Name: a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells
Uploaded: 2018-09-06T14:00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

Vi takker Veronica Schreiter for hendes fremragende teknisk bistand og nyttige ændringer af de etablerede kryopræservering teknik og celle kultur model. Derudover vil vi gerne takke Maren Anders og Swanhild Rodewald for deres fremragende teknisk bistand i den efterfølgende analyse.

Bemærk: Kvæg æggestokkene blev indhentet fra en kommerciel slagteri. Samling af slagteriet biprodukter kræver ikke en etisk godkendelse efter den tyske lov.
1. arbejds- og præparater
<ol><li>For at sikre, at steriliteten, udføre alle medier og væv forberedelse samt alle kultur arbejde i en specialiseret celle kultur lab ved hjælp af et laminar flow bench.</li>
	<li>Forberede 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS, pH 7,4) suppleret med 100 IE penicillin, 0,1 mg/mL streptomycin og 0,5 µg/µL amphotericin til transport af æggestokkene. Bemærk: Maksimal varighed mellem modtagelse af æggestokkene og isolere GC er 2 h i dette set-up.</li>
</ol>2. isolering af kvæg Granulosa-celler
<ol><li>
Vask æggestokkene flere gange i 1 x PBS (med 100 IE penicillin, 0,1 mg/mL streptomycin og 0,5 µg/µL amphotericin) for at fjerne enhver blod fra overfladen før du begynder proceduren isolation. Bruge et bægerglas, placere æggestokkene inde, fylde det med 1 x PBS, og kassér PBS igen.
	<ol>
<li>Gentag trinnet vask 3-4 x, indtil æggestokkene er renset fra enhver resterende blod.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tørre en æggestok med en lab tørre vædet med 70% alkohol, for at minimere eventuelle forureninger.</li>
	<li>Med en 3 mL sprøjte og en 18 G kanyle, Aspirér GC ved punktering små til mellemstore follikler (< 6 mm, målt med en lineal), og samle den follikulære væske i et 50 mL-centrifugerør. Bemærk: For at fugte sprøjten, tage en lille mængde af 1 x PBS (med 100 IE penicillin, 0,1 mg/mL streptomycin og 0,5 µg/µL amphotericin). Dette hjælper med at indsamle små mængder af follikulært væske og forhindrer celler i at klistre inde i sprøjten.</li>
	<li>Efter punktering flere follikler, skyl sprøjte og kanyle med 1 x PBS for mellemliggende rengøring.</li>
</ol>3. kryopræservering af celler
<ol><li>
Bruge trypan blå farvning og tælle celler under en hemocytometer.
	<ol>
<li>Hvis du vil tælle antallet af levedygtige celler, forberede en tube med 1,5 µL af en 0,25% trypan blå løsning. Bemærk: De levende celler vil forblive unstained, fordi trypan blå kan kun få adgang til den celle barriere af døde celler, som derefter vises blå.</li>
		<li>Tilføje 15 µL af granulosa cellesuspension til trypan blå løsning og bland dem forsigtigt.</li>
		<li>Placer blandingen i begge kamre i en hemocytometer. Tæl antallet af levende (f.eks.unstained) celler i en stor firkant pr. kammer. Bemærk: Selvom nogle blodlegemer kan ses, de kan skelnes på deres meget lille størrelse.</li>
		<li>Beregne antallet af levende celler med middelværdien af begge kammer firkanter ifølge de generelle retningslinjer; andelen af levende celler kan variere mellem æggestokkene men må overstige 60%13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tage en prøve fra frisk isolerede granulosa celle pool som en henvisning til yderligere analyse.
	<ol>
<li>Afhængigt af celletal af isolerede GC, afsætte et passende antal celler som referenceprøver for RNA, DNA eller protein forberedelse. Bemærk: For RNA isolering og den efterfølgende evaluering af Gen-ekspression, 1 x 105 celler er tilstrækkelige, mens andre efterfølgende analyser kan kræve forskellige, generelt højere celle numre.</li>
		<li>Placere en eller flere delprøver af reference celler i en frisk tube og centrifugeres i 1 min. ved stuetemperatur og maksimal hastighed (12.000 x g) at opnå en celle pellet. Supernatanten.</li>
		<li>Straks chok-fryse prøverne i flydende kvælstof. Butik prøve ved-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Udføre kryopræservering som følger.
	<ol>
<li>Forberede indefrysning medium ved hjælp af 80% føtalt kalveserum (FCS) og 20% dimethylsulfoxid (DMSO).</li>
		<li>For at kunne forsigtigt pellet GC, centrifugeres GC i 3 min. ved stuetemperatur og 500 x g.</li>
		<li>Fjern supernatanten omhyggeligt og forsigtigt resuspend cellerne i 100% FCS (fx, 1 mL) indtil nogen mere celle klumper er synlige.</li>
		<li>Tilføje 1 volumen (fx, 1 mL) af den forberedte indefrysning medium til cellesuspension og Overfør blandingen til en kryogene hætteglas. NOTE: Den endelige koncentration af cryo-beskytte medierne vil være 90% FCS og 10% DMSO.</li>
		<li>Anbring kryogene hætteglasset i en specialiseret (kommercielt tilgængelige) indefrysning beholder, der forhindrer Hurtig nedfrysning. Den kølende prøverne bør ikke overstige 1 ° C/min. overførsel indefrysning beholderen i en-80 ° C fryser i mindst 4 timer.</li>
		<li>For længere opbevaring, skal du placere kryogene hætteglassene i ultra-lav temperatur beholdere (f.eks., flydende fase kvælstof containere). Bemærk: Protokollen kan stoppes her, da kryopræservering giver mulighed for længere opbevaring.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. forberedelse af medier og kultur plader til cellekultur
<ol><li>
Frakke celle kultur plader med 0,02% kollagen R. Bemærk: Kollagen Rasmussen er kendt for at være afgørende for en bedre vedhæftning af GC i kultur.<ol>
<li>Forberede en 0.02% kollagen R løsning med renset vand egnet til cellekultur.</li>
		<li>Tilføj 150 µL pr. brønd i en 24-godt plade (= 2 cm2/godt) og sikre, at hele overfladen af kulturen godt er omfattet med kollagen R løsning.</li>
		<li>Lad opløsningen tørre med låg åbent et par timer eller natten over i laminar flow hætte.</li>
		<li>Når kultur plader er helt tørre, bestråle dem med UV-lys for 10-15 min at minimere forurening.</li>
		<li>Hvis det er nødvendigt, skal du gemme plader ved 4 ° C i op til 2 måneder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede medier og kosttilskud for kultur arbejde under en laminar flow hætte. For en vellykket genopretning af GC skal de behandles umiddelbart efter optøning.</li>
	<li>
Forberede følgende medier.
	<ol>
<li>Supplere α-Minimal afgørende Medium (α-MEM) med 2 mM L-glutamin, 0.084% natriumbikarbonat, 0,1% bovint serumalbumin (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/mL natrium selenite, 5 µg/mL transferrin, 10 ng/mL insulin og 1 mM ikke-essentielle aminosyrer.</li>
		<li>Derudover tilføje 100 IE penicillin og 0,1 mg/mL streptomycin til medierne. Bemærk: Antibiotika, når varmede, er stabilt for ca 48 timer. Derfor alikvot den ønskede mængde af medier for kultur set-up og planlagte medier udveksling. Pre varme kun medier delprøver til 37 ° C i et vandbad. Rede medierne kan opbevares ved 4 ° C i højst 3 måneder.</li>
		<li>For at fremkalde steroid aktivitet i kulturperler bovin GC, supplere α-MEM desuden med 20 ng/mL follikel - stimulerende hormon (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 og 2 µM androstenedion. Bemærk: Altid supplere disse komponenter kort før starten på en kultur eller medier udveksling. Undgå gentagne fryse-tø cykler for FSH og IGF-1 stamopløsninger, da det kan kompromittere den steroid aktivitet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. celle kultur arbejde
<ol><li>Tø celler hurtigt i vandbad ved 37 ° C i 3 – 4 min. og overføre cellesuspension til 37 ° C pre varmede α-MEM (uden hormon supplement). Centrifugering anbefales en endelige mængden af 10 mL.</li>
	<li>Der centrifugeres GC i 3 min. ved stuetemperatur og på 500 x g. Supernatanten. Tilføje pre varmede og suppleres med α-MEM og resuspend cellerne omhyggeligt.</li>
	<li>Frø GC med en tæthed på 1 x 105 eller 1 x 106 celler pr. brønd i en endelige mængden af 500 µL. omfatter tekniske replikater af mindst tre kultur wells pr. betingelse.</li>
	<li>Inkuber cellekultur i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 til 8 d.</li>
	<li>Udføre en medier udveksling hver anden dag. Udskift kun to tredjedele af dyrkningsmedier til at reducere stress og til at lette tilpasningen af celler til den friske medier. Bemærk: GC udgør en typisk fibroblast-lignende fænotype efter et par dage i kultur og har tendens til at klynge sammen. I celle højdensitet kultur, er større klynger fundet oftere i forhold til normal tæthed GC kultur (figur 1, venstre vs højre panel).</li>
</ol>6. den efterfølgende analyse af kulturperler Granulosa-celler
<ol><li>At udføre steroid hormon analyse, indsamle medierne og fryse det ved-20 ° C. Brug egnede metoder til at analysere østradiol og progesteron koncentrationen i de brugte medier [fx radioimmunoassay (RIA)]14.</li>
	<li>For den efterfølgende analyse af forskellige målmolekyler (RNA, DNA, proteiner, etc.), lyse celler direkte i kultur parabol med en passende lysing agent som anbefalet af leverandøren. Bemærk: For de fleste isolationsprocedurer, det er muligt at stoppe protokollen her, som de lysed celler kan opbevares ved-20 ° C i op til 1 uge. For længere opbevaring, skal cellerne opbevares ved-80 ° C.</li>
	<li>Til at bestemme udskrift overfloden, syntetisere cDNA og måle specifikke udskrifter af kvantitative real-time polymerase kæde reaktion (qPCR) teknikker15. En statistisk vurdering bør omfatte mindst tre replications af forskellige cellekulturer, stammer fra forskellige celle præparater (biologiske replikater).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+antrum+formation+of+bovine+preantral+follicles+in+long-term+culture+in+vitro.">Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).</li><li>Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+luteinizing+hormone+as+a+survival+and+differentiation+factor+increases+oocyte+maturation+in+recombinant+follicle+stimulating+hormone-supplemented+mouse+preantral+follicle+culture.">Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture.</a> Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).</li><li>Paes, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+stress+on+the+survival+and+development+of+in+vitro+cultured+bovine+preantral+follicles+and+on+in+vitro+maturation+of+cumulus-oocyte+complex.">Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex.</a> Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).</li><li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+resource:+preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes.">Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li><li>Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+granulosa+cell+lines.">Ovarian granulosa cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).</li><li>Bernath, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+inhibits+fibronectin+gene+expression+in+a+newly+developed+granulosa+cell+line+by+a+mechanism+that+suppresses+cAMP-responsive+element-dependent+transcriptional+activation.">Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).</li><li>Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+between+freshly+isolated+and+spontaneously+immortalized+bovine+granulosa+cells:+protein+secretion,+steroid+metabolism,+and+responsiveness+to+growth+factors.">Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).</li><li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system:+induction+and+maintenance+of+estradiol+production,+response+to+follicle-+stimulating+hormone,+and+morphological+characteristics.">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).</li><li>Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+maintenance+of+oestradiol+and+immunoreactive+inhibin+production+with+FSH+by+ovine+granulosa+cells+cultured+in+serum-free+media.">Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).</li><li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Oestrogen+Synthesis+-+The+Two-Cell,+Two-+Gonadotrophin+Model+Revisited.">Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).</li><li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro.">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).</li><li>Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+plating+density+alters+the+ratio+of+estrogenic+to+progestagenic+enzyme+gene+expression+in+cultured+granulosa+cells.">Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells.</a> Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells.">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).</li><li>Schneider, F., Br&#252;ssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts.">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).</li><li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+altered+gene+expression+profiles+in+cultured+bovine+granulosa+cells+at+high+cell+density.">Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+promotes+specific+differentiation+in+bovine+granulosa+cells+depending+on+lactate+uptake+thus+mimicking+an+early+post-LH+stage.">Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15 (2018).</li><li>Yenuganti, V. R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+bovine+granulosa+cells+rapidly+lose+important+features+of+their+identity+and+functionality+but+partially+recover+under+long-term+culture+conditions.">Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).</li><li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells.">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li><li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period.">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Præsenteres celle kultur model giver et værktøj til at analysere granulosa celle differentiering in vitro. Flere undersøgelser viste, at et serumfrit dyrkning er en forudsætning for at opretholde steroid aktivitet i kulturperler bovin GC eller GC af andre arter8,9. Derudover forbedret belægning kultur fadet med komponenter i den ekstracellulære matrix (fx, kollagen R)13, udlæg i cellerne betydeligt. Et andet vigtigt element er perioden forlænget kultur. For nylig er blevet påvist, at en langsigtet kultur er nødvendig for at opnå tilstrækkelig steroidogene aktivitet og en afbalanceret udtryk for granulosa celle identitet markører17. Det vises, at GC kræver tid til at inddrive fra den fysiske stress under proceduren isolation.
Medier kosttilskud FSH, IGF-1 og androstenedion er kendt for at inducere aromatase aktivitet i kulturperler GC. Især, tilskud af androstenedion er absolut nødvendige, som GC har brug for en forløber for estradiol syntese. Dette har været offentliggjort tidligere11,18 , og derfor var ikke yderligere undersøgt under den foreliggende undersøgelse. En tilpasning af FSH, IGF-1 og androstenedion koncentrationer kan dog være nødvendigt for andre eksperimentelle set-ups.
Kryopræservering teknik beskrevet her kan bidrage til at forbedre tilrettelæggelsen af vævskultur eksperimenter ved at gøre dem mere uafhængige af varierende levering med æggestokke. Ifølge tidligere test, påvirker kryopræservering ikke GC fænotype eller steroid produktion i kultur. Også, overfloden af markør udskrifter i kulturperler celler afslørede ikke betydelige forskelle sammenligne prøver fremstillet af frisk isolerede celler med dem tidligere udsat for kryopræservering16.
En afgørende parameter for den nuværende GC kultur model er den celle plating tæthed. Som det fremgår af Repræsentative resultater, induceret øge plating tæthed bemærkelsesværdige ændringer af fysiologiske og molekylære karakteristika. Flere gener er reguleret på en bestemt måde, der ligner de ændringer, der er fremkaldt af LH stimulation i vivo4,19. Den omstændighed, at en stigende celle tæthed kan drive differentiering-lignende processer i kulturperler bovin GC har overvejes grundigt i denne GC i vitro model at undgå modstridende resultater mellem replikater. Derfor, modstridende resultater med andre undersøgelser kan tilskrives forskellige celle tætheder og bør undersøges nærmere.
Kultur model beskrevet her viste sig for at være ikke-lydhøre over for LH, som udskrifter af receptor LHCGR er tæt på detektionsgrænsen. Derfor, en simulering af LH surge både i vivo situation mislykkedes at inducere differentiering13. Ikke desto mindre, denne model giver et nyttigt værktøj for at studere østradiol-aktive GC i primære kultur, især som ikke funktionelle bovin GC linjer findes på nuværende tidspunkt.
Forskellige behandling protokoller kan afprøves i den nuværende GC kultur model, der medvirker til at optrævle reguleringsmekanismer steroid produktion eller GC differentiering. Yderligere, fælles faktorer, der er involveret i udviklingsprocesser kan analyseres særskilt. Derfor, denne kultur model giver grundlag for mange forskellige applikationer.

Vellykket ægløsning og luteinization afhænger af fint tunet og veltilrettelagt molekylære ændringer i forskellige somatiske follikulært celletyper. Da oplysninger om disse udviklingsmæssige processer ikke er endnu fuldt forstået, yderligere er afklaring påkrævet. In vivo tilgange er omfattende og kostbare og navnlig undlader at adresse specifikke molekylære mekanismer, der opstår under folliculogenesis. Derfor for reductionistic in vitro- modeller derudover at give indsigt i cellulære og molekylære detaljer. Forskellige undersøgelser beskrive kulturen i hele follikler i forbindelse med in vitro- befrugtning teknikker1,2,3. Fordi forskere er interesseret i mekanismer af differentiering, fokuserer mange undersøgelser på follikulært GC. Disse celler, direkte tilknyttet oocyt, er de vigtigste kilder til østrogen produktion og således spille en vigtig rolle i hele folliculogenesis og luteinization4.
Udødeliggjort celle linjer af GC er blevet udviklet fra forskellige arter. De fleste af dem, viser imidlertid ikke en tilstrækkelig steroid hormon produktion5. Hidtil har kun én cellelinje af kvæg GC har været etableret6, men denne linje mistede sin steroidogene aktivitet efter flere passager7. Derfor, siden steroidogenesis og især estradiol produktion er et væsentligt træk ved GC funktionalitet, er det tilrådeligt at studere disse aspekter i primære celle kultur modeller. I tidligere undersøgelser, blev det påvist, at en betydelig estradiol produktion kun kan overholdes under serumfrit kultur betingelser8,9. Videre er på, tilskud af en forløber for estradiol syntese en anden betingelse, som GC undlader at give udtryk for det nødvendige enzym, der kan konvertere progesteron til androstenedion10. Derudover afslørede de synergiske virkninger af FSH og IGF-1 tilskud i vitro en optimeret aktivitet af aromatase, det vigtigste enzym af estradiol syntese11. I denne protokol, er andre vigtige faktorer, der har en væsentlig indvirkning på GC kultur model også beskrevet. Navnlig har cellen plating tæthed kolossal indvirkning på resultatet af eksperimentet12. Derudover kunne en kryopræservering teknik af kvæg GC, der ikke griber væsentligt med GC fysiologi i kultur oprettes. Denne teknik hjælper med at forbedre tilrettelæggelsen af celle kultur arbejdet og til at optimere den foretrukne plating tæthed.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 182-05</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin (250 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2612</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe (Omnifix Luer)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>Roth</td>
			<td>C724.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-preservation vials (2 ml)</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 89020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX cell freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture dish, 24-well, flat bottom</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen R (0.2 %)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>F 0915</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin (200 mM)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1713</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1603</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin (10 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0516</td>
			<td>dissolved in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEA</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0293</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4021</td>
			<td>we prefer to use a stock solution of 2 &#181;g/ml, diluted in 0.9 % NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR3-IGF-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1146</td>
			<td>we use a stock solution of 2 &#181;g/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>androstenedione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46033</td>
			<td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

Æggestokkene granulosa celler (GC) er den største kilde til estradiol syntese. Induceret af preovulatory luteiniserende hormon (LH) bølge, celler i theca og navnlig granulosa cellelag dybt ændre deres morfologiske, fysiologiske og molekylære karakteristika og danner progesteron-producerende corpus luteum, der er ansvarlig for at opretholde graviditeten. Celle kultur modeller er væsentlige værktøjer til at studere de underliggende lovgivningsmæssige mekanismer involveret i de folliculo-luteal transformation. Præsenteres protokollen fokuserer på isolation procedure og kryopræservering af kvæg GC fra små til mellemstore follikler (< 6 mm). Med denne teknik, kan en næsten ren population af GC opnås. Kryopræservering procedure i høj grad letter tid forvaltning af cellekultur arbejde uafhængigt af en direkte primære væv (æggestokke) levering. Denne protokol beskriver et serumfrit celle kultur model, der efterligner østradiol-aktiv status for kvæg GC. Vigtige betingelser, der er væsentlige for en vellykket steroid-aktive cellekultur er diskuteret i hele protokollen. Det er påvist, at øge plating tæthed af celler inducerer et specifikt svar som angivet af en ændret gen expression profil og hormon produktion. Endvidere, denne model giver et grundlag for yderligere undersøgelser af GC differentiering og andre programmer.

GC forgyldt på 1 x 105 celler/brønd display en typisk fibroblast-lignende udseende, som de udgør en celle udvidelse sammenlignes med fibroblaster og har tendens til at bygge klynger (figur 1a og 1 c). Stigende plating tæthed af 10-fold til 1 x 106 celler/brønd ændre ikke morfologi men mere celle klynger kan observeres (figur 1b og 1 d, pile). Som allerede vist i en tidligere publikation forbedret kollagen belægning af kulturen retter i høj grad fastgørelse af celler13.
Indledende kryopræservering ændre ikke væsentligt de fysiologiske egenskaber af celler i kultur i forhold til dem direkte kulturperler fra frisk isolerede prøver. Dette er vist i figur 2 som udskrift overflod (målt ved qPCR) af flere markør gener ikke afviger når sammenligne kulturperler celler stammer fra enten frossen eller frisk isolerede puljer.
Figur 3 viser repræsentative resultater af steroid hormon analyse (målt ved RIA) i kvæg GC kulturperler på normal vs. høj densitet. Østradiol koncentration faldt betydeligt i high-density kultur i forhold til normal-density kultur, hvorimod progesteron produktionen tendens til at være højere.
En sammenlignende analyse af flere gener (målt ved qPCR) i høj - vs normal-density kulturer viste en signifikant effekt (figur 4). CYP19A1, kodning det vigtigste enzym estradiol biosyntesen aromatase, som gonadotropin receptor FSHR, blev betydeligt nedreguleret. Derimod viste generne, RGS2 og VNN2 en betydelig op-regulering. Disse resultater tyder klart på, at specifikke processer af cellulære differentiering er induceret ved at øge celle plating tæthed.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> Figur 1: kulturperler bovin granulosa celler ved normal (venstre paneler) og høj celle densitet (højre paneler). (en c) cellerne og kulturperler med en tæthed på 1 x 105 celler/brønd vises en typisk fibroblast-lignende fænotype. (b og d) GC kulturperler på en høj plating tæthed (1 x 106 celler/brønd) tendens til at danne store celle klynger (pile) hyppigere i forhold til celler under en normal tæthed (venstre panel). Skalere barer = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> Figur 2: sammenligning af celler dyrkes direkte efter isolation og kryopræservering. Cellerne var kulturperler med en tæthed på 1 x 105 celler pr. brønd. Genekspression af flere markør afskrifter blev evalueret og viste ingen forskel mellem kulturperler celler med eller uden en indledende kryopræservering. Boxplot viser medianværdien af n = 3. Tosidede Student's t-test, p-værdier er inkluderet. Denne figur er gengivet fra Baufeld og Vanselow16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> Figur 3: Steroid hormon koncentration i granulosa celler dyrkes på forskellige plating tætheder. Estradiol (E2) koncentrationen faldt betydeligt Hvornår GC blev kulturperler på en høj celle tæthed, der henviser til, at progesteron (P4) koncentration kun en tendens til at være højere. Hormon koncentration blev korrigeret for DNA-indhold til at normalisere for forskellige celle numre. Middelværdi og SEM af n = 3 er vist. p > 0,05, tosidede Student's t-test. Denne figur er gengivet fra Baufeld et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> Figur 4: Overflod af funktionelle centrale udskrifter i granulosa celler dyrkes på en normal vs. høj plating densitet. Kvæg GC kulturperler under serumfrit betingelser for 8 d afslørede en specifik regulering af flere valgte markørgener. Boxplot viser medianværdien af n = 3 individuelle replikater. p < 0,05, tosidede Student's t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

En langsigtet kultur model af kvæg granulosa-celler serumfrit betingelser er beskrevet. Denne model gør det muligt for forskere at studere virkningerne af forskellige faktorer og betingelser som forskellige plating tætheder på karakteristika ved produktion af østrogen bovin granulosa-celler.

En vævskultur Model af østrogen-producerende primære Bovine Granulosa-celler

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rotte levercellerne

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering og dyrkning af Mouse Primære Pancreas acinarceller

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion i zebrafisk til model akut nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

Primære kultur af rotte binyrebarkhormon celler og Assays af steroidogene funktioner

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

En ex vivo vævskultur model af brusk remodeling i kvæg knæ Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Vævs samling af flagermus til omics-analyser og primær cellekultur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolation og kultur af primære aorta endotelceller fra miniature grise

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Apoptose induktion og detektion i en primær kultur af Havagurk Tarmceller

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...