Name: micropuncture of bowman's space in mice facilitated by 2 photon microscopy
Uploaded: 2018-10-11T14:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy at JoVE.com

NIDDK K08 DK090754 до GM103493 Миль/ч. NIGMS P41 службы удаленных рабочих столов. Этот материал является результатом работы (по миль/ч), которая была поддержана с ресурсами и использования помещений в медицинском центре дел ветеранов Портленд. Содержимое не представляют взгляды Департамента США по делам ветеранов или правительства Соединенных Штатов.

<ol>
	<li>Schnermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncture+analysis+of+tubuloglomerular+feedback+regulation+in+transgenic+mice.">Micropuncture analysis of tubuloglomerular feedback regulation in transgenic mice.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (12), 2614-2619 (1999).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncture+of+the+kidney:+a+primer+on+techniques.">Micropuncture of the kidney: a primer on techniques.</a> Comprehensive Physiology. 2 (1), 621-637 (2012).</li><li>Vallon, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncturing+the+nephron.">Micropuncturing the nephron.</a> Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 458 (1), 189-201 (2009).</li><li>Perrien, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+methods+for+microCT-based+analyses+of+vasculature+in+the+renal+cortex+reveal+a+loss+of+perfusable+arterioles+and+glomeruli+in+eNOS-/-+mice.">Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice.</a> BMC Nephrology. 17, 24 (2016).</li><li>Ehling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Micro-Computed+Tomography+Imaging+of+Vascular+Dysfunction+in+Progressive+Kidney+Diseases.">Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).</li><li>Gimenez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Imaging+of+Nanoparticle+Distribution+in+Biological+Tissue+by+Laser-Induced+Breakdown+Spectroscopy.">3D Imaging of Nanoparticle Distribution in Biological Tissue by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy.</a> Scientific Reports. 6, 29936 (2016).</li><li>Miyamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+reveals+elevated+glomerular+ATP/AMP+in+diabetes/obesity+and+identifies+sphingomyelin+as+a+possible+mediator.">Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator.</a> EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).</li><li>Piehowski, P. D., Zhao, R., Moore, R. J., Clair, G., Ansong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+mass+limited+tissue+samples+for+spatially+resolved+tissue+profiling.">Quantitative proteomic analysis of mass limited tissue samples for spatially resolved tissue profiling.</a> Methods in Molecular Biology. , (2017).</li><li>Yi, L., Piehowski, P. D., Shi, T., Smith, R. D., Qian, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+microscale+separations+towards+nanoproteomics+applications.">Advances in microscale separations towards nanoproteomics applications.</a> Journal of Chromatography A. 1523, 40-48 (2017).</li><li>Clair, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially-resolved+proteomics:+Rapid+quantitative+analysis+of+laser+capture+microdissected+alveolar+tissue+samples.">Spatially-resolved proteomics: Rapid quantitative analysis of laser capture microdissected alveolar tissue samples.</a> Scientific Reports. 6, 39223 (2016).</li><li>Huang, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNaPP:+Simplified+nanoproteomics+platform+for+reproducible+global+proteomic+analysis+of+nanogram+protein+quantities.">SNaPP: Simplified nanoproteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities.</a> Endocrinology. 157 (3), 1307-1314 (2016).</li><li>Andrasfalvy, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-based+multiphoton+fluorescent+pipettes+for+targeted+neuronal+electrophysiology.">Quantum dot-based multiphoton fluorescent pipettes for targeted neuronal electrophysiology.</a> Nature Methods. 11 (12), 1237-1241 (2014).</li><li>Huang, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNaPP:+Simplified+nano-proteomics+platform+for+reproducible+global+proteomic+analysis+of+nanogram+protein+quantities.">SNaPP: Simplified nano-proteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities.</a> Endocrinology. 157 (3), (2016).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263 (4 Pt 2), F601-F606 (1992).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+glomerular+permeability+of+fluorescent+macromolecules+using+2-photon+microscopy+in+Munich+Wistar+rats.">Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li><li>Sandoval, R. M., Kennedy, M. D., Low, P. S., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+trafficking+of+fluorescent+conjugates+of+folic+acid+in+intact+kidney+determined+using+intravital+two-photon+microscopy.">Uptake and trafficking of fluorescent conjugates of folic acid in intact kidney determined using intravital two-photon microscopy.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 287 (2), C517-C526 (2004).</li><li>Salmon, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+endothelial+glycocalyx+links+albuminuria+and+vascular+dysfunction.">Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (8), 1339-1350 (2012).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Мы представляем метод для доступа к боуменова пространства-поверхность клубочков в мышей, облегчается 2-Фотон микроскопии. Мы разработали эту процедуру для решения ключевых ограничение клубочковых micropuncture, редкость поверхности клубочков адресуются по микроскопии 1-Фотон в мышей, для облегчения объективной экспериментальный, аспирации жидкости из боуменова пространства для последующий анализ. Развития и практики этого метода основывается на шести важных шагов. Во-первых Роман хирургической подготовки должны тщательно осуществляться таким образом, что изображений водяного столба не бежать coverslip и coverslip простирается над районом почки, который является целевым объектом пипеткой. Во-вторых стеклянные пипетки для micropuncture должно быть вынесено видимым для микроскопии 2-фотон, которая достигается использованием квантовых точек. В-третьих, стереотаксическая техника требуется точно позиционировать пипетки в пространстве боуменова в трех измерениях, до 100 мкм ниже поверхности почек. Таким образом регистрации систем координат пипетки и стадии с точностью являются важнейшие шаги. В-четвертых, тщательный выбор целевого glomerulus необходимо убедиться, что она доступна для пипетки без покушение структуры поддержки почек и изображений столбец. И наконец внимание должно уделяться аналитически шаги следовать процедуре приобретения, и объем и сроки приобретения жидкости образцов должны соответствовать к анализу и клубочковых физиологии.
Мы разработали процедура приобретения, которая может быть распространена на многие анализов, включая традиционные micropuncture конечных точек, например пламенной фотометрии, Ион чувствительных Электроды измерения или измерения давления, объема или заряда. Кроме того мы считаем, что этот метод будет поддаваться Роман аналитически конечных точек, включая полимеразной цепной реакции (возможно после обратной транскрипции для miRNA) и метаболомики вниз по течению, масс-спектрометрии. Специальные модификации, используемых для облегчения масс-спектрометрии, заслуживают дополнительного обсуждения, и они налагают определенные ограничения. Во-первых хотя масс-спектрометрия очень чувствительна, Низкопротеиновое содержание и объем micropuncture образцов оказывает анализа белка ниже динамический диапазон обычных протеомических исследований, и поэтому были упрощенный nanoproteomics необходимости. 8 , 13 во-вторых, чтобы оптимизировать урожайность белка для раннего анализов, мы определили, что 200-300 nL аспирата было необходимо, но de novo фильтрата приобретение этого тома может быть столько, сколько 20 минут аспирации потребовало бы если мышь Федеративная Республика Германия является только 8-14 nL 3/мин. Как Тодзио и Endou показали, что длительное стремление изменяет содержание альбумина ранних проксимальных канальцах жидкости14, мы избрали аспирационная более 6 минут; Однако это означает, что наши стремления скорость превышает скорость приток фильтрата. Пользователям этой процедуры рекомендуется рассмотреть физиологии клубочковой фильтрации в их экспериментальной системы в разработке их рабочего процесса. Масс-спектрометрия, чувствительной технологией, будут перегружены сигнал от введено нефтяной дистиллят как минеральное масло, которое широко используется в micropuncture составляют гидравлической системы для аспирации и изолировать сегментов нефрон. Таким образом мы не могли использовать минеральное масло для этой цели, или его общего использования, количественная оценка объема nanoliter диапазон образцов. Вместо этого мы заполняем систему Перфтордекалин, который является биологически инертным, не беспокоить масс-спектрометрии и имеет благоприятные оптические характеристики. Мы считаем, что ограничения, налагаемые Перфтордекалин преодолимыми и работают на дополнительных технических инноваций, которые мы ожидаем, что позволит измерение объема выборки и блокады трубчатых сегмента.
Большинство micropuncture исследования были проведены в Мюнхене-крыс, которые демонстрируют увеличение числа поверхности клубочков, но это значительно ограничены физиологическое исследование трубчатых транспорта и других почечных физиологии за потери основных инструмент, молекулярной биологии, трансгенных мышей2,3. Потому что он облегчает доступ микропипеткой боуменова пространства в мышей, Роман технику поэтому снижает эти критические ограничения. Мы приняли этот метод для доступа к почечной фильтрата для протеомических исследований с помощью масс-спектрометрии высок чувствительности, известный как nanoproteomics9. Однако есть вероятно дополнительного приложения. К примеру почечной физиологическое исследование отфильтрованных белка был значительно помог с использованием трасеров флуоресцентной с 2-Фотон микроскопии15,16,17. Дополнение micropuncture к 2-Фотон микроскопии предлагает возможность выполнения сингл нефрон физиологическое исследование с флуоресцентных молекул, позволяя соседних, не вводили нефронов в качестве элементов управления. Остается надеяться, что это четкое объяснение необходимые шаги позволят широкое принятие в лабораториях, уже оборудованы 2-Фотон микроскопии и/или micropuncture. Хотя это сложный, мы выполнили эту процедуру сейчас много раз и уточнения, представленные в настоящем документе представляют собой стабильную платформу для физиологического обнаружения.

Цель этой процедуры является рутинной micropuncture доступа к боуменова пространства и других клубочковых структур в мышах. Micropuncture исследования для почечной физиологии были ограничены 1-Фотон микроскопии, который может только изображения в несколько микрон поверхности почек, и который предлагает ограниченной точности в измерении z. Потому что мышей несколько поверхности клубочков, это не всегда возможно найти поверхности glomerulus на 1 Фотон микроскопии, поэтому большинство micropuncture исследования были проведены в Мюнхене-крыс, которые имеют более многочисленные поверхности клубочков. Таким образом преимущества работы в моделях мыши были ограничены в micropuncture исследования,12,3. Последние достижения в технологии, включая микро CT4,5, imaging наночастиц изображений6и изображений масс-спектрометрии7 значительно расширили спектр механизмов, применимых к клубочковых физиологии, но по-прежнему существует не заменит для уникальной предоставляет возможность вмешаться и образец что micropuncture. Поэтому расширение использования micropuncture с использованием представленные здесь методики, как ожидается, облегчить Роман почечной физиологии исследования, в частности, оценки содержания почечной фильтрата (то есть, метаболомики) и основные физиологии трансгенных мышей, такие как измерения давления фильтрата и обязанности, ранее выполнявшиеся только у крыс.
В этой технике использование 2-Фотон микроскопии позволяет визуализации и микропипеткой доступ к почечной структур до около 100 мкм ниже почечной капсулу. Несколько (5-10) клубочков таким образом доступны для micropuncture в каждой мыши почек отображаемого в данный момент. Хотя этот метод имеет общие черты с обычными почечной micropuncture, он был разработан de novo и требуются обширные изменения от обычного метода. В этом протоколе мы продемонстрировать стремление жидкости из пространства боуменова и показать пример результаты последующего анализа с масс-спектрометрия (nanoproteomics)8,9,10,11. Вниз по течению масс-спектрометрии для использования специализированных образец рабочего процесса подготовки, который также продемонстрировали здесь.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright 2 photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 7MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 axis microscope stage controller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 axis headstage controller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HL-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 2000 kDa MW</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52471-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary tubes</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>B150-110-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum dots, 605 nm</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Q21701MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysiloxane</td>
			<td>Sugru</td>
			<td>No cat number</td>
			<td>www.sugru.com, &#34;original formula&#34;. Any color.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-50 tubing</td>
			<td>Instech Labs</td>
			<td>BTPE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>WPI</td>
			<td>UMP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector controller</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Micro4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfluorodecalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>306-94-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip, 10 mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>64-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>Custom</td>
			<td>No part number</td>
			<td>Common in neuroscience labs, many suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head fixation device</td>
			<td>Custom</td>
			<td>No part number</td>
			<td>Common in neuroscience labs, many suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needle</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>125393</td>
			<td>For retroorbital injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin syringe</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>309626</td>
			<td>For retroorbital injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micropuncture of bowman's space in mice facilitated by 2 photon microscopy

Почечная micropuncture и почечной 2-фотонных изображений являются семенных методы в физиологии почек. Однако micropuncture ограничивается зависимость от обычных микроскопии поверхности нефрон функции, и 2-Фотон исследования ограничены в том, что вмешательство может оцениваться только на орган, а не на уровне нефрон. В частности micropuncture исследования клубочков мышей были оспорены, нехватки поверхностных клубочков мышей. Чтобы устранить это ограничение для того, чтобы проводить исследования аспирата из боуменова пространства в физиологической модели мыши, мы разработали 2-Фотон клубочковых micropuncture. Мы представляем Роман хирургической подготовки, что позволяет боковой доступ к функции почек при сохранении вертикальных изображений столбец требуется для 2-Фотон микроскопии. Администрация высокой молекулярной массой флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-декстрана используется для отображения видимой для визуализации 2-Фотон почечной сосудистую и, следовательно, клубочков. Квантовая точка покрытием пипетки затем представил под стереотаксической руководством по glomerulus, выбранные из несколько, чтобы многие из которых могут быть визуализированы в окне визуализации. В этом протоколе мы предоставляем подробную информацию о подготовке, материалы и методы, необходимые для выполнения процедуры. Эта технология облегчает ранее невозможно физиологическое исследование почек, включая восстановление фильтрата из боуменова пространства и все сегменты нефрон внутри изображений предел глубины, около 100 мкм ниже почечной капсулу. Давление, заряд и поток может все измерить введено пипеткой. Здесь мы предоставляем репрезентативных данных из жидкого хроматография/масс-спектрометрии, выполнена на аспирата из боуменова пространства. Мы ожидаем эту технику, чтобы иметь широкое применение в почечной физиологические исследования.

Эта процедура требует уникальный хирургической подготовки почки для доступа, который иллюстрируется на рисунке 1и 2-фотонных изображений. Эта подготовка, показанный здесь позволяет вертикальных изображений столбец с целью выше почки с несколько изменения плотности для оптики лучшие возможности для микроскопии 2-Фотон одновременно с боковой доступ для дозаторов, исключительно в горизонтальной (x ) измерение. Частичное экструзии почки предотвращает избыточное напряжение на ножке почек и сохраняет кровоток, и строительство пользовательских почек поддержки позволяет две цели визуализации и доступа. Второй задачей в этой процедуре является точное позиционирование пипеткой внутри почек в 3 измерениях, который требует регистрации систем координат пипетки и стадии. Важный шаг для этот процесс проиллюстрирован в Рисунок 2, который показывает пипеткой быть заметили в столбце воды 2-Фотон микроскопа под DAPI-возбуждения. Ввод толщу воды и регистрации координаты пипеткой тем этапа перед входом почки имеет решающее значение для точного позиционирования стереотаксической пипеткой внутри Боумен целевого пространства. Дозатор поступает изображений водяного столба от права. С возбуждением DAPI включено красный Квантовая точка покрытием пипеткой флуоресцирует ярко в красно оранжевый, и он тщательно может располагаться в середине цели. Как возбуждения луч проходит через центр цели, дозатор может свободно переехал в точке максимальной флуоресценции, обеспечение того, что она будет видна в окуляр.
Выбор надлежащего пипеткой потянув и glomerulus решающее значение для успеха этого протокола, как показано на рисунке 3, Рисунок 4, на рисунке 5. В рисунке 3Aможно увидеть должным образом вытягивано, красный люминесцентные Квантовая точка покрытием стекла микропипеткой, отображаемого в столбце жидкости во время регистрации часть пипетки процедуры. Tip – 6 микрон в ширину. В рисунке 3Bпоказано с 12 мкм кончиком пипетки, плохо вытащил. Этот пипетки не может проникнуть почечной капсула не вызывая сосудистой травмы в результате 12 мкм диаметром и нерегулярных кончик поверхности (Примечание Бур в верхней части скоса). В рисунке 3 c и 3Dпоказана важность оптимального позиционирования вместо изображений из целевого glomerulus. Красивые, вблизи поверхности glomerulus, показано на рисунке 3 c демонстрирует благоприятные изображений (из-за своей поверхности позиции в 20 мкм ниже капсула почек), но не будут пригодны для доступа к этой процедуре, потому что это слишком близко к поверхности, и Дозатор бы ударил coverslip. В рисунке 3Dпоказываются оптимально позиционируется клубочков. Обратите внимание на различные шкалу, используемый для иллюстрации оба клубочков (Масштаб гистограммы являются все 50 мкм). Эти клубочков появляются менее острым из-за рефракции, вызванных глубины; Этот образ был взят на 70 мкм ниже почечной капсулу. Край боковых почек — 250 мкм справа, оба этих клубочков доступности. Во время процедуры доступа изображения плотно сосредоточена на целевой glomerulus как показано на рисунке 4, и захвата изображений каждый второй используется, позволяя следователь точно соблюдать позиционирование пипетку в пространстве Боуман.
Рисунок 4 иллюстрирует типичный почечной вход и результат, наконечник пипетки боуменова пространстве. В рисунке 4Aпроекции средней интенсивности от z стека с ортогональных демонстрирует наконечник пипетки в пространстве Боуман. Обратите внимание, что красная пипеткой кончик спектральных артефакт (круглый шар флуоресценции) из-за чрезвычайно яркий флуоресцентной квантовых точек, расположенных на конической части кончика. В Рисунок 4Bтома проекция z стек данных демонстрирует другой пипетку в пространстве Боуман. Обратите внимание, что пипетки вытащили Bowman's капсула в направлении движения на въезд, создавая очевидной палаток за кончик, как описано в протоколе.
На рисунке 5результаты неудачных процедуры указаны в котором пипетки с слишком большим отверстием сломал в почечной капсула, вызывая кровотечение. Пипеткой был слишком тупой; При попытке пройти почечной капсулу, капсулу толкнул впереди наконечник пипетки пока поломка произошла. В этот образ капсула почек является видимым, усиливается subcaspular кровотечение, FITC-флуоресцентный зеленый. FITC сигнал видимым в пипетку, сам, указывающее крови под давлением вступил пипеткой люмен. Стрелка указывает много красных кровяных клеток, видимый в пределах пипеткой просвета как замещения дефектов в FITC-декстрана.
Рисунок 6 изображает представитель массовых спектр полученные от боуменова пространства аспирата, мыши моче белок 17 (MUP17). Наконец Таблица 1 демонстрирует пример результаты успешных стремление процедур, листинг белки, выявленных с помощью масс-спектрометрии наноразмерных на аспирата, собраны более 6 минут от каждой из 3 мышей. В каждом случае пипеткой был образ он был отозван из боуменова пространства, а не FITC флуоресценции наблюдалось в пределах боуменова пространства или пипетки люмен, что указывает отсутствие загрязнения аспирата с плазмой. 17 белков, главным образом низкой молекулярной массой, были определены от минимум 2 уникальных пептидов на белок. Спектральная графов низкий, в соответствии с предварительной оценки белка в клубочковых фильтрата, и известный отфильтрованных белков, таких как витамин D связывания белков (VTDB), альбумина (АЛБУ) и основных моче белок 17 (MUP17) присутствуют.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig1.jpg"> Рисунок 1: частичное экструзии почки с пользовательской поддержки и иммобилизации для боковых доступа. Слева показаны части поддержка обработки изображений столбец и почек, с полным собранием в центре. Справа, подготовка почек показано до (см. выше) и после (применения поддержки см. ниже). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig2.jpg"> Рисунок 2: завершено почек prep на этапе регистрации пипеткой протокола. Здесь DAPI возбуждения используется для позиционирования микропипеткой в толщу воды 2 фотона микроскопа. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig3.jpg"> Рисунок 3: Imaging пипетки и почек после инъекции FITC-декстрана, демонстрируя подходящих и неподходящих клубочков для micropuncture. A. хорошо вытащил пипетку с 6 мкм кончиком. B. грубой обрезная, тупой совет. C. эта glomerulus четко, но слишком близко к coverslip для micropuncture. D. Подходяще позиционируется клубочков. Масштаб гистограммы являются все 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig3large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig4.jpg"> Рисунок 4: успешный пипеткой проход приводит к размещение в боуменова пространства вид от 2 различных процедур. A. Z-стек с ортогональной проекции демонстрирует наконечник пипетки в пространстве боуменова примыкающих клубочковых пучок. Шкалы бар-50 мкм. б. Объемный рендеринг из z стека аналогичным образом демонстрирует пипетки в пространстве боуменова примыкающих клубочковых пучок. Шкалы бар-100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig4large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig5.jpg"> Рисунок 5: процедура неудачной из-за тупой пипетки, разрывая почечной капсулы и ведущих к кровотечению в пипетку люмен. FITC флуоресценции из extravasated плазмы и эритроцитов (стрелка) видны в пипетку. Стрелка указывает на красные кровяные клетки видимым в пипетку люмен. Шкалы бар-50 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig5large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig6.jpg"> Рисунок 6: массовые спектр для основных моче белок 17 (MUP17), полученные из наноразмерных жидкой хроматография/масс спектрометрии анализ аспирата пространства боуменова. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Белка</td>
			<td>МВт (kD)</td>
			<td>Значит, спектральные фото</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTA_MOUSE</td>
			<td>42</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACTB_MOUSE</td>
			<td>42</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CLPX_MOUSE</td>
			<td>69</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>DHSA_MOUSE</td>
			<td>73</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>FOLR2_MOUSE</td>
			<td>29</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>GBLP_MOUSE</td>
			<td>35</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>ALBU_MOUSE</td>
			<td>66</td>
			<td>6.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBA_MOUSE</td>
			<td>15</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBB1_MOUSE</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MIB1_MOUSE</td>
			<td>110</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MUP17_MOUSE</td>
			<td>21</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>PERI_MOUSE</td>
			<td>54</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNAS4_MOUSE</td>
			<td>17</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>SPTB1_MOUSE</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>VIME_MOUSE</td>
			<td>54</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>VTDB_MOUSE</td>
			<td>53</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Список белков, выявленных в боуменова пространства аспирата из 3 мышей.
Дополнительные видео 1: объемный рендеринг из z стека, приобретенные после позиционирования пипетки в пространстве боуменова демонстрирует наконечник пипетки в пространстве, примыкающих капиллярных Клок. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/0128a-3dview03162018-3.avi">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy at JoVE.com

Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

Micropuncture боуменова пространства в мышей, облегчается 2 фотона микроскопия

Мы представляем использование 2-Фотон микроскопии поставить микропипеткой боуменова мочевыводящих пространстве в мышей, сочетая 2 основополагающими методами почечной физиологии. Использование 2-Фотон микроскопии преодолевает критические ограничения обычных микроскопии для исследования почек физиологии micropuncture.

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы по однонефроновой физиологии, включая гломерулярную скорость фильтрации системных белков и метаболитов и их вклад в трубчатую физиологию. Основным преимуществом этой техники микропунктюра является то, что он позволяет получить доступ к космосу Боумана и корковому нефрону у всех мышей. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, поскольку она требует правильно выполненных шагов подготовки.После подтверждения отсутствия ответа на щепотку ноша, нанесите мазь на глаза и использовать ленту для обездвиживания конечностей от 20 до 25 граммов взрослой мыши. Используйте крем для удаления всех волос на левой стороне животного, и использовать селезенку, чтобы найти левую почку через кожу на спинной и хвостовой стороне селезенки. Сделайте 0,5-сантиметровый разрез в коже, а затем меньший разрез в брюшной полости достаточно большой для почки, чтобы быть проталкивается.Выдавить почку с нежным давлением и поместить полисилоксановый стабилизатор почек форму вокруг ткани. Выровните почку вверх с spacer так что более десхальная поверхность почки удлиняет за стабилизатором около одним миллиметром, и фиксирует почку к форме с клеем cyanoacrylate. Клей головную пластину к форме стабилизатора и смонтировать головную пластину для монтажа баров на базовой пластине.Затем заполните колодец в поддержке полисилоксана раствором агарозы и удерживайте 10-миллиметровую крышку на верхней части формы до тех пор, пока агароза не будет твердой. Печать крышки скольжения к голове пластины с клеем и создать кольцо вокруг крышки скольжения с зубным цементом. Затем ввините от 100 до 150 микролитров ретро-орбитальной FITC-Dextran и быстро переместит мышь и пластину фиксации на двухкотонную стадию микроскопа.После ручного фокусировки на поверхности почек, переключитесь на несканируемый двухфотографий режим и исследуйте окно изображения, чтобы найти целевой гломерул, который больше, чем 30 микрометров ниже крышки скольжения и менее 400 микрометров от боковой капсулы почки. Завехать боковое и вертикальное расстояние до цели glomerulus. Затем зайдите координаты сцены x, y и z для glomerulus.И, наконец, поднять объективный координационный центр примерно на один миллиметр в колонку воды, не изменяя координаты x и y stage. Заготовите наконечник пипетки в колонку воды и включите возбуждение DAPI. Перемести пипетку в размеры x и y до точки максимальной флуоресценции кончика.Это будет центром цели. Измените настройку цитирования x на красный флуоресцентный белок и визуализируете пипетку с глазным, чтобы обеспечить точное центрирование глазного вида. Переключитесь на двух-фотон, чтобы найти пипетку под живым двух-фотоном зрения и разместить наконечник именно в центре изображения, это положение регистрации.Затем сохраните изображение пипетки и зарегистрируйте координаты сцены и контроллера микропипеда. Удалите пипетки из колонки воды в х-оси, не перемещая y и z-оси и переместить пипетки z к цели glomerulus z-координаты и края почки. Обратите внимание на этап x и вычислите пипетку края почки x с помощью смещения от стадии регистрации x.Увеличьте стадию x, чтобы переместить сцену к пипетке, пока край почки не будет далеко слева от экрана, оставаясь видимым. Быстро заранее пипетки около 100 микрометров от почки края пипетки X только что вычислил. Увеличьте красный усиления и начать продвижение пипетки кончик медленно к краю почки под живой двух-фотонной визуализации при мониторинге красный пиксель гистограммы.Привод пипетки в x-оси медленно glomerulus целевой пипетки х, следя за сценой х. По достижении glomerulus, документ позиции с z-стек. С пипеткой в положении, установить микропамп для введения 100 нанолитров перфторекалина в течение двух минут.Для обеспечения проходимости пипетки, а также уменьшить путаницу от пипетки подключения во время входа. После четырех-шести минут фильтрации установите микропамп для аспирации до 300 нанолитров со скоростью до 50 нанолитров в минуту. Этот красивый, вблизи поверхности glomerulus демонстрирует благоприятную визуализацию из-за поверхностного положения glomerulus на 20 микрометров ниже почечной капсулы.Glomerulus слишком близко к поверхности для микроинъекции однако, как пипетка ударит крышку скольжения. Эти гломерули оптимально расположены с боковой краями 250 микрометров вправо и появляются менее острыми из-за преломления, вызванного их 70 микрометровой глубиной от капсулы. Оба фактора, которые делают glomeruli доступным.В этом типичном изображении ввода почек, средняя проекция интенсивности от z-стек с ортогональными видами показывает наконечник пипетки в пространстве Боумана, обратите внимание на красную пипетку наконечник спектральный артефакт от чрезвычайно яркой флуоресценции квантовых точек расположены на конической части кончика. Здесь, объем рендеринга от z-стек приобрел после позиционирования пипетки в пространстве Боумана, показывает пипетку наконечник в пространстве, примыкающих капиллярный пучок. Если используется пипетка со слишком большим отверстием, почечная капсула может сломаться, вызывая субкапсулярное кровотечение и вход крови в люмен пипетки.Используя этот метод, 17 белков, в первую очередь низкого молекулярного веса, были определены как минимум из двух уникальных пептидов на белок. В сочетании с этим методом, другие методы, такие как маспектроскопия, ионные чувствительные измерения электродов, и флуоресцентные инъекции антител могут быть использованы для ответа на вопросы о роли светящихся растворов в трубной и гломерулярной физиологии.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Разбор и 2-Фотон изображений периферических лимфатических узлов у мышей

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Натурные съемки Мышь Thymus Использование 2-Фотон микроскопии

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

Метод 2-Фотон изображений кровотока в коре головного мозга через черепной Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

В Vivo 2-Фотон изображений кальция на уровне 2 / 3 от мышей

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Генерация костного мозга мышей Производные дендритных клеток для использования в 2-фотонных изображений

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

В естественных условиях Количественная оценка G белком рецептор взаимодействий с использованием спектрально Решено Двухфотонное микроскопии

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ортогональные очистки белков Ведущий: Малый Биспецифичные тегов Affinity

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

В естественных условиях клоновых Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников оцениваться пятью флуоресцентных белков с помощью конфокальной и многофотонной микроскопии

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Фекальные глюкокортикоиды Анализ: безоперационная Надпочечная Мониторинг в Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...