Name: a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells
Uploaded: 2018-09-06T14:00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

אנו מודים ורוניקה Schreiter על סיוע טכני מעולה שלה והשינויים מועיל של הקפאה קריוגנית הוקמה טכניקה ותא תרבות המודל. בנוסף, אנחנו רוצה להודות אנדרס Maren, Swanhild Rodewald לסיוע טכני מעולה שלהם בניתוח עוקבות.

הערה: השחלות שור התקבלו מהמשחטה מסחרי. האוסף של תוצרי לוואי מטבחיים אינו דורש אישור מוסרי לפי החוק הגרמני.
1. עובד ההכנות ותנאים
<ol><li>כדי להבטיח עקרות, לבצע כל המדיה, רקמות הכנה, כמו גם כל תרבות לעבוד במעבדה התרבות תאים מיוחדים באמצעות ספסל זרימה שכבתית.</li>
	<li>להכין 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS, pH 7.4) בתוספת 100 IU פניצילין, סטרפטומיצין 0.1 מ"ג/מ"ל ו- 0.5 שהוא גוסס µg/µL עבור הובלה של השחלות. הערה: משך הזמן המקסימלי בין קבלת השחלות אנליטית GC הוא 2 ש ח בחודש זה.</li>
</ol>2. בידוד תאי Granulosa שור
<ol><li>
לשטוף את השחלות מספר פעמים ב- PBS 1 x (עם 100 IU פניצילין, סטרפטומיצין 0.1 מ"ג/מ"ל ו 0.5 שהוא גוסס µg/µL) כדי להסיר דם מפני השטח לפני תחילת ההליך בידוד. השתמש גביע, למקם את השחלות בפנים, למלא אותו PBS 1 x ולאחר למחוק את PBS שוב.
	<ol>
<li>חזור על שלב זה כביסה 3-4 x, עד השחלות מנוקים הדם הנותרים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נגב שחלה אחת באמצעות מגבון מעבדה ספוג עם אלכוהול 70%, כדי למזער את מציג אפשרי.</li>
	<li>עם מזרק 3 מ"ל, עם מחט 18 גרם, תשאף GC מאת ניקב זקיקים קטן-בינוני (< 6 מ מ, נמדד עם סרגל), ואת מאגר הזקיקים נוזל בצינור צנטריפוגה אחד 50 מ ל. הערה: כדי להרטיב את המזרק, לקחת כמות קטנה של PBS 1 x (עם 100 IU פניצילין, סטרפטומיצין 0.1 מ"ג/מ"ל ו 0.5 שהוא גוסס µg/µL). זה עוזר כדי לאסוף כמויות קטנות של נוזל הזקיקים ומונעת התאים נשארים בתוך המזרק.</li>
	<li>לאחר ניקב מספר זקיקים, לשטוף את המזרק ואת המחט עם 1 x PBS לניקוי ביניים.</li>
</ol>3. הקפאה קריוגנית של תאים
<ol><li>
השתמש trypan blue מכתים, לספור את התאים תחת hemocytometer.
	<ol>
<li>כדי לספור את מספר התאים קיימא, הכן צינור עם 1.5 µL של פתרון trypan blue 0.25%. הערה: התאים החיים יישאר וללא רבב בגלל trypan blue יכול רק גישה המכשול תא של תאים מתים, אשר לאחר מכן יופיעו כחול.</li>
		<li>להוסיף µL 15 של התליה תא granulosa הפתרון trypan blue ומערבבים אותם בעדינות.</li>
		<li>מקם את התערובת שתי לשכות hemocytometer. לספור את מספר החיים (למשל, מוכתם) תאים ריבוע גדול אחד לכל תא. הערה: אמנם ניתן לראות כמה תאי דם, הם ניתן לזיהוי על ידי גודלם קטן מאוד.</li>
		<li>לחשב את מספר התאים החיים עם הממוצע של שני ריבועים קאמרית על פי הנחיות כלליות; היחס של תאים חיים יכול להשתנות בין השחלות אך יעלה 60%13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לקחת דגימה מן הבריכה תא מבודד טרי granulosa כנקודת התייחסות לצורך ניתוח נוסף.
	<ol>
<li>בהתאם הרוזן תא מבודד GC, להפריש מספר מתאים של תאים כמו דוגמיות RNA, דנ א או חלבון הכנה. הערה: עבור בידוד RNA והערכת עוקבות בביטוי הגן, עונה 1 פרק 105 תאים מספיקים, ואילו אחרים ניתוחים הבאים עשויים לדרוש מספרים שונים, בדרך כלל גבוה יותר תא.</li>
		<li>במקום אחד או כמה aliquots של התאים התייחסות בצינור טריים, centrifuge זה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, המהירות המרבית (12,000 x g) כדי להשיג גלולה התא. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>מיד הלם-הקפאת הדגימות של חנקן נוזלי. חנות הדוגמה ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לבצע את הקפאה קריוגנית כדלקמן.
	<ol>
<li>להכין את המדיום הקפאה באמצעות נסיוב עגל העובר 80% (FCS) ו- 20% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד).</li>
		<li>על מנת בעדינות הצניפה GC, centrifuge GC למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, x 500 g.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע בזהירות, בעדינות resuspend התאים ב- FCS 100% (למשל, 1 מ"ל) עד פלאפון יותר גושים גלויים.</li>
		<li>להוסיף 1 נפח (למשל, 1 מ"ל) של המדיום קפוא מוכן התליה תא ולהעביר את התערובת ל בקבוקון ההקפאה. הערה: הריכוז הסופי של התקשורת הגנה על הקפאה יהיה דימתיל סולפוקסיד FCS ו-10%-90%.</li>
		<li>הכנס את המבחנה קריוגני מיכל הקפאה (זמינים מסחרית) מיוחדים, שמונעת הקפאה מהירה. קצב הקירור הדגימות לא יעלה-1 ° C/הגבלת העברת המכולה מקפיא בפריזר-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות.</li>
		<li>לאחסון ארוך יותר, מקם את הבקבוקונים קריוגני במיכלים טמפרטורה נמוכה במיוחד (למשל, מיכלי חנקן נוזלי שלב). הערה: הפרוטוקול ניתן לעצור כאן, כמו הקפאה קריוגנית מאפשר אחסון ארוך יותר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הכנה של תקשורת, תרבות צלחות התרבות התא
<ol><li>
המעיל תא תרבות צלחות עם קולגן 0.02% R. הערה: קולגן R ידוע חיונית בשביל להודעת משופרת של GC בתרבות.<ol>
<li>להכין פתרון 0.02% R קולגן עם מים מורתחים מתאים תרבית תאים.</li>
		<li>להוסיף 150 µL לכל טוב לתוך צלחת 24-טוב (= 2 ס מ2/טוב) ולוודא כי פני התרבות טוב מכוסה עם הפתרון קולגן R.</li>
		<li>תן פתרון יבש עם מכסה פתוח לכמה שעות או למשך הלילה בשכונה זרימה שכבתית.</li>
		<li>כאשר הלוחות תרבות יבש לחלוטין, להאיר אותם באור UV למשך 10-15 דקות למזער את הזיהום.</li>
		<li>במידת הצורך, לאחסן את הצלחות ב 4 ° C עד 2 חודשים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין מדיה ותוספי עבור תרבות העבודה במסגרת תא למינארי. להחלמה מוצלחת של GC, יש להם יעובדו מיד לאחר מפשיר.</li>
	<li>
להכין את המדיה הבאים.
	<ol>
<li>תוספת בינוני חיוני α-מינימלי (α-מ) עם 2 מ מגלוטמין 0.084% סודיום ביקרבונט, 0.1% אלבומין שור (BSA), 20 מ מ HEPES, 4 ננוגרם למ"ל סודיום סלניט, 5 transferrin µg/mL, 10 ננוגרם למ"ל אינסולין, חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1 מ מ.</li>
		<li>בנוסף, להוסיף סטרפטומיצין פניצילין ו- 0.1 מ"ג/מ"ל 100 IU למדיה. הערה: האנטיביוטיקה, פעם להתחמם, יציבים עבור-48 שעות. לכן, aliquot הכמות הרצויה של המדיה עבור הסידור תרבות ומדיה המתוכנן להחליף. לחמם רק את המדיה aliquots עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים. ניתן לאחסן את המדיה מוכן ב 4 ° C לא יותר מ- 3 חודשים.</li>
		<li>כדי לגרום לפעילות סטרואידים הם אורגניים GC שור, תוספת של α-מ בנוסף עם 20 ng/mL הורמון מגרה זקיק (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 ו- 2 מיקרומטר androstenedione. הערה: תמיד תוספת רכיבים אלה זמן קצר לפני תחילתה של החלפת תרבות או מדיה. הימנע חוזרות מחזורים ההקפאה-הפשרה לפתרונות מניות FSH ו- IGF-1, כמו זה מסכן את הפעילות סטרואידים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. תא תרבות עבודה
<ol><li>להפשיר את התאים במהירות בתוך אמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3-4 דקות, להעביר התליה תא מראש ומחוממת 37 ° C α-מ (ללא תוספת הורמון). צנטריפוגה, מומלץ נפח סופי של 10 מ"ל.</li>
	<li>Centrifuge GC למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר ולא ב 500 x g. למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף מראש ומחוממת, שהושלם α-מ, resuspend את התאים בזהירות.</li>
	<li>זרעי GC-צפיפות של עונה 1 פרק 105 או עונה 1 פרק 106 תאים לכל טוב נפח סופי של 500 µL. כוללים משכפל טכני לפחות שלוש בארות תרבות לכל תנאי.</li>
	<li>דגירה התרבות תאים בתוך אינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור 8 קבוצו.</li>
	<li>לבצע החלפת מדיה בכל יום אחר. להחליף רק שני שלישים של תרבות המדיה כדי להפחית את הלחץ וכדי להקל את העיבוד של התאים למדיה טריים. הערה: GC יוצרים פנוטיפ פיברובלסט דמוי אופייני אחרי כמה ימים בתרבות, נוטים אשכול ביחד. בתרבות תא-צפיפות גבוהה, אשכולות גדולים נמצאים בתדירות גבוהה יותר לעומת התרבות נורמלי צפיפות GC (איור 1, שמאל לעומת לוח נכון).</li>
</ol>6. לא חשפה Granulosa בתרבית תאים
<ol><li>כדי לבצע ניתוח הורמונים סטרואידים, לאסוף את המדיה תקפיא את זה ב-20 ° C. השתמש שיטות המתאימות כדי לנתח את הריכוז אסטרדיול ופרוגסטרון ב בילה מדיה [למשל, רדיו אימונולוגי (RIA)]14.</li>
	<li>לניתוח עוקבות של מולקולות יעד אחר (RNA, DNA, חלבונים, וכו '), lyse התאים ישירות לתוך המנה תרבות עם סוכן lysing המתאים כפי שהומלץ על ידי הספק. הערה: עבור רוב ההליכים בידוד, אפשרי לעצור את הפרוטוקול פה, כמו התאים lysed שניתן לאחסן ב-20 ° C עד 1 לשבוע. לאחסון ארוך יותר, יש לשמור את התאים ב- 80 ° c</li>
	<li>כדי לקבוע את השפע התעתיק, לסנתז cDNA ומדידת תעתיקים ספציפיים על-ידי טכניקות כמותיות פולימראז בזמן אמת תגובת שרשרת (qPCR)15. הערכה סטטיסטית צריך לכלול לפחות שלושה שכפולי של תרביות תאים שונים, שמקורם תאים שונים ההכנות (משכפל ביולוגי).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+antrum+formation+of+bovine+preantral+follicles+in+long-term+culture+in+vitro.">Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).</li><li>Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+luteinizing+hormone+as+a+survival+and+differentiation+factor+increases+oocyte+maturation+in+recombinant+follicle+stimulating+hormone-supplemented+mouse+preantral+follicle+culture.">Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture.</a> Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).</li><li>Paes, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+stress+on+the+survival+and+development+of+in+vitro+cultured+bovine+preantral+follicles+and+on+in+vitro+maturation+of+cumulus-oocyte+complex.">Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex.</a> Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).</li><li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+resource:+preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes.">Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li><li>Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+granulosa+cell+lines.">Ovarian granulosa cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).</li><li>Bernath, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+inhibits+fibronectin+gene+expression+in+a+newly+developed+granulosa+cell+line+by+a+mechanism+that+suppresses+cAMP-responsive+element-dependent+transcriptional+activation.">Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).</li><li>Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+between+freshly+isolated+and+spontaneously+immortalized+bovine+granulosa+cells:+protein+secretion,+steroid+metabolism,+and+responsiveness+to+growth+factors.">Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).</li><li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system:+induction+and+maintenance+of+estradiol+production,+response+to+follicle-+stimulating+hormone,+and+morphological+characteristics.">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).</li><li>Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+maintenance+of+oestradiol+and+immunoreactive+inhibin+production+with+FSH+by+ovine+granulosa+cells+cultured+in+serum-free+media.">Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).</li><li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Oestrogen+Synthesis+-+The+Two-Cell,+Two-+Gonadotrophin+Model+Revisited.">Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).</li><li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro.">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).</li><li>Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+plating+density+alters+the+ratio+of+estrogenic+to+progestagenic+enzyme+gene+expression+in+cultured+granulosa+cells.">Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells.</a> Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells.">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).</li><li>Schneider, F., Br&#252;ssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts.">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).</li><li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+altered+gene+expression+profiles+in+cultured+bovine+granulosa+cells+at+high+cell+density.">Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+promotes+specific+differentiation+in+bovine+granulosa+cells+depending+on+lactate+uptake+thus+mimicking+an+early+post-LH+stage.">Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15 (2018).</li><li>Yenuganti, V. R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+bovine+granulosa+cells+rapidly+lose+important+features+of+their+identity+and+functionality+but+partially+recover+under+long-term+culture+conditions.">Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).</li><li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells.">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li><li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period.">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

המודל התרבות התא שהוצגו מספקת כלי לניתוח granulosa תא בידול חוץ גופית בתוך. מספר מחקרים הראו כי הטיפוח-תרגול ללא סרום הוא תנאי הכרחי לשמירה על פעילות סטרואידים הם אורגניים GC שור או GC של מינים אחרים,8,9. בנוסף, ציפוי המנה תרבות עם רכיבים של מטריצה חוץ-תאית (למשל, קולגן R)13, שיפור ההחזקה של התאים באופן משמעותי. תכונה חשובה נוספת היא תקופת תרבות ממושך. . לאחרונה, זה הוכח כי תרבות לטווח ארוך יש צורך לקבל ביטוי מאוזן של granulosa תא זהות סמני17ופעילות שחלת בקר מספקת. נראה כי GC דורשים את הזמן כדי להתאושש מן הלחץ הפיזי במהלך ההליך בידוד.
תוספי מדיה FSH, IGF-1 ו androstenedione ידועים לזירוז פעילות ארומטאז תרבותי GC. במיוחד, תוספי עם androstenedione הכרחי לחלוטין, כמו GC הצורך הקדמה אסטרדיול סינתזה. זה כבר פורסם בעבר11,18 ו, לכן, לא עוד יותר נחקר במהלך המחקר הנוכחי. עם זאת, עיבוד של FSH, IGF-1, ובתמצית androstenedione ייתכן שיהיה צורך אחרים set-ups ניסיוני.
הקפאה קריוגנית בטכניקה המתוארת כאן יכול לעזור לשפר את הארגון של תרביות רקמה ניסויים על ידי הפיכתם עצמאית יותר מן ההיצע בדרגות שונות עם השחלות. על פי בדיקות קודמות, הקפאה קריוגנית אינה משפיעה על פנוטיפ GC או ייצור הסטרואידים בתרבות. כמו כן, השפע של סמן תעתיקים בתאים בתרבית לא חשפו הבדלים משמעותיים השוואת דוגמיות מקריסטלים של תאים בודדים טרי עם אלה נתון בעבר הקפאה קריוגנית16.
פרמטר קריטי עבור המודל הנוכחי של תרבות GC הוא התא יופיצ צפיפות. כפי שמוצג על ידי נציג תוצאות, הגדלת הצפיפות ציפוי המושרה שינויים יוצא דופן של מאפיינים פיזיולוגיים ומולקולרית. מספר גנים מוסדרים באופן ספציפי, הדומה השינויים הם המושרה על ידי גירוי LH ויוו4,19. העובדה כי צפיפות גדל והולך התא יכול לנהוג דמוי-התמיינות תהליכים ב- GC שור בתרבית צריך להיחשב בקפידה במודל זה GC במבחנה כדי למנוע תוצאות סותרות בין משכפל. לכן, תוצאות סותרות עם מחקרים אחרים ייתכן ולשייך צפיפויות תאים שונים, יש לבחון מקרוב יותר.
המודל התרבות המתואר כאן מתגלה כי שאינם מגיבים LH, כמו התמלילים של הקולטן LHCGR נמצאים בקרבת הגבול זיהוי. לפיכך, סימולציה של גל LH כאחד המצב ויוו נכשל לזירוז בידול13. בכל זאת, מודל זה מספק כלי שימושי ללמוד GC אסטרדיול-פעיל בתרבות העיקרי, בפרט כמו לא פונקציונלי-שור GC שורות קיימות כיום.
פרוטוקולי טיפול שונה יכול להיבדק במודל תרבות נוכח GC לעזור לפענח את מנגנוני הרגולציה של ייצור סטרואידים או בידול GC. גורמים נוספים, אחד המעורבים בתהליכים התפתחותיים יכול להיות מנותח בנפרד. לכן, מודל זה תרבות מספק בסיס עבור יישומים שונים רבים.

ביוץ מוצלחת ואת luteinization תלוי שינויים מולקולריים דק מכוון, מתוזמר היטב סוגי התאים הזקיקים סומאטית. מאז פרטים של תהליכים התפתחותיים אלה אינם עדיין לגמרי מובנים, עוד יותר להבהרה נדרש. In vivo גישות משוכללות ויקרות, בפרט, להיכשל כתובת המנגנונים המולקולריים ספציפיות המתרחשות במהלך folliculogenesis. לכן, מודלים reductionistic במבחנה נדרשים בנוסף, כדי לספק תובנות פרטים תאית ומולקולרית. מחקרים שונים מתארים את התרבות של כל זקיקי בהקשר של במבחנה הפריה טכניקות1,2,3. כי החוקרים מעוניינים מנגנונים של בידול, מחקרים רבים מתמקדים GC הזקיקים. תאים אלה, הקשורים ישירות oocyte, הם המקורות העיקריים של ייצור אסטרוגן, לכן, תפקיד חיוני בכל רחבי folliculogenesis ו- luteinization4.
מונצחים תא שורות של GC פותחו זנים שונים. עם זאת, רובם, אינם מראים ייצור הורמונים סטרואידים מספיקות5. עד כה, תא אחד בלבד שורה של שור ש-GC כבר הקים6, אך הקו הזה איבד את פעילותה שחלת בקר לאחר קטעים מספר7. לכן, מאז steroidogenesis, ובעיקר, אסטרדיול הפקה היא תכונה חיונית הפונקציונליות GC, מומלץ ללמוד היבטים אלה במודלים התרבות התא הראשי. במחקרים קודמים, הוכח כי הפקה אסטרדיול ניכר יכול רק להיות שנצפו תחת תרבות סרום ללא תנאים8,9. בהמשך, תוספת של הסימן המקדים של אסטרדיול סינתזה היא תנאי הכרחי נוסף, כפי GC להיכשל להביע את האנזים הנחוץ ניתן להמיר androstenedione10פרוגסטרון. בנוסף, אפקט סינרגיסטי של FSH ו- IGF-1 תוספי במבחנה חשף פעילות אופטימיזציה של ארומטאז, האנזים מפתח של אסטרדיול סינתזה11. בפרוטוקול הנוכחי, מתוארים גם גורמים חשובים אחרים, שיש להם השפעה משמעותית על המודל התרבות GC. בפרט, התא יופיצ צפיפות יש השפעות עצומה על התוצאה של ניסוי12. יתר על כן, יכול להקים טכניקה הקפאה קריוגנית של GC שור זה אינם מתערבים באופן משמעותי GC פיזיולוגיה בתרבות. טכניקה זו מסייעת לשפר את הארגון של התא תרבות עבודה כדי למטב את הצפיפות ציפוי המועדפת.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 182-05</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin (250 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2612</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe (Omnifix Luer)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>Roth</td>
			<td>C724.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-preservation vials (2 ml)</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 89020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX cell freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture dish, 24-well, flat bottom</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen R (0.2 %)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>F 0915</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin (200 mM)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1713</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1603</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin (10 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0516</td>
			<td>dissolved in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEA</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0293</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4021</td>
			<td>we prefer to use a stock solution of 2 &#181;g/ml, diluted in 0.9 % NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR3-IGF-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1146</td>
			<td>we use a stock solution of 2 &#181;g/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>androstenedione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46033</td>
			<td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

תאים granulosa השחלות (GC) הם המקור העיקרי של אסטרדיול סינתזה. המושרה על ידי גל הורמון מחלמן preovulatory (LH), תאי theca את, בפרט, granulosa תא השכבה עמוקות לשנות מאפיינים מורפולוגיים, הפיזיולוגית המולקולרי שלהם ויוצרים הקורפוס ייצור פרוגסטרון התשובה כי הוא אחראי על שמירת הריון. תא תרבות הן כלי חיוני ללמוד את מנגנוני הרגולציה כבסיס מעורב הטרנספורמציה folliculo-luteal. פרוטוקול הציג מתמקד הליך הבידוד של הקפאה קריוגנית של שור GC של זקיקים קטן-בינוני (< 6 מ מ). בטכניקה זו, ניתן להשיג אוכלוסיה טהור של GC. ההליך הקפאה קריוגנית מאוד מקל זמן ניהול של התרבות תאים לעבודה עצמאית של היצע רקמות (השחלות) ישיר הראשי. פרוטוקול זה מתאר תרבות ללא סרום תא מודל המחקה את מצב פעיל אסטרדיול GC שור. תנאים חשובים כי הם חיוניים עבור תרבות מוצלח תא סטרואידים-פעילה הם דנו לאורך כל הפרוטוקול. הוכח כי הגדלת הצפיפות ציפוי של התאים גורם לתגובה ספציפית כמצוין על-ידי פרופיל ביטוי וייצור הורמונים ג'ין שינו. יתר על כן, מודל זה מספק בסיס ללימודי ב- GC בידול ויישומים אחרים.

GC מצופה-עונה 1 פרק 105 תאים/טוב התצוגה מראה דמוי פיברובלסט אופייני כפי שהם יוצרים סיומת תא להשוות fibroblasts נוטים לבנות אשכולות (איור 1a וג 1). הגדלת צפיפות ציפוי על ידי 10-fold עונה 1 פרק 106 תאים/טוב לא שינתה את המורפולוגיה אבל יכול להיות שנצפו אשכולות תאים נוספים (איור 1b ו- 1 י, חצים). כפי שמוצג כבר בפרסום הקודם, הציפוי קולגן של מאכלים תרבות השתפר במידה רבה ההחזקה של תאים13.
הקפאה קריוגנית הראשונית לא השתנה במידה ניכרת מאפיינים פיזיולוגיים של תאים בתרבות לעומת הילדים ישירות תרבותי מדגימות טרי מבודד. זה מוצג באיור 2 שפע תעתיק (נמדד על-ידי qPCR) של סמן מספר גנים לא שונות בעת השוואה בין תאים בתרבית נגזר בריכות קפוא או טרי מבודד.
איור 3 מראה תוצאות נציג של ניתוח הורמונים סטרואידים (נמדד על ידי ריאה) ב- GC שור תרבותי-נורמלי לעומת צפיפות גבוהה. ריכוז אסטרדיול יופחתו במידה משמעותית בתרבות בצפיפות גבוהה לעומת התרבות רגיל-צפיפות, ואילו ייצור פרוגסטרון נוטה להיות גבוה יותר.
ניתוח השוואתי של מספר גנים (נמדד על-ידי qPCR) בתרבויות גבוהה לעומת רגיל-צפיפות חשף אפקט משמעותי (איור 4). CYP19A1, קידוד האנזים מפתח של אסטרדיול ביוסינטזה ארומטאז, כמו גם את הקולטן גונדוטרופין FSHR, היו באופן משמעותי למטה מוסדר. לעומת זאת, הגנים RGS2 ו- VNN2 הראו משמעותי למעלה-תקנה. תוצאות אלו מראים בבירור כי תהליכים ספציפיים של התמיינות הם המושרה על ידי הגדלת תא יופיצ צפיפות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> איור 1: תרבותי תאים granulosa שור על רגיל (לוחות שמאלה) וצפיפות גבוהה התא (נכון פאנלים). ( ג) ותאי תרבותי-צפיפות של תאים 1 x 10 5/באר מוצגת הפנוטיפ פיברובלסט דמוי טיפוסי. (b ו- d) GC תרבותי-צפיפות גבוהה ציפוי (1 x 106 תאים/טוב) נטו כדי ליצור תאים גדולים אשכולות (חיצים) בתדירות גבוהה יותר לעומת התאים תחת צפיפות נורמלי (החלונית הימנית). גודל ברים = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> איור 2: השוואה של תאים תרבותי ישירות לאחר בידוד, לאחר הקפאה קריוגנית. התאים היו תרבותי-צפיפות של תאים5 עונה 1 פרק 10 לכל טוב. בביטוי הגן של הפרוטוקולים סמן מספר הוערך וגילה אין הבדל בין תאים בתרבית עם או בלי הקפאה קריוגנית הראשונית. Boxplot מראה את החציון של n = 3. דו-זנבית של סטודנט t-לבדוק, p-ערכים הינם כלולים. איור זה מתרבה מ Baufeld ו- Vanselow16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> איור 3: ריכוז הורמונים סטרואידים בתאים granulosa תרבותי-ציפוי שונים צפיפויות. ריכוז אסטרדיול (E2) ירדה משמעותית כאשר GC היו תרבותי-צפיפות גבוהה תא, ואילו ריכוז הפרוגסטרון (P4) רק נוטה להיות גבוה יותר. ריכוז ההורמון תוקנה עבור התוכן דנ א לנרמל למספרים תאים שונים. מתכוונת ואת SEM של n = 3 מוצגים. 0.05 > p , דו-זנבית של סטודנט t-מבחן. איור זה מתרבה מ. Baufeld et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> איור 4: שפע של הפרוטוקולים מפתח פונקציונלי בתאים granulosa תרבותי-נורמלי לעומת צפיפות גבוהה יופיצ. GC שור תרבותי בתנאים ללא סרום עבור 8 קבוצו חשף תקנה ספציפית של מספר גנים סמן שנבחרו. Boxplot מציגה את החציון של n = 3 משכפל בודדים. p < 0.05, דו-זנבית של סטודנט t-מבחן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

מודל התרבות ארוכת טווח של תאים granulosa שור בתנאים ללא סרום מתואר. מודל זה מאפשר לחוקרים לחקור את ההשפעות של גורמים שונים ותנאים כמו ציפוי שונים צפיפויות על המאפיינים של ייצור אסטרוגן בתאי granulosa שור.

מודל תרביות רקמה של ייצור אסטרוגן Granulosa שור ראשי תאים

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

תרבות העיקרי של תאים Adrenocortical חולדה, מבחני של פונקציות שחלת בקר

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Vivo לשעבר התרבות רקמה מודל של שיפוץ הסחוס של הברך שור בעלי מפעלים

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

אוסף רקמות של עטלפים עבור-ניתוח Omics ותרבות התא הראשוני

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

ואפופטוזיס השראה ואיתור בתרבות העיקרית של מלפפונים בתאי מעיים ים

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...