planilha instalado) ou uma planilha para calcular o deslocamento entre coordenadas de palco e a pipeta e a Calcule as coordenadas do alvo para o controlador de pipeta.</li>
	<li>Retire a pipeta da coluna d'água no eixo x, mantendo o z e y o mesmo.</li>
	<li>Mover a pipeta Z para o glomérulo alvo Z (ou seja, mover a pipeta para baixo na direção Z abaixo a lamela)</li>
	<li>Mova a pipeta Y a coordenada do glomérulo Y de alvo.</li>
	<li>Mover a exibição ao vivo 2-fóton para o glomérulo alvo Z e depois para a borda do rim e observe o SX.</li>
	<li>Calcule a borda do rim PX usando o deslocamento a partir do registo SX.</li>
	<li>Mova o palco em direção a pipeta (aumento do SX) tal que a borda do rim está longe à esquerda da tela, mas ainda visível.</li>
	<li>Avança rapidamente a pipeta para cerca de 100 µm, menos do que a borda de rim PX calculado acima.</li>
	<li>Localize a ponta da pipeta, avançando a pipeta lentamente. Aumentar o ganho de vermelho e assistir o histograma de pixel vermelho (os pixel distribuição turnos antes a pipeta é fotografada na janela, devido a luminosidade extrema de pontos quânticos e fluorescência fora do alvo).</li>
	<li>Avançar para a borda do rim sob imagens ao vivo do 2-fóton. Nota: Antes de entrar a cápsula renal, é possível redirecionar a pipeta nas dimensões Y e Z. No entanto, isso pode quebrar a ponta da pipeta. Uma medida mais conservadora, se a pipeta é fora do alvo, é retirar a dimensão de X até 2 cm, redirecionamento e depois voltar na dimensão X para a borda do rim. Uma vez que a pipeta é dentro do tecido, movimento em qualquer eixo que não seja X leva a flexão da pipeta que requer grande experiência para fazer uso de e frequentemente leva à quebra.</li>
	<li>Levar a pipeta no eixo X lentamente o alvo glom PX, mantendo um olho sobre o SX. (É útil voltar ocasionalmente para o glomérulo para ver se mudou em tudo sobre inserção da micropipeta).</li>
	<li>Quando você está no local correto, posição do documento com um z-pilha. Nota: Com a micropipeta no lugar, drogas, proteínas ou marcadores fluorescentes podem ser injetados, fluido pode ser aspirado para análise posterior ou pressão ou carga em relação ao outro eletrodo pode ser medida.</li>
</ol>5. aspiração de líquido do espaço de Bowman
<ol><li>Definir a microbomba para injetar 100 nL de perfluorodecalin mais 2 min para garantir desobstrução da pipeta e reduzir a confusão da pipeta ligar durante a entrada. Criar uma nova imagem para garantir a posição de pipeta.</li>
	<li>Espere 4-6 min para filtragem adicional.</li>
	<li>Definir a microbomba para aspirar até 300 nL a uma taxa de até 50 nL/min. Nota: As alterações na morfologia glomerular não forem cumpridas com este ritmo, sugerindo que não altera a taxa de entrega de fluido para o espaço durante a aspiração. Como não há nenhum bloco de petróleo como micropunção convencional, recuperação deste volume, necessário para espectrometria de massa, pode incluir alguns dos perflourodecalin injetado e fluido possivelmente tubular. Para os ensaios, tais como espectroscopia de fluorescência de medições de eletrodo íon-sensível, reação em cadeia da polimerase e outros pontos de extremidade sensíveis, volumes menores podem ser utilizados. Se a espectrometria de massa não é o ponto de extremidade, óleo mineral e técnicas de micropunção padrão podem ser usadas para medir o volume aspirado antes do armazenamento.</li>
	<li>Imagem mais uma vez.</li>
	<li>Retirar a pipeta e preservar a amostra, adicionar tampão TRIS e armazenando a-80 ° antes da análise.</li>
	<li>Eutanásia o mouse usando uma overdose de isoflurano ou outro método aprovado. Nota: Filtrado entra no espaço por filtração dos capilares glomerulares. A taxa de filtração glomerular single-néfron (SNGFR) em camundongos é relatada entre 8-14 nL/min.3 forças de Starling regem SNGFR, no entanto, e a pressão hidrostática negativa no espaço de Bowman, portanto, pode aumentar a SNGFR. Métodos de micropunção padrão usam bloqueio tubular com óleo e pressão neutra para amostragem de fluido tubular, no entanto, estes compostos interferem com espectrometria de massa (veja abaixo); Portanto, nesta técnica o túbulo proximal precoce permanece patente. Além disso, no momento da aspiração, espaço de Bowman contém um desconhecido, mas positivo volume de filtrado. Portanto, a taxa de aspiração de fluidos pode exceder SNGFR. Nota: Nos experimentos descritos aqui, o objetivo era obter uma maior do que o habitual amostra do filtrado glomerular para análise de espectrometria de massa por técnicas de nanoproteomic. Desde que o uso de espectrometria de massa impede o uso de blocos de petróleo com óleo mineral ou cera (misturas complexas de moléculas orgânicas que reduzem o ruído do sinal: em espectrometria de massa) perfluorodecalin é usado para preencher a micropipeta e seringa. Perflourodecalin não é conhecido para bloquear o fluxo tubular, mas é biologicamente inerte e não interfere com espectrometria de massa.</li>
</ol>

<ol>
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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+endothelial+glycocalyx+links+albuminuria+and+vascular+dysfunction.">Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (8), 1339-1350 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Apresentamos um método para acessar o espaço de Bowman de glomérulos não-superfície em camundongos, facilitados pela microscopia 2-fóton. Desenvolvemos este procedimento para resolver uma limitação chave de micropunção glomerular, a raridade de superfície glomérulos endereçáveis por microscopia 1-fóton em camundongos, a fim de facilitar um objectivo experimental, aspiração de líquido do espaço de Bowman para análise subsequente. Desenvolvimento e prática desta técnica baseia-se em seis etapas críticas. Primeiro, a novela preparação cirúrgica deve ser cuidadosamente efectuada para que a coluna de água de imagem não é executado fora da lamela e lamela estende-se sobre a área do rim, que é o alvo da pipeta. Em segundo lugar, a pipeta de vidro usada para micropunção deve ser processada visível para microscopia 2-fóton, que é realizada usando pontos quânticos. Terceira, estereotáxica técnica é necessária para posicionar precisamente uma pipeta no espaço de Bowman em três dimensões, até 100 µm abaixo da superfície do rim. Portanto, registrando os sistemas de coordenadas de pipeta e o palco com precisão é passos críticos. Quarta, cuidadosa seleção de glomérulo alvo é necessária assegurar que é acessível para a pipeta sem choque pela estrutura de apoio do rim e coluna de imagem. Por último, avaliação cuidadosa deve ser dada às etapas analíticas para seguir o procedimento de aquisição, e volume e tempo de aquisição de amostras de fluido devem ser correspondente à análise e à fisiologia glomerular.
Nós projetamos um procedimento de aquisição que pode ser estendido para muitas análises, incluindo os pontos de micropunção tradicionais, tais como fotometria de chama, medições de eletrodo íon-sensível ou medições de pressão, volume ou carga. Além disso, acreditamos que esta técnica será passível de novos pontos de extremidade analíticos incluindo a reação em cadeia da polimerase (talvez seguindo a transcrição reversa para miRNA) e metabolomics a jusante de espectrometria de massa. As modificações especiais empregadas para facilitar a espectrometria de massa merecem discussão adicional, e eles impõem algumas limitações. Primeiro, apesar de espectrometria de massa é altamente sensível, o teor de proteínas de baixo e o volume de amostras de micropunção processa a análise da proteína abaixo do alcance dinâmico de exploração proteomic convencional e, portanto, foram nanoproteomics simplificados necessário. 8 , 13 em segundo lugar, para otimizar o rendimento de proteína para os primeiros ensaios, determinamos que 200-300 nL de aspirado era necessário, mas de novo filtrado aquisição deste volume exigiria talvez contanto que 20 minutos de aspiração se o mouse TFG é apenas de 8-14 nL / Min3. Como Tojo e Endou demonstraram que a aspiração prolongada altera o conteúdo de albumina de início túbulo proximal o líquido14, eleito para aspirar a mais de 6 minutos; no entanto, isto significa que a nossa taxa de aspiração excede a taxa de afluência de filtrado. Os usuários deste procedimento são encorajados a considerar a fisiologia da filtração glomerular em seu sistema experimental em projetar seu fluxo de trabalho. Espectrometria de massa, uma técnica sensível, iria ficar maravilhada com o sinal de um destilado de petróleo introduzido como óleo mineral, que é comumente usado em micropunção que compõem o sistema hidráulico para aspiração e isolar segmentos do néfron. Portanto, não poderíamos usar óleo mineral para esta finalidade, ou usar outros comuns, quantificação do volume de amostras da gama de nanolitros. Em vez disso, nós enchemos o sistema com perfluorodecalin que é biologicamente inerte, não perturba a espectrometria de massa e tem características ópticas favoráveis. Acreditamos que as limitações impostas pela perfluorodecalin são superáveis e estão trabalhando em inovações técnicas adicionais, que esperamos que irá permitir a medição do volume de amostra e bloqueio do segmento tubular.
A maioria dos estudos de micropunção foram realizados em Munique-ratos Wistar, que demonstram um aumento do número de glomérulos superficiais, mas este estudo fisiológico extremamente limitado de transporte tubular e outra fisiologia renal devido à perda do fundamental ferramenta da biologia molecular, ratos transgénicos2,3. Porque facilita o acesso de micropipeta para espaço de Bowman em camundongos, a nova técnica reduz, portanto, essas limitações críticas. Adotamos esta técnica para acessar o filtrado renal para estudos de proteômica utilizando espectrometria de massa de alta sensibilidade, conhecida como nanoproteomics9. No entanto, existem aplicações adicionais prováveis. Por exemplo, renal estudo fisiológico da proteína filtrada tem sido grandemente ajudado pela utilização dos marcadores fluorescentes com 2-fotão microscopia15,16,17. Adição de micropunção para microscopia 2-fóton oferece a possibilidade de realizar o estudo fisiológico de single-néfron com moléculas fluorescentes, permitindo que os néfrons vizinhos, não injectada servir como controles. Espera-se que esta explicação clara das etapas necessárias permitirá ampla adoção nos laboratórios já equipados para 2-fotão microscopia e/ou micropunção. Embora seja complexo, que agora temos realizado este procedimento muitas vezes e os refinamentos aqui apresentados representam uma plataforma estável para descoberta fisiológica.

O objectivo deste procedimento é fornecer acesso de micropunção rotina ao espaço de Bowman e outras estruturas glomerulares em camundongos. Estudos de micropunção para fisiologia renal foram limitados ao 1-fotão microscopia, que só pode a imagem dentro de alguns mícrons da superfície do rim, e que oferece precisão limitada na dimensão-z. Porque os ratos têm alguns glomérulos de superfície, não é sempre possível encontrar um superfície glomérulo pela microscopia 1-fóton, portanto a maioria dos estudos de micropunção efectuadas em Munique-ratos Wistar, que têm glomérulos de superfície mais numerosos. Portanto, os benefícios de trabalhar em modelos do rato tem sido limitados em estudos de micropunção1,2,3. Recentes avanços em imagem tecnologias, incluindo micro-CT4,5, nanopartículas de imagem6e imagem latente de espectrometria de massa7 tem bastante reforçada a gama de modalidades de Fisiologia glomerular, mas Não ainda não há nenhum substituto para a única fornece capacidade de intervir e aquele micropunção da amostra. Estender-se, portanto, o uso de micropunção, usando as técnicas apresentadas aqui é esperado para facilitar estudos de Fisiologia renal romance, em particular, avaliação do conteúdo do filtrado renal (ou seja, metabolomics) e fisiologia básica do camundongos transgênicos, tais como as medições de pressão filtrado e carga, anteriormente executadas somente em ratos.
Nesta técnica, o uso de 2-fotão microscopia permite visualização e acesso micropipeta para estruturas renais até cerca de 100 µm abaixo da cápsula renal. Vários glomérulos (5 – 10) são, portanto, acessíveis aos micropunção em cada rim de rato até fotografada. Embora essa técnica compartilha algumas características com micropunção renal convencional, foi projetado de novo e extensas modificações da técnica convencional são necessárias. Neste protocolo demonstramos aspiração de líquido do espaço de Bowman e mostrar os resultados do exemplo de análise subsequente com espectrometria de massa (nanoproteomics)8,9,10,11. Uso a jusante de espectrometria de massa requer um amostra especializados preparação de fluxo de trabalho, que também é demonstrado aqui.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright 2 photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 7MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 axis microscope stage controller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 axis headstage controller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 2000 kDa MW</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52471-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary tubes</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B150-110-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dots, 605 nm</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q21701MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysiloxane</td>
			<td>Sugru</td>
			<td>No cat number</td>
			<td>www.sugru.com, &#34;original formula&#34;. Any color.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-50 tubing</td>
			<td>Instech Labs</td>
			<td>BTPE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>WPI</td>
			<td>UMP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector controller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Micro4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluorodecalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>306-94-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip, 10 mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>64-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>Custom</td>
			<td>No part number</td>
			<td>Common in neuroscience labs, many suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head fixation device</td>
			<td>Custom</td>
			<td>No part number</td>
			<td>Common in neuroscience labs, many suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needle</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>125393</td>
			<td>For retroorbital injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin syringe</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>309626</td>
			<td>For retroorbital injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micropuncture of bowman's space in mice facilitated by 2 photon microscopy

Micropunção renal e renal 2-fóton imagens são técnicas seminais na fisiologia renal. No entanto, micropunção é limitada pela dependência na microscopia convencional para características de superfície do néfron, e 2-fóton estudos são limitados em que intervenções só podem ser avaliadas no órgão, em vez de ao nível do néfron. Em particular, estudos de micropunção de glomérulos dos ratos tem sido contestados pela escassez de superfície glomérulos em camundongos. Para resolver essa limitação, a fim de prosseguir os estudos de aspirado do espaço de Bowman em modelos fisiológica de rato, nós desenvolvemos 2-fóton micropunção glomerular. Apresentamos uma romance preparação cirúrgica que permite o acesso lateral para o rim, preservando a coluna imagem vertical necessária para microscopia 2-fóton. Administração de alto peso molecular isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano é usado para processar a vasculatura renal e, portanto, glomérulos visível para a imagem latente 2-fóton. Uma pipeta de ponto-revestido quântica é então introduzida sob orientação estereotáxica para um glomérulo selecionado a partir de vários a muitos que podem ser visualizados dentro da janela de imagem. Neste protocolo, nós fornecemos detalhes de preparação, materiais e métodos necessários para realizar o procedimento. Esta técnica facilita anteriormente impossível estudo fisiológico do rim, incluindo todos os segmentos do néfron dentro do limite de profundidade de imagem, cerca de 100 µm, abaixo da cápsula renal e recuperação do filtrado do espaço de Bowman. Pressão, carga e fluxo podem todos ser medidos usando a pipeta introduzida. Aqui, nós fornecemos dados representativos da espectrometria de cromatografia líquida/massa realizada no aspirado do espaço de Bowman. Esperamos que esta técnica ter aplicabilidade larga na investigação fisiológica renal.

Este procedimento requer uma única preparação cirúrgica do rim para imagem 2-fóton e acesso, que é ilustrado na Figura 1. Esta preparação mostrada aqui permite que uma coluna vertical de imagens com o objetivo acima do rim com poucas alterações de densidade para melhor possível ótica para microscopia 2-fóton simultaneamente com acesso lateral para a pipeta, conduzido exclusivamente na horizontal (x ) dimensão. Extrusão parcial do rim impede a tensão excessiva no pedículo renal e preserva o fluxo vascular, e construção de um suporte personalizado rim permite que os dois objectivos de imagiologia e acesso. O segundo desafio neste procedimento é um posicionamento preciso da pipeta dentro do rim em 3 dimensões, que exige registro dos sistemas de coordenada de pipeta e palco. O passo crítico para este processo é ilustrado na Figura 2, que mostra a pipeta ficar manchada na coluna d'água do microscópio 2-fóton sob DAPI-excitação. A coluna de água a entrar e registrar as coordenadas da pipeta para aqueles do palco antes de entrar no rim são fundamental para permitir um posicionamento estereotáxica da pipeta dentro do espaço do Bowman o alvo. A pipeta entra a coluna de água a imagem da direita. Com excitação de DAPI ligada, pipeta revestido ponto quântico vermelho fluorescente brilhantemente de vermelho-laranja, e ele pode ser cuidadosamente posicionado sob o meio do objectivo. Como o feixe de excitação passa através do centro do objectivo, a pipeta pode ser movida livremente ao ponto de fluorescência máxima, assegurando que será visível na ocular.
Seleção de pipeta adequada puxando e glomérulo são críticos para o sucesso do presente protocolo, conforme ilustrado na Figura 3, Figura 4, Figura 5. Na Figura 3A, pode ser vista uma micropipeta de vidro revestido ponto quântico corretamente-puxado, vermelho fluorescente fotografada em coluna de fluido durante a parte do registo de pipeta do procedimento. A dica é 6 microns de largura. Na Figura 3B, é mostrada uma pipeta mal-puxado com 12 µm de ponta. Esta pipeta não pode penetrar a cápsula renal sem causar trauma vascular devido a 12 µm de diâmetro e a superfície irregular da ponta (nota a broca na parte superior do bisel). Na Figura 3 e 3D, é mostrada a importância do ideal posicionamento ao invés da imagem latente do glomérulo alvo. O glomérulo bonito, perto da superfície, ilustrado na Figura 3 demonstra uma imagem favorável (devido à sua posição de superfície em 20 µm abaixo da cápsula renal), mas não seria apropriado para acesso por esse procedimento porque é muito perto da superfície, e a pipeta teria atingido a lamela. Na Figura 3D, idealmente posicionado glomérulos são mostrados. Observe a escala diferente usada para ilustrar os dois glomérulos (barras de escala são todos 50 µm). Esses glomérulos aparecem menos acentuados devido a refração causada pela profundidade; Esta imagem foi tirada em 70 µm abaixo da cápsula renal. A borda lateral do rim é 250 µm para a direita, fazendo ambos estes glomérulos acessível. Durante um procedimento de acesso, imagem latente é firmemente focado no glomérulo alvo como na Figura 4, e aquisição de imagens de cada segundo é utilizada, permitindo que o investigador precisamente observar o posicionamento da pipeta no espaço de Bowman.
A Figura 4 ilustra uma típica entrada renal e o resultado, uma ponta da pipeta dentro do espaço de Bowman. Na Figura 4A, uma projeção de intensidade média de uma z-pilha com vistas ortogonais demonstra a ponta da pipeta no espaço de Bowman. Observe que há pipeta vermelho ponta espectral artefato (bola redonda de fluorescência) devido à fluorescência extremamente brilhante dos pontos quânticos dispostas na seção cônica da ponta. Na Figura 4B, uma projeção de volume de dados z-pilha demonstra outra pipeta no espaço de Bowman. Observe que a pipeta arrastado cápsula de Bowman na direção de viagem na entrada, criando aparente acampar por trás a ponta, conforme descrito no protocolo.
Na Figura 5, os resultados de um procedimento de falhado são mostrados em que uma pipeta com uma abertura muito grande quebrou na cápsula renal, causando sangramento. A pipeta foi muito contundente; na tentativa de passar a cápsula renal, a cápsula foi empurrada pela frente a ponta da pipeta até ruptura ocorreu. Nesta imagem, a cápsula renal é visível, reforçada por subcaspular hemorragia, em verde fluorescente-FITC. Sinal FITC é visível dentro da pipeta em si, indicando que o sangue sob pressão entrou o lúmen da pipeta. A seta aponta para muitos glóbulos vermelhos visíveis dentro do lúmen de pipeta como defeitos no FITC-dextrano de enchimento.
A Figura 6 mostra um espectro de massa representativo obtido de aspirado de espaço de Bowman, proteína urinária de rato 17 (MUP17). Por último, tabela 1 demonstra os resultados do exemplo de procedimentos de aspiração bem sucedido, listando as proteínas identificadas usando espectrometria de massa de nanoescala em aspirado coletado mais de 6 minutos de cada um dos 3 ratos. Em cada caso, a pipeta foi fotografada como foi retirada do espaço de Bowman, e nenhuma fluorescência FITC observou-se no espaço de Bowman ou o lúmen de uma pipeta, indicando ausência de contaminação aspirado com plasma. 17 proteínas, principalmente de baixo peso molecular, identificaram-se de um mínimo de 2 peptídeos exclusivos por proteína. Contagens de espectrais são baixas, consistentes com as estimativas anteriores de proteína no filtrado glomerular, e conhecido filtradas proteínas, tais como a vitamina D (VTDB), proteína albumina (ALBU) e proteína urinária maior 17 (MUP17) estão presentes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig1.jpg"> Figura 1: extrusão parcial do rim com suporte personalizado e imobilização para acesso lateral. À esquerda, são mostradas as peças do suporte da coluna e no rim de imagem, com o conjunto completo no centro. À direita, a preparação de rim é mostrada antes (acima) e depois (abaixo) aplicação do suporte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig2.jpg"> Figura 2: concluída a preparação, rim em passo de registo pipeta do protocolo. Aqui, a excitação DAPI está sendo usada para posicionar a micropipeta dentro da coluna de água do microscópio fotônico 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig3.jpg"> Figura 3: imagem latente de pipetas e o rim após injeção de FITC-dextrano, demonstrando glomérulos adequados e inadequados para micropunção. R. uma pipeta bem puxada com 6 µm de ponta. B. uma dica duro gumes, sem corte. C. O glomérulo é bem definido, mas muito perto de lamela para micropunção. D. Devidamente posicionado glomérulos. Barras de escala são todos 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig4.jpg"> Figura 4: passagem de pipeta bem sucedida leva a colocação no espaço de-vistas Bowman de 2 procedimentos diferentes. R. Z-pilha com projecções ortogonais demonstra a ponta da pipeta no espaço de Bowman adjacentes do tufo glomerular. Barra de escala é 50 µm. B. Renderização de volume da z-pilha da mesma forma demonstra uma pipeta no espaço de Bowman adjacentes do tufo glomerular. Barra de escala é 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig5.jpg"> Figura 5: um procedimento mal sucedido devido a uma pipeta romba, rasgando a cápsula renal e levando a sangramento no lúmen pipeta. Fluorescência FITC do plasma extravasado e células vermelhas do sangue (seta) são visíveis dentro da pipeta. Seta aponta para células vermelhas do sangue visíveis dentro do lúmen da pipeta. Barra de escala é 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig6.jpg"> Figura 6: espectro de massa para proteína urinária maior 17 (MUP17), resultantes da análise de espectrometria de cromatografia líquida/massa de nanoescala de aspirado de espaço de Bowman. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Proteína</td>
			<td>MW (kD)</td>
			<td>Quer dizer espectral contagem</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTA_MOUSE</td>
			<td>42</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB_MOUSE</td>
			<td>42</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CLPX_MOUSE</td>
			<td>69</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>DHSA_MOUSE</td>
			<td>73</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>FOLR2_MOUSE</td>
			<td>29</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>GBLP_MOUSE</td>
			<td>35</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>ALBU_MOUSE</td>
			<td>66</td>
			<td>6.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBA_MOUSE</td>
			<td>15</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBB1_MOUSE</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MIB1_MOUSE</td>
			<td>110</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MUP17_MOUSE</td>
			<td>21</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>PERI_MOUSE</td>
			<td>54</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNAS4_MOUSE</td>
			<td>17</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>SPTB1_MOUSE</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>VIME_MOUSE</td>
			<td>54</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>VTDB_MOUSE</td>
			<td>53</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Lista das proteínas identificadas no aspirado de espaço do Bowman de 3 ratos.
1 de vídeo suplementar: uma renderização de volume de uma pilha de z-adquirida depois de uma pipeta de posicionamento no espaço de Bowman demonstra a ponta da pipeta dentro do espaço, confinando o tufo capilar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/0128a-3dview03162018-3.avi">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

Micropunção do espaço de Bowman em camundongos facilitada pela microscopia de fóton 2

Apresentamos o uso da microscopia 2-fóton para colocar uma micropipeta no espaço urinário de Bowman em camundongos, combinando 2 técnicas fundamentais da fisiologia renal. Uso da microscopia 2-fóton supera limitações críticas de microscopia convencional para estudos de Fisiologia renal de micropunção.

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...

Esta técnica pode ajudar a responder perguntas-chave sobre fisiologia de nefrão único, incluindo as taxas de filtragem glomerular de proteínas sistêmicas e metabólitos e suas contribuições para a fisiologia tubular. A principal vantagem desta técnica de micropunctura é que ela permite o acesso ao espaço de Bowman e ao nefron cortical em todos os ratos. Geralmente, indivíduos novos nesse método lutariam porque requer etapas de preparação corretamente executadas.Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo, aplique pomada nos olhos e use fita adesiva para imobilizar as extremidades de um rato adulto de 20 a 25 gramas. Use um creme depilatório para remover todo o cabelo do lado esquerdo do animal, e use o baço esquerdo para localizar o rim esquerdo através da pele no lado dorsal e caudal do baço. Faça uma incisão de 0,5 centímetros na pele, seguida de uma incisão menor no peritônio apenas grande o suficiente para que o rim seja empurrado.Extrude o rim com pressão suave e coloque uma forma de estabilizador renal polisiloxano ao redor do tecido. Forre o rim com o espaçador de tal forma que a superfície lateral do rim se estenda além do estabilizador em cerca de um milímetro, e fixe o rim à forma com adesivo de cianoacrilato. Cole uma placa da cabeça na forma estabilizadora e monte a placa da cabeça em barras de montagem na placa base.Em seguida, preencha o poço no suporte de polisiloxano com uma solução de agarose de 1% e mantenha um deslizamento de cobertura de 10 milímetros em cima do formulário até que a agarose esteja firme. Sele o deslizamento da tampa na placa da cabeça com cola e crie um anel ao redor da tampa com cimento dental. Em seguida, injete de 100 a 150 microlitros do FITC-Dextran retro-orbitalmente e mova rapidamente o mouse e a placa de fixação para o estágio do microscópio de dois fótons.Depois de focar manualmente na superfície dos rins, mude para o modo de dois fótons não escaneamento e explore a janela de imagem para localizar um glomerulus alvo que é superior a 30 micrômetros abaixo do deslizamento de cobertura e menos de 400 micrômetros da cápsula renal lateral. Regisso a distância lateral e vertical até o glomerulus alvo. Em seguida, grave as coordenadas de estágio x, y e z para o glomerulus.E por último, levante o ponto focal objetivo cerca de um milímetro na coluna de água sem alterar as coordenadas de estágio x e y. Coloque a ponta da pipeta na coluna de água e ligue a excitação DAPI. Mova a pipeta nas dimensões x e y para o ponto de fluorescência máxima da ponta.Este será o centro do objetivo. Altere a configuração x citação para proteína fluorescente vermelha e visualize a pipeta com o ocular para permitir um centro preciso na visão ocular. Mude de volta para dois fótons para encontrar a pipeta sob a visão ao vivo de dois fótons e coloque a ponta precisamente no centro da imagem, esta é a posição de registro.Em seguida, salve uma imagem da pipeta e registre o estágio e as coordenadas do controlador de micropipette. Remova a pipeta da coluna de água no eixo x sem mover o eixo y e z e mova a pipeta z para a coordenada z-z alvo e a borda do rim. Observe o estágio x e calcule a pipeta de borda renal x usando o deslocamento da fase de registro x.Aumente o estágio x para mover o palco em direção à pipeta até que a borda do rim esteja longe à esquerda da tela, enquanto permanece visível. Avance rapidamente a pipeta para cerca de 100 micrômetros de distância da pipeta de borda renal X acabou de calcular. Aumente o ganho vermelho e comece a avançar a ponta da pipeta lentamente para a borda dos rins sob imagens vivas de dois fótons enquanto monitora o histograma do pixel vermelho.Dirija a pipeta no eixo x lentamente até o alvo glomerulus pipeta x, mantendo um olho no palco x. Ao chegar ao glomerulus, documente a posição com uma pilha de z. Com a pipeta em posição, ajuste a microbomba para injetar 100 nanoliters de perfluorodecalina ao longo de dois minutos.Para garantir a patency da pipeta e reduzir a confusão da pipeta durante a entrada. Após quatro a seis minutos de filtragem, defina a microbomba para aspirar até 300 nanoliters a uma taxa de até 50 nanoliters por minuto. Este belo glomerulus de superfície próxima demonstra imagens favoráveis devido à posição superficial do glomerulus a 20 micrômetros abaixo da cápsula renal.O glomerulus está muito perto da superfície para microinjeção, no entanto, como a pipeta iria bater o deslizamento de cobertura. Estes glomeruli são posicionados de forma ideal com as bordas laterais 250 micrômetros à direita e aparecendo menos afiados por causa da refração causada por sua profundidade de 70 micrômetros da cápsula. Ambos os fatores que tornam o glomeruli acessível.Nesta imagem típica de entrada renal, uma projeção de intensidade média de uma pilha de z com vistas ortogonais revela a ponta da pipeta dentro do espaço de Bowman, note o artefato espectral da ponta de pipeta vermelha da fluorescência extremamente brilhante dos pontos quânticos dispostos na seção cônica da ponta. Aqui, uma renderização de volume de uma pilha z adquirida após o posicionamento de uma pipeta no espaço de Bowman, mostra a ponta de pipeta dentro do espaço abutting o tufo capilar. Se uma pipeta com uma abertura muito grande for usada, a cápsula renal pode quebrar causando sangramento subcapsular e entrada do sangue no lúmen pipeta.Utilizando este método, 17 proteínas, principalmente de baixo peso molecular, foram identificadas a partir de um mínimo de dois peptídeos únicos por proteína. Juntamente com este método, outros métodos como maspectroscopia, medidas de eletrodos sensíveis a íons e injeção de anticorpos fluorescentes podem ser usados para responder a perguntas sobre o papel dos solutos luminais na fisiologia tubular e glomerular.

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