Name: a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells
Uploaded: 2018-09-06T14:00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

We bedanken Veronica Schreiter voor haar uitstekende technische bijstand en nuttige wijzigingen van het gevestigde cryopreservatie techniek en cel cultuur model. Daarnaast willen we Maren Anders en Swanhild Rodewald bedanken voor hun uitstekende technische bijstand in de daaropvolgende analyse.

Opmerking: Boviene eierstokken werden verkregen uit een commerciële slachthuis. De collectie van abattoir bijproducten is niet vereist voor een ethische goedkeuring volgens de Duitse wet.
1. arbeidsomstandigheden en preparaten
<ol><li>Om te garanderen steriliteit, het uitvoeren van alle media en weefsel voorbereiding evenals alle cultuur werken in een gespecialiseerde cel cultuur lab met behulp van een laminaire flow-bench.</li>
	<li>Bereiden 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4) aangevuld met 100 IU penicilline, 0,1 mg/mL streptomycine en 0,5 µg/µL amfotericine voor het vervoer van de eierstokken. Opmerking: De maximale duur tussen de ontvangst van de eierstokken en het isoleren van de GC is 2 h in deze set-up.</li>
</ol>2. isolatie van boviene Granulosa cellen
<ol><li>
Wassen van de eierstokken meerdere keren in 1 x PBS (met 100 IU penicilline, 0,1 mg/mL streptomycine en 0,5 µg/µL Amfotericine) om bloed uit het oppervlak verwijderen voordat u de isolatie-procedure begint. Gebruik een bekerglas, plaats de eierstokken binnen vullen met 1 x PBS en negeren de PBS opnieuw.
	<ol>
<li>Herhaal deze wassen-stap 3-4 x, totdat de eierstokken zijn gereinigd van alle resterende bloed.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Veeg één eierstok met behulp van een lab-doekje gedrenkt met 70% alcohol, mogelijke verontreinigingen te minimaliseren.</li>
	<li>Gecombineerd met een spuit met 3 mL en een naald 18 G, de GC door prikken van kleine tot middelgrote follikels (< 6 mm, gemeten met een liniaal), en het bundelen van de folliculaire vloeistof in een centrifuge-tube van 50 mL. Opmerking: Om de spuit te bevochtigen, neem een kleine hoeveelheid 1 x PBS (met 100 IU penicilline, 0,1 mg/mL streptomycine en 0,5 µg/µL Amfotericine). Dit helpt bij het verzamelen van kleine hoeveelheden folliculaire vloeistof en voorkomt dat cellen binnen de spuit te steken.</li>
	<li>Na verscheidene follikels prikken, spoel de spuit en de naald met 1 x PBS voor tussentijdse reiniging.</li>
</ol>3. cryopreservatie van cellen
<ol><li>
Gebruik trypan blauw kleuring en tellen de cellen onder een hemocytometer.
	<ol>
<li>Als u wilt tellen het aantal levensvatbare cellen, een buis met 1,5 µL van een 0,25% trypan blauw-oplossing te bereiden. Opmerking: De levende cellen blijft onbevlekt omdat trypan blauw kan alleen toegang krijgen tot de dam van de cel van dode cellen, die vervolgens worden in blauw weergegeven.</li>
		<li>15 µL van de celsuspensie granulosa toevoegen aan de trypan blauwe oplossing en meng ze zachtjes.</li>
		<li>Plaats het mengsel in beide kamers van een hemocytometer. Het aantal levende (b.v., onbevlekt) cellen in één grote plein per kamer. Opmerking: Hoewel sommige bloedcellen kan worden gezien, kunnen ze worden onderscheiden door hun zeer kleine omvang.</li>
		<li>Bereken het aantal levende cellen met het gemiddelde van beide kamer vierkantjes volgens de algemene richtsnoeren; het aandeel van levende cellen kan variëren tussen de eierstokken, maar mag hoger zijn dan 60%13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Neemt een monster uit de pool van de cel vers geïsoleerde granulosa als een referentie voor verdere analyse.
	<ol>
<li>Afhankelijk van de graaf van de cel van de geïsoleerde GC, gereserveerd een voldoende aantal cellen als referentiemonsters voor RNA, DNA of eiwit voorbereiding. Opmerking: Voor RNA isolatie en de latere evaluatie van de genexpressie en 1 x 105 cellen zijn voldoende, terwijl andere latere analyses mogelijk verschillende, over het algemeen hoger cel nummers.</li>
		<li>Plaats één of meerdere aliquots van de verwijzingen naar cellen in een verse buis en Centrifugeer het gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en maximumsnelheid (12.000 x g) te verkrijgen van een cel-pellet. Verwijder het supernatant.</li>
		<li>Onmiddellijk schok-freeze de monsters in vloeibare stikstof. Opslaan van het monster bij-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cryopreservatie als volgt uitvoeren.
	<ol>
<li>Bereiden de bevriezing medium gebruik 80% foetaal kalfsserum (FCS) en 20% dimethylsulfoxide (DMSO).</li>
		<li>Centrifugeer het GC gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en 500 x gom zachtjes pellet GC.</li>
		<li>Verwijder het supernatant zorgvuldig en voorzichtig resuspendeer de cellen in 100% FCS (bijvoorbeeld, 1 mL) tot geen meer cel klontjes zijn zichtbaar.</li>
		<li>1 deel (bijvoorbeeld, 1 mL) van het bereide bevriezing medium aan de celsuspensie toevoegen en het mengsel naar een cryogene flacon overbrengen. Opmerking: De uiteindelijke concentratie van de media cryo-bescherming worden 90% FCS en 10% DMSO.</li>
		<li>Plaats de cryogene ampul in een gespecialiseerde (Los verkrijgbaar) bevriezing container waardoor snelle bevriezing. De koeling van de monsters moet niet meer dan-1 ° C/min. overdracht de bevriezing container in een vriezer-80 ° C gedurende ten minste 4 uur.</li>
		<li>Voor langere opslag, plaatst u de cryogene flesjes in recipiënten van de ultra-lage temperatuur (b.v., vloeibare fase stikstof containers). Opmerking: Het protocol kan gestopt worden hier, als de cryopreservatie langere opslag toelaat.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. voorbereiding op Media en cultuur platen voor de cultuur van de cel
<ol><li>
Cel cultuur platen met 0,02% collageen R. jas Opmerking: Collageen R bekend is essentieel voor een betere bevestiging van GC in cultuur.<ol>
<li>Bereid een 0,02% collageen R oplossing met gezuiverde water geschikt voor cultuur van de cel.</li>
		<li>Voeg 150 µL per putje in een 24-well-plate (= 2 cm2/goed) en ervoor te zorgen dat het hele oppervlak van de cultuur goed met de collageen R-oplossing bedekt is.</li>
		<li>Laat de oplossing met het deksel open voor een paar uur drogen of overnachting in de laminaire flow kap.</li>
		<li>Wanneer de platen van de cultuur volledig droog zijn, bestralen hen met UV-licht voor 10 – 15 minuten tot een minimum beperken van verontreiniging.</li>
		<li>Indien nodig slaan de platen bij 4 ° C voor maximaal 2 maanden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Media en supplementen voor cultuur werk onder de motorkap van een laminaire flow voorbereiden. Voor een succesvol herstel van de DG moeten zij onmiddellijk na het ontdooien worden verwerkt.</li>
	<li>
Voorbereiding van de volgende media.
	<ol>
<li>Α-Minimal essentiële Medium (α-MEM) met 2 mM L-glutamine, 0.084% natriumbicarbonaat, 0,1% bovien serumalbumine (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/mL Natriumseleniet, 5 µg/mL transferrine, 10 ng/mL insuline en 1 mM niet-essentiële aminozuren aanvulling.</li>
		<li>Bovendien, het toevoegen van 100 IU penicilline en 0,1 mg/mL streptomycine aan de media. Opmerking: De antibiotica, eenmaal opgewarmd, zijn stabiel gedurende ongeveer 48 uur. Daarom aliquoot de gewenste hoeveelheid media voor de set-up van de cultuur en geplande wisselen. Vooraf warm alleen de media aliquots tot 37 ° C in een waterbad. De bereid media kan worden achtergelaten bij 4 ° C niet langer dan 3 maanden.</li>
		<li>Om te induceren steroïde activiteit in gekweekte boviene GC, aanvulling van de α-MEM daarnaast met 20 ng/mL follikelstimulerend hormoon (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 en 2 µM androstenedione. Opmerking: Altijd een aanvulling op deze onderdelen kort vóór het intreden van een cultuur of media uitwisseling. Vermijd herhaalde cycli van bevriezen en ontdooien voor FSH en IGF-1 stamoplossingen, omdat dit de steroïde activiteit in gevaar kan brengen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. cel cultuur werk
<ol><li>Ontdooi de cellen snel in een waterbad bij 37 ° C gedurende 3-4 minuten en breng de celsuspensie in 37 ° C voorverwarmde α-MEM (zonder hormoon supplement). Voor centrifugeren, wordt een eindvolume van 10 mL aanbevolen.</li>
	<li>De GC gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en bij 500 x gcentrifugeren. Verwijder het supernatant. Voeg de voorverwarmde en aangevuld α-MEM en resuspendeer de cellen zorgvuldig.</li>
	<li>De GC zaad bij een dichtheid van 1 x 10,5 of 1 x 106 cellen per putje in een eindvolume van 500 µL. omvatten technische replicatieonderzoeken van ten minste drie cultuur wells per voorwaarde.</li>
	<li>Incubeer de celcultuur in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 voor 8 d.</li>
	<li>Het uitvoeren van een media-uitwisseling om de andere dag. Vervang slechts tweederde van de voedingsbodems om stress te verminderen en te vergemakkelijken van de aanpassing van de cellen tot de nieuwe media. Opmerking: De GC vormen een typische fibroblast-achtige fenotype na een paar dagen in de cultuur en de neiging om het cluster samen. In de cultuur van hoge celdichtheid, grotere clusters zijn vaker te vinden ten opzichte van de normale dichtheid GC cultuur (Figuur 1, links versus rechts paneel).</li>
</ol>6. na diverse analyses van gekweekte Granulosa cellen
<ol><li>Steroïde hormoon analyses uit te voeren, het verzamelen van de media en het bevriezen bij-20 ° C. Passende methoden gebruiken voor het analyseren van de concentratie van het estradiol en progesteron in de verbruikte media [bijvoorbeeld radioimmunoanalyse (RIA)]14.</li>
	<li>Voor de daaropvolgende analyse van verschillende doelgroepen moleculen (RNA, DNA, eiwitten, etc.), lyse de cellen rechtstreeks in de cultuur-schotel met een passende lysing agent zoals aanbevolen door de leverancier. Opmerking: Voor de meeste isolatie procedures, het is mogelijk om te stoppen met het protocol hier, zoals de lysed cellen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor maximaal 1 week. Voor langere opslag, dient te worden bewaard in de cellen bij-80 ° C.</li>
	<li>Om te bepalen het transcript overvloed, cDNA synthetiseren en specifieke afschriften meten door kwantitatieve real-time polymerase kettingreactie (qPCR) technieken15. Een statistische evaluatie moet ook ten minste drie replicaties van verschillende celculturen, afkomstig uit verschillende cel preparaten (biologische wordt gerepliceerd).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+antrum+formation+of+bovine+preantral+follicles+in+long-term+culture+in+vitro.">Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).</li><li>Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+luteinizing+hormone+as+a+survival+and+differentiation+factor+increases+oocyte+maturation+in+recombinant+follicle+stimulating+hormone-supplemented+mouse+preantral+follicle+culture.">Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture.</a> Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).</li><li>Paes, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+stress+on+the+survival+and+development+of+in+vitro+cultured+bovine+preantral+follicles+and+on+in+vitro+maturation+of+cumulus-oocyte+complex.">Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex.</a> Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).</li><li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+resource:+preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes.">Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li><li>Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+granulosa+cell+lines.">Ovarian granulosa cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).</li><li>Bernath, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+inhibits+fibronectin+gene+expression+in+a+newly+developed+granulosa+cell+line+by+a+mechanism+that+suppresses+cAMP-responsive+element-dependent+transcriptional+activation.">Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).</li><li>Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+between+freshly+isolated+and+spontaneously+immortalized+bovine+granulosa+cells:+protein+secretion,+steroid+metabolism,+and+responsiveness+to+growth+factors.">Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).</li><li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system:+induction+and+maintenance+of+estradiol+production,+response+to+follicle-+stimulating+hormone,+and+morphological+characteristics.">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).</li><li>Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+maintenance+of+oestradiol+and+immunoreactive+inhibin+production+with+FSH+by+ovine+granulosa+cells+cultured+in+serum-free+media.">Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).</li><li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Oestrogen+Synthesis+-+The+Two-Cell,+Two-+Gonadotrophin+Model+Revisited.">Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).</li><li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro.">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).</li><li>Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+plating+density+alters+the+ratio+of+estrogenic+to+progestagenic+enzyme+gene+expression+in+cultured+granulosa+cells.">Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells.</a> Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells.">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).</li><li>Schneider, F., Br&#252;ssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts.">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).</li><li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+altered+gene+expression+profiles+in+cultured+bovine+granulosa+cells+at+high+cell+density.">Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+promotes+specific+differentiation+in+bovine+granulosa+cells+depending+on+lactate+uptake+thus+mimicking+an+early+post-LH+stage.">Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15 (2018).</li><li>Yenuganti, V. R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+bovine+granulosa+cells+rapidly+lose+important+features+of+their+identity+and+functionality+but+partially+recover+under+long-term+culture+conditions.">Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).</li><li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells.">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li><li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period.">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De gepresenteerde cell cultuur model biedt een instrument om te analyseren granulosa cel differentiatie in vitro. Verschillende studies is gebleken dat een serumvrij teelt een voorwaarde is voor het behoud van steroïde activiteit in gekweekte boviene GC of GC van andere soorten8,9. Daarnaast verbeterd de cultuur schotel met componenten van de extracellulaire matrix (bv, collageen R)13coating, de bevestiging van de cellen aanzienlijk. Een ander belangrijk kenmerk is de periode van langdurige cultuur. Onlangs is gebleken dat een langetermijnkweek noodzakelijk om voldoende steroidogenic activiteit en een evenwichtige uitdrukking van granulosa cel identiteit markers17te verkrijgen is. Het lijkt erop dat GC de tijd nodig om te herstellen van de fysieke belasting tijdens de procedure van de isolatie.
De supplementen van de media FSH, IGF-1 en androstenedione zijn bekend voor het opwekken van aromatase activiteit in gekweekte GC. Vooral de suppletie met androstenedione is absoluut noodzakelijk, als de GC moet een voorloper voor estradiol synthese. Dit is al eerder gepubliceerd11,18 en daarom was niet verder onderzocht tijdens de huidige studie. Een aanpassing van FSH, IGF-1 en androstenedione concentraties kunnen echter nodig voor andere experimentele opstellingen.
De hier beschreven cryopreservatie-techniek kan bijdragen tot verbetering van de organisatie van weefselkweek experimenten doordat ze meer onafhankelijk van het wisselende aanbod met de eierstokken. Volgens eerdere testen, beïnvloedt cryopreservatie niet de GC fenotype of steroïde productie in cultuur. De overvloed van marker afschriften in gekweekte cellen openbaarde ook niet verschillen vergelijken bereid uit vers geïsoleerde cellen met die voorheen onderworpen aan cryopreservatie16monsters.
Een cruciale parameter voor het huidige GC cultuur model is de cel plating dichtheid. Zoals blijkt uit de Resultaten van de vertegenwoordiger, geïnduceerde verhogen van de dichtheid van de beplating opmerkelijke veranderingen van fysiologische en moleculaire kenmerken. Verschillende genen worden geregeld op een specifieke wijze, die lijkt op de veranderingen die zijn geïnduceerd door LH stimulatie in vivo4,19. Het feit dat een toenemende celdichtheid differentiatie-achtige processen in gekweekte boviene GC rijden kan moet zorgvuldig worden beschouwd in dit GC in vitro model om te voorkomen dat tegenstrijdige resultaten tussen wordt gerepliceerd. Daarom tegenstrijdige resultaten met andere studies kunnen worden toegeschreven aan andere cel dichtheden en nauwer moeten worden onderzocht.
Het model van de cultuur beschreven hier bleek te zijn niet-reagerend aan LH, als de transcripties van de receptor LHCGR zijn dicht bij de detectiegrens. Vandaar, een simulatie van de LH-piek zowel de situatie in vivo is mislukt voor het opwekken van differentiatie13. Echter dit model biedt een nuttig hulpmiddel om te bestuderen van estradiol-actieve GC in primaire cultuur, met name als geen functionele boviene GC lijnen bestaan op dit moment.
Verschillende Behandelprotocollen kunnen worden getest in de huidige cultuur model voor GC die helpen te ontrafelen van regulerende mechanismen van steroïde productie of GC differentiatie. Verdere, enkele factoren die bij de ontwikkelings processen betrokken zijn kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd. Daarom is deze cultuur-model biedt een basis voor vele verschillende toepassingen.

Succesvolle ovulatie en luteinization zijn afhankelijk van fijn afgestemd en goed georkestreerde moleculaire veranderingen in verschillende somatische folliculaire celtypes. Omdat de details van deze ontwikkelings processen worden nog niet volledig begrepen, verdere is verduidelijking vereist. In vivo benaderingen zijn uitgebreide en dure en, in het bijzonder niet adres specifieke moleculaire mechanismen die tijdens de folliculogenese optreden. Daarom zijn reductionistische in vitro modellen bovendien nodig om inzicht geven in de cellulaire en moleculaire details. Verschillende studies beschrijven de cultuur van hele follikels in het kader van de in vitro fertilisatie technieken1,2,3. Omdat onderzoekers ook geïnteresseerd in de mechanismen van differentiatie zijn, richten veel studies op folliculaire GC. Deze cellen, die rechtstreeks verband houden met de oöcyt, zijn de belangrijkste bronnen van oestrogeen productie en dus spelen een essentiële rol in de gehele folliculogenese en luteinization4.
Vereeuwigd cel lijnen van GC hebben ontwikkeld van verschillende diersoorten. De meeste van hen, vertonen echter geen een voldoende steroïde hormoon productie5. Tot nu toe slechts één cel van runderen die GC is vastgesteld6, maar deze lijn verloor zijn steroidogenic activiteit na verscheidene passages7. Daarom sinds steroidogenesis en, in het bijzonder, estradiol productie is een wezenlijk kenmerk van GC functionaliteit, is het raadzaam om deze aspecten in de primaire cel cultuur modellen bestuderen. In eerdere studies, werd aangetoond dat een aanzienlijke estradiol productie kan alleen worden waargenomen onder serumvrij cultuur voorwaarden8,9. Verder is, de suppletie van een voorloper van estradiol synthese een andere voorwaarde, zoals GC nalaten de nodige enzym dat progesteron in androstenedione10 omzetten kuntkenbaar. Bovendien bleek het synergetische effect van FSH en IGF-1 suppletie in vitro een geoptimaliseerde activiteit van aromatase, het sleutelenzym van estradiol synthese11. In het huidige protocol, worden ook andere belangrijke factoren die een aanzienlijke invloed op de GC cultuur model hebben beschreven. In het bijzonder heeft de cel plating dichtheid enorme gevolgen voor de resultaten van het experiment12. Bovendien, een techniek cryopreservatie van boviene GC die niet aanzienlijk met GC fysiologie in cultuur interfereert kon worden vastgesteld. Deze techniek helpt om de werkorganisatie cel cultuur en voor het optimaliseren van de voorkeur plating-dichtheid.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 182-05</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin (250 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2612</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe (Omnifix Luer)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>Roth</td>
			<td>C724.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-preservation vials (2 ml)</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 89020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX cell freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture dish, 24-well, flat bottom</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen R (0.2 %)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>F 0915</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin (200 mM)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1713</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1603</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin (10 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0516</td>
			<td>dissolved in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEA</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0293</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4021</td>
			<td>we prefer to use a stock solution of 2 &#181;g/ml, diluted in 0.9 % NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR3-IGF-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1146</td>
			<td>we use a stock solution of 2 &#181;g/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>androstenedione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46033</td>
			<td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

Ovariële granulosa cellen (GC) zijn de voornaamste bron van estradiol synthese. Geïnduceerd door de preovulatory luteïniserend hormoon (LH)-schommeling, cellen van de theca en, in het bijzonder de cellaag granulosa diep wijzigen hun morfologische, fysiologische en moleculaire kenmerken en vormen de progesteron-producerende corpus luteum die verantwoordelijk is voor het behoud van de zwangerschap. Cel cultuur modellen zijn essentiële instrumenten om te bestuderen van de onderliggende regulerende mechanismen betrokken bij de folliculo-luteale transformatie. Het gepresenteerde protocol richt zich op de isolatie procedure en cryopreservatie van boviene GC van kleine tot middelgrote follikels (< 6 mm). Met deze techniek, kan een bijna pure bevolking van GC worden verkregen. De cryopreservatie procedure vergemakkelijkt aanzienlijk tijd beheer van de cultuur van de cel werken onafhankelijk van een directe primaire weefsel (eierstokken) levering. Dit protocol beschrijft een serumvrij cel cultuur model dat de estradiol-actieve status van boviene GC nabootst. Belangrijke voorwaarden die essentieel voor een cultuur van de succesvolle steroïde-actieve cel zijn worden besproken in het gehele protocol. Het is aangetoond dat verhoging van de dichtheid van de beplating van de cellen een specifieke reactie, induceert zoals aangegeven door een veranderd gen expressie profiel en hormoon productie. Bovendien biedt dit model een basis voor verdere studies op GC differentiatie en andere toepassingen.

GC uitplaten aan 1 x 105 cellen/well display een typische fibroblast-achtige verschijning als zij een cel extensie vergelijkbaar met fibroblasten vormen en neiging op te bouwen van clusters (Figuur 1a en 1 c). Verhogen van de dichtheid van de beplating door 10-fold tot en met 1 x 106 cellen per putje veranderde niet de morfologie maar meer cel clusters kunnen worden waargenomen (Figuur 1b en 1 d, pijlen). Zoals al in een eerdere publicatie verbeterd de collageen-coating van de gerechten van de cultuur grotendeels de bevestiging van de cellen13.
Eerste cryopreservatie veranderde niet aanzienlijk de fysiologische kenmerken van cellen in cultuur ten opzichte van die rechtstreeks gekweekt uit vers geïsoleerde monsters. Dit is weergegeven in Figuur 2 als de overvloed van de chat-kopie (gemeten door qPCR) van diverse marker genen niet verschillen wanneer het vergelijken van gekweekte cellen afgeleid van bevroren of vers geïsoleerde zwembaden.
Figuur 3 toont representatieve resultaten van de analyse van de steroïde hormoon (gemeten door RIA) in runderen GC gekweekt bij normale vs. hoge dichtheid. De concentratie van estradiol is sterk gedaald in de high-density cultuur ten opzichte van de normale dichtheid cultuur, overwegende dat de productie van progesteron het algemeen hoger.
Een vergelijkende analyse van verschillende genen (gemeten door qPCR) in hoog - vs. normaal-dichtheid culturen bleek een significant effect (Figuur 4). CYP19A1, codering het sleutelenzym van estradiol biosynthese aromatase, evenals de gonadotrofinen receptor FSHR, werden aanzienlijk naar beneden-geregeld. Daarentegen toonde de genen RGS2 en VNN2 een belangrijke up-verordening. Deze resultaten suggereren duidelijk dat bepaalde processen van celdifferentiatie worden veroorzaakt doordat de cel plating dichtheid.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> Figuur 1: gekweekte boviene granulosa cellen op normaal (linker panelen) en hoge celdichtheid (juiste panelen). (en c) cellen gekweekt bij een dichtheid van 1 x 105 cellen/well weergegeven een typische fibroblast-achtige fenotype. (b en d) GC gekweekt bij een hoge plating dichtheid (1 x 106 cellen/well) de neiging om grote cel clusters (pijlen) vormen steeds vaker in vergelijking met cellen onder een normale dichtheid (linkerdeel). Schaal bars = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> Afbeelding 2: vergelijking van cellen gekweekt direct na isolatie en cryopreservatie. De cellen werden gekweekt bij een dichtheid van 1 x 105 cellen per putje. De genexpressie van diverse marker afschriften werd geëvalueerd en bleek geen verschil tussen gekweekte cellen met of zonder een aanvankelijke cryopreservatie. De boxplot toont de mediaan van n = 3. Tweezijdige Student t-test, de p-waarden zijn opgenomen. Dit cijfer is gereproduceerd van Baufeld en Vanselow16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> Figuur 3: steroïde hormoon concentratie in granulosa cellen gekweekt op verschillende plating dichtheden. De concentratie van estradiol (E2) aanzienlijk afgenomen wanneer GC werden gekweekt op een hoge celdichtheid, overwegende dat de concentratie van progesteron (P4) alleen het algemeen hoger. De hormoon-concentratie werd gecorrigeerd voor de DNA-inhoud te normaliseren voor verschillende cel nummers. Het gemiddelde en de SEM van n = 3 worden weergegeven. p > 0,05, tweezijdige Student t-test. Dit cijfer is gereproduceerd van Baufeld et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> Figuur 4: Overvloed van functionele belangrijke afschriften in granulosa cellen gekweekt op een normale vs. de dichtheid van een hoge plating. Boviene GC gekweekt in serumvrij omstandigheden voor 8 d bleek een specifieke verordening van verschillende geselecteerde markers. De boxplot geeft de mediaan van n = 3 individuele replicatieonderzoeken. p < 0,05, tweezijdige Student t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Een lange termijn model van de cultuur van boviene granulosa cellen onder voorwaarden serumvrij wordt beschreven. Met dit model kunnen onderzoekers aan het bestuderen van de effecten van verschillende factoren en voorwaarden als verschillende plating dichtheden over de kenmerken van het oestrogeen-producerende boviene granulosa cellen.

Een weefselkweek Model van primaire boviene Granulosa oestrogeen-producerende cellen

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Cultuur van primaire menselijke eileider epitheelcellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolatie en Cultuur van de Muis Primaire Pancreatic Acinaire Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

Primaire cultuur van Rat Adrenocortical cellen en testen van Steroidogenic functies

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Een ex vivo weefselkweek model van kraakbeen remodellering in boviene knie Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Weefsel collectie van vleermuizen voor-omics analyses en primaire celcultuur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Isolatie en cultuur van primaire aorta-endotheel cellen van miniatuur varkens

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Apoptosis inductie en detectie in een primaire cultuur van zee komkommer darmcellen

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...